임상검사와 정도관리：제29권 제2호 2007
J Lab Med Qual Assur 2007 ; 29：207-10 - 종 설 -
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호흡기 바이러스 감염증의 신속 진단
송상훈․김의종
서울대학교 의과대학 검사의학교실
Rapid Diagnosis of Respiratory Virus Infection
Sang Hoon Song and Eui-Chong Kim
Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea
Rapid diagnosis of respiratory virus infection is of vital importance for clinical laboratories to enable physicians and infection control team to start prompt action and to prevent the spread of pathogens. Conventional methods of viral cell culture, immunofluorescence assay are accurate, but time-consuming and labor intensive. Recent advances in molecular techniques give us another options to rapidly identify respiratory viruses. Rapid antigen tests are designed for detection of respiratory syncytial virus or influenza virus. They are the simplest and fastest, but require more sensitive test due to their low sensitivities and negative predictive values. Nucleic acid amplification tests are based on multiplex RT-PCR. They use different target amplification, probing, and signal detection techniques. Five to twenty types of respiratory virus can be simultaneously identified using such methods. Each laboratory should adopt its own strategy for rapid identification and confirmation of respiratory viruses considering turnaround time, sample amount, facilities, and laboratory staffs.
이 연구는 서울대학교병원 정책연구비(과제번호: 04-2003-056)의 지원에 의한 결과임.
교신저자：김의종
우) 110-744 서울시 종로구 연건동 서울대학교병원 진단검사의학과
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서 론
호흡기 바이러스 감염은 사람에게 발생하는 가장 흔한 질환 중의 하나로 영아, 노인, 심폐기능이나 면역기능이 저 하된 환자에서는 후유증을 유발하여 심한 경우 사망에 이를 수 있다. Respiratory syncytial virus (RSV), adeno- virus, influenza virus, parainfluenza virus 등이 흔 하게 동정되며[1] 상기도 및 하기도 감염, 중이염, 뇌염 등 을 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 중증급성호흡기 증후군(SARS) 바이러스, 조류인플루엔자 바이러스, human metapneumovirus 등의 신종 바이러스 감염이 유행하여 전세계적인 관심을 받은 바 있다. 이러한 호흡기 바이러스 감염은 유사한 증상과 징후를 나타내기 때문에 임
상양상만으로는 원인 바이러스를 감별하기 어려운 특징이 있다[2]. 원인 바이러스를 조기에 동정하게 되면 항바이러 스제를 즉시 투여할 수 있고 불필요한 항생제 남용을 예방 할 수 있으며 바이러스의 유행을 조기에 발견하여 즉각적인 감염관리 대책을 수립할 수 있다.
호흡기 바이러스의 동정법은 고식적 세포배양법, shell vial 배양법, 면역형광염색법, 신속항원검출법, 핵산증폭법 등이 있다. 고식적 세포배양법은 여전히 gold standard법 으로 받아들여지고 있는 검사로 세포변성효과(cytopathic effect)를 관찰하여 바이러스의 존재를 확인할 수 있으나 동정하기 위해서는 면역형광염색이나 적혈구흡착(hema- dsorption) 등의 방법을 추가로 실시해야 하며 2-14일의 시간이 소요되는 단점이 있다[3]. 이러한 단점을 개선하기 위해 원심분리를 통해 바이러스의 세포 감염을 향상시킨 shell vial 배양법이 있으나 18-48 시간이 소요되어 신속 동정에는 여전히 한계가 있다. 면역형광법은 단클론성 항체 를 사용하여 민감하고 수시간 이내에 결과를 확인할 수 있 고 동시에 여러 바이러스를 동정할 수 있는 장점이 있으나 숙련된 검사자가 필요하고 검사자에 따라서 재현성이 떨어 질 수 있다. 그 밖에 바이러스에 대한 특이항체를 검출하는 방법으로 중화시험, 보체결합, 적혈구응집억제법 등이 있으
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나 수주의 시간이 걸리고 노동집약적인 단점이 있어서 임상 검사실에서는 거의 실시되고 있지 않다[3].
상기의 단점들을 보완하기 위해 신속항원검사, 핵산증폭 검사 중심으로 신속히 호흡기 바이러스를 동정할 수 있는 방법이 개발되어 소개되고 있다. 이에 최근에 소개되고 있 는 신속동정법들을 고찰하여 효과적인 검사실 운영에 도움 이 되고자 한다.
신속항원검사
신속항원검사는 주로 RSV, influenza virus를 동정하 기 위해 개발되었다. 키트의 종류에 따라 RSV만을 단독으 로 검출하거나 influenza virus만을 단독으로 검출한다.
