Effects in Metabolism and Adipocyte Inflammation Induced by the Complex Herbal Medicine composed of Cornus officinalis, Dioscorea rhizoma, Aurantii fructus, Mori folium in Obese Type 2 Diabetes Mouse Model

Effects in Metabolism and Adipocyte Inflammation Induced by the Complex Herbal Medicine composed of Cornus officinalis, Dioscorea rhizoma, Aurantii fructus, Mori folium in Obese Type 2 Diabetes Mouse

Model

Su-Ryun Han, Sun-Ho Paik, Oh-Jun Kwon, Young-Min Ahn, Byung-Cheol Lee, Se-Young Ahn

Dept. of Internal medicine, College of Oriental Medicine, Kyung Hee University

Objectives: There is a steady increase in the prevalence of obesity worldwide and obesity is often accompanied by inflammation. Although much emphasis has been placed on the adipose tissue inflammation in obesity, a study with herbal medicine is few. This study aimed to investigate the antidiabetic and anti-inflammatory effect of a complex herbal medicine (CHM) composed of Cornus officinalis, Dioscorea rhizoma, Aurantii fructus, and Mori Foliumon on obese type 2 diabetes mice.

Methods: Type 2 diabetes mellitus and obesity were induced by Surwit's high fat, high sucrose diet for 8 weeks.

Mice were divided into ND (normal diet, n=10), HFD (high fat and high sucrose diet, n=10), CHM (high fat and high sucrose diet with complex herbal medicine, n=10) and Met (high fat and high sucrose diet with metformin, n=10) groups. The body weight, fructosamine and OGTT (oral glucose tolerance test) were measured. After 8 weeks the blood samples of all mice were taken from the heart, and lipid profiles were measured. Epididymal fat pad, histological size of the adipocyte tissue and liver weights were measured. Inflammatory markers such as leptin and adipocyte tissue macrophage were measured to evaluate the effect of CHM on adipocyte tissue inflammation.

Results: Compared with the HFD group, there was an improvement in OGTT and epididymal fat decreased in the CHM group. White adipocyte size and adipocyte tissue macrophage decreased in CHM group.

Conclusions: These results suggest that CHM has antidiabetic and anti-inflammatory effects in high fat, high sucrose diet induced obese mice.

Key Words : Cornus officinalis, Dioscorea rhizoma, Aurantii fructus, Mori Folium, Adipocyte tissue macrophage, Obesity

⋅Received：27 July 2012 ⋅Revised：6 September 2012 ⋅Accepted：11 September 2012

⋅Correspondence to：안세영(Se-Young Ahn)

서울특별시 동대문구 회기동 1 경희의료원 부속한방병원 한방 6내과

Tel : +82-2-958-9151, Fax : +82-2-958-9158, E-mail : [email protected]

산수유 산약 지각 상엽으로 구성된 복합처방투여가 고지방, 고탄수화물 식이로 유발된 비만형 당뇨병 동물모델의

대사인자 및 지방세포 염증반응 조절에 미치는 영향

한수련, 백선호, 권오준, 안영민, 이병철, 안세영

Original Article

서 론

전세계적으로 과잉 에너지 섭취와 활동량의 감소 로 인해 비만한 인구는 꾸준히 증가하고 있다. 비만 은 결국 인슐린 저항성, 고혈당, 고혈압, 이상지질혈 증과 함께 발생하여 이를 대사증후군이라고 칭하는 데 이러한 대사증후군이 심혈관계질환의 위험도를 증가시키게 되므로 비만은 임상적으로 매우 중요하 다. 비만 중에서도 특히 중심성 비만이 인슐린 저항 성을 유발하는 가장 큰 요인이며 인슐린 저항성과 더 불어 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포의 파괴까 지 일어나게 되면 제2형 당뇨병이 발병하게 된다¹⁾.