RSV용 키트에는 NOW RSV (Binax, Portland, ME, USA), Directigen RSV, Directigen EZ RSV (Becton-Dickinson, Sparks, MD, USA), QuickVue RSV (Quidel, San Diego, CA, USA), Xpect RSV (Remel, Lenexa, KS, USA), RSV OIA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 등이 있다. 이 중 NOW와 Directigen은 막에 추출한 검체를 떨어뜨린 후 나타나는 발생반응을 확인하는 소위 immunofiltration 방 식을 사용하는데 Directigen은 몇 가지 시약을 추가로 반 응시킨다는 점이 다르다[4, 5]. QuickVue와 Xpect는 lateral flow immunoassay 방식으로 QuickVue는 추출 한 검체에 면역크로마토그래피 스트립을 담근 후 나타나는 발색반응을 확인하는 방식을 사용한다[2, 6]. Optical immunoassay (OIA) 방식은[7] 박막에 면역복합체가 형 성되어 막이 두꺼워지면 light path가 변하여 다른 색깔을 표현하는 방법을 이용한다. 상기의 키트 모두 nucleo- protein 또는 fusion protein을 검출하는 단클론성 항체를 사용한다.
Influenza virus용 키트는 RSV보다 다양한데 이중 peer-review된 제품들에는 NOW, Directigen, QuickV- ue, Xpect, Flu OIA, ZstatFlu (ZymeTx, Oklahoma, OK, USA) 등이 있다. 대부분 nucleoprotein을 검출하는 데 반해 ZstatFlu의 경우 neuraminidase 활성을 검출하 는 점이 특이하다[8]. 그 외에 Immunocard STAT!
(Meridian Bioscience, Cincinnati, OH, USA), INFLU A․B-Quick (Denka-Seiken, Tokyo, Japan) 등의 제품들이 소개되고 있는데 [9, 10] 거의 대부분이 미 국을 중심으로 하는 외국산 제품인데 반해 국내산 제품으로 SD BIOLINE Influenza Ag (Standard Diagnostics, Yongin, Korea)가 소개된 바 있다[11]. Influenza A만 을 검출할 수 있는 키트, influenza A와 influenza B를 모두 검출하며 감별이 가능한 키트와 그렇지 않은 키트가 있다.
신속항원검출법을 이용한 상기 키트의 수행능은 사용한
표준방법, 검체의 종류, 검체 운송 및 보관 시간, 환자의 연령 등에 따라 다양하게 보고되고 있는데 전반적으로는 특 이도와 양성예측도는 90-100%로 우수하지만 민감도는 40-95%, 음성예측도는 70-90% 정도로 약간 떨어지므로 환자가 많이 발생하는 시기에 사용하기 적합하다[3]. 또한 음성 결과가 나온 경우 면역형광법, 세포배양과 같은 민감 한 방법을 추가로 시행하도록 권장하고 있다. 검체는 비인 두흡인액가 가장 흔히 사용되고 있고 WHO에서도 권장하 고 있지만 비인두세척액, 비강면봉, 비인두면봉, 인후면봉, 기관폐포세척액도 사용되고 있다. 이중 비인두세척액, 비인 두면봉은 신뢰할만 하지만 나머지 검체들은 신뢰도가 떨어 지는 것으로 받아들여지고 있다[12-14]. 사용 가능한 검체 의 종류도 제품마다 약간 다르므로 확인해야 한다. 또한 증 상이 발생한 이후 빠른 시간에 채취한 검체일수록, 신선한 검체일수록 민감도가 증가하는 것으로 알려져 있다[15]. 일 반적으로 성인보다는 소아에서 민감도가 우수한데 이는 소 아의 경우 면역체계가 불완전하여 바이러스의 증식이 활발 히 일어나 분비도 증가하는 것으로 설명하고 있다[2].
이러한 신속항원검출법을 이용한 검사들은 대부분 15-30분 이내에 검사결과를 알 수 있으므로 현장검사로 사 용할 수 있는 가능성을 고려해볼 수 있는데 민감도가 떨어 지는 점, 검체 전처리와 검사 시간이 여전히 상당히 소요된 다는 점에서 바쁜 외래와 병동에서는 사용하기 어렵고 오히 려 임상검사실에서 간편하게 사용하기 적당한 검사라고 할 수 있다[15].
핵산증폭검사
최근에 분자유전학적 방법의 발달로 신속히 호흡기 바이 러스를 동정할 수 있는 방법들이 개발되고 있다.
Adenovirus를 제외한 다른 호흡기 바이러스가 모두 RNA 바이러스이므로 역전사중합효소연쇄반응을 이용하여 동시에 여러 종의 바이러스를 동정하는 방법(multiplex RT PCR)을 많이 사용한다. 바이러스에 따라 특이적인 유전자 를 증폭하기 위한 시발체를 사용하는데 RSV의 nucleo- capsid 유전자, influenza virus의 matrix protein 유전 자, parainfluenza virus의 haemagglutinin 또는 polymerase 유전자, corona virus의 M 유전자 또는 spike protein 유전자, rhinovirus, enterovirus의 VP4/VP2와 5’ noncoding region의 hypervariable region 등이 흔히 사용되는 표적이다[16-18]. 이러한 방법 을 적절히 디자인하면 바이러스의 type/subtype을 감별할 수 있는 장점이 있으며 필요한 경우 nested PCR을 시행 하기도 한다[16]. 초기에는 주로 전기영동을 이용하여 검출 했으나 최근에는 실시간중합효소연쇄반응도 흔히 이용되고 있다[17]. 그 외에 line blot hybridization, DNA chip 을 이용한 방법도 시도되고 있다[18, 19].
호흡기 바이러스 감염증의 신속 진단 209 상용화된 제품으로는 NGEN (Nanogen, San Diego,
CA, USA), ResPlex II (Genaco, Huntsville, AL, USA), MultiCode-PLx respiratory virus panel (EraGen Biosciences, Madison, WI, USA), Seeplex (Seegene, Seoul, Korea) 등이 있으며 나름대로 특화된 기술을 사용한다[20-22]. 3가지 제품 모두 multiplex RT-PCR을 기본으로 하고 있는데 NGEN은 influenza virus A/B, parainfluenza virus 1/2/3, RSV 등 6종의 호흡기 바이러스를 microelectronic microarray로 검출하 는 방식이다. ResPlex II는 influenza virus A/B, parainfluenza virus 1/2/3/4, RSV A/B, human metapneumovirus, rhinovirus, enterovirus, SARS coronavirus 등 12종의 호흡기 바이러스를 liquid phase bead conjugated array (Luminex) 기술로 검출한다 [20]. MultiCode-PLx respiratory virus panel은 17종 의 호흡기 바이러스 검출할 수 있다고 하는데 자연에 존재 하지 않는 iso-guanine (iG)와 5-methyl-iso-cytidine (iC)를 붙인 시발체를 사용하여 증폭하고 target specific extension을 한 후 microsphere flow cytometry로 검출 하는 방식을 사용한다[21]. 국내에서 개발된 Seeplex는 시 발체의 중간에 polydeoxyinosine linker를 삽입하여 시발 체의 비특이적인 결합과 증폭을 현저히 감소시킨 방법 (dual priming oligonucleotide, DPO)을 사용하여 10-13종의 호흡기 바이러스를 한번에 동정할 수 있다. 2%
agarose gel에서 전기영동하여 검출하는데 기존의 시발체 를 사용하는 것보다 훨씬 선명한 밴드를 얻을 수 있고 시발 체의 비특이적인 결합에 의한 위양성을 줄일 수 있다[22].
이러한 핵산증폭검사는 한번의 반응으로 동시에 십여 종 의 호흡기 바이러스를 감별할 수 있을 뿐 아니라 5-8시간 안에 검사 결과를 확인할 수 있다. 또한 세포배양법, 면역 형광염색법과 대등하거나 우수한 수행능을 보이므로 점차 많은 검사실에서 이용이 증가하리라 생각한다. 실제로 여러 종의 호흡기 바이러스를 동시에 검출하는 방법에 관한 문헌 들이 쏟아져 나오고 있으며 감별할 수 있는 바이러스의 종 류도 증가하고 있다. 핵산증폭검사는 신속항원검사에 비해 기술적으로 복잡하고 별도의 장비가 필요하며 turnaround time이 약간 길지만 민감도가 우수하므로 신속항원검사에 서 음성 또는 불분명하거나 검사가 이루어지지 않는 검체에 서 확인 검사로 이용할 수 있다.
호흡기 바이러스는 임상적인 증상만으로는 감별하기 어 려울 뿐만 아니라 influenza, SARS corona virus 등의 치명적인 바이러스의 유행에 대비해야 하므로 각 검사실에 서 검사시간, 임상의 요구, 장비, 인력 등을 고려하여 적절 한 전략을 수립해야 한다. 최근에 개발된 신속항원검사, 핵 산증폭검사를 적절히 활용하면 기존의 세포배양법, 면역형 광염색법보다 쉽고 빠르게 진단하고 동정할 수 있으므로 점 차 그 이용이 증가할 것으로 생각한다.
요 약
임상검사실에서 호흡기 바이러스를 신속히 진단함으로써 임상의와 감염관리팀이 신속하게 조치를 취하고 병원체의 확산을 예방할 수 있다. 세포배양, 면역형광법과 같은 고식 적 방법은 정확하나 시간이 많이 소요되고 노동집약적이다.
최근에는 분자 기법이 발달하여 호흡기 바이러스를 신속하 게 동정할 수 있다. 신속항원검사는 respiratory syncy- tial virus나 influenza virus를 검출하도록 설계되었다.
가장 쉽고 빠른 검사이나 민감도와 음성예측도가 낮아 더욱 민감한 검사가 추가로 필요하다. 핵산증폭검사는 multi- plex RT-PCR을 기본으로 하고 서로 다른 증폭, 표식, 신 호검출 기술을 사용한다. 이러한 방법을 이용하면 동시에 5-20가지의 호흡기 바이러스를 동정할 수 있다. 각 검사실 에서는 소요시간, 검체량, 장비, 검사인력 등을 고려하여 호흡기 바이러스를 신속히 동정하고 확인할 수 있는 전략을 수립해야 한다.
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