최근의 연구들을 통하여 비만이 인슐린 저항성과 만성 염증상태와 밀접한 관련이 있으며 지방세포를 내분비기관으로 인식하게 되면서 지방세포에서 분비 하는 cytokine들이 그 신호전달에 중요한 역할을 한다 는 사실이 밝혀지고 있다. 비만이 만성염증상태라는 사실은 비만한 상태에서 pro-inflammatory cytokine중 의 하나인 TNF-α의 지방세포에서의 분비가 증가하며 이 상태가 인슐린 저항성을 증가시킨다는 것이 밝혀 지면서부터 연구가 활발히 이루어져왔다²⁾. 그 후에 지방세포에서 분비되는 leptin이라는 cytokine이 음식 섭취와 에너지 균형에 관여한다는 것 등이 밝혀지면 서 지방세포에서 분비되는 cytokine이라는 의미의 adipokine이라는 개념이 정립되었다. 비만한 상태에 서는 지방조직에서 TNF-α나 IL-6와 같은 in- flammatory adipokine의 생성이 증가하는데 이는 지 방 조직의 macrophage의 증가와 동반되어 나타난다³⁾. 지방세포에서 분비되는 adipokine들이 macrophage를 지방 조직으로 침윤하게 만들고 이러한 macrophage 가 염증을 매개하게 되어 결국은 macrophage가 염증 상태와 인슐린 저항성의 주된 원인이 된다고 보아 최 근의 연구들은 macrophage에 초점을 맞추고 있다⁴⁾.

현재까지 당뇨병을 치료하기 위한 여러 가지 약물 이 개발되었지만 만성 염증상태의 개선을 목적으로 개발된 약제는 없었다. 따라서 현재 시점에서 비만과 이로 인하여 발생하는 염증상태를 개선함으로써 인 슐린 저항성을 개선시킬 수 있는 치료제 연구가 필요 하다고 생각되며 본 연구에서는 한의학에서 그 해결 의 실마리를 찾아보고자 한다.

본 연구에서는 산수유 산약 지각 상엽으로 한약

복합처방을 구성하여 실험을 시행하였는데 이 중 산 수유(Cornus officinalis) 산약(Dioscorea rhizoma)과 지각(Aurantii fructus)은 수풍순기환의 분할처방으로 이미 다수의 연구에서 혈당강하의 효과가 입증된 바

있고^5),6),7), 상엽(Mori Folium)또한 인슐린저항성 개선

의 효과가 있다고 알려진 약물이다8)9),10),11)

. 하지만 이 전의 연구들은 한약물의 투여가 혈당강하와 지질개 선에 미치는 효과에 초점을 맞추고 있으며 지방조직 의 염증에 관한 연구는 거의 이루어지지 않았다. 따 라서 이번 연구에서는 위 네 가지 약제로 복합처방을 구성하여 이들을 고지방 고탄수화물 식이로 유발된 비만한 쥐에게 투여하였을 때 쥐들의 체중, 혈당지표, 지질대사이상, 지방의 무게, 지방의 크기, adipokine 중의 하나인 leptin의 농도뿐만 아니라 지방조직의 macrophage의 변화를 모두 살펴보고자 하였다.

연 구 방 법

1. 검체 제조

총량 1,000g씩의 산수유(Cornus officinalis), 산약 (Dioscorea rhizoma), 지각(Aurantii fructus), 상엽 (Mori Folium)을 각각 1,500㎖의 80% 에탄올에 넣고 heating mantle을 이용하여 2시간 동안 가열 추출하고 여과한 여액을 500㎖ 플라스크에 applicator를 이용하 여 넣은 후 filter로 걸러냈다. 걸러진 여과액을 Rotary evaporator(Model NE-1, 東京理化學株式會社, Japan) 로 감압 농축한 후 동결건조기(Model FD-1, 東京理化 學株式會社, Japan)로 건조시켰다. 동결 건조된 산수 유, 산약, 지각, 상엽 1차 추출물을 1:1:1:1의 비율로 혼합하여 실온에서 보관하였다. 최종 수거율은 산수 유 18.9%, 산약 3.4%, 지각 16%, 상엽 18.7%였다.

2. 고지방 고탄수화물 식이 유발 비만형 제2형 당뇨병 동물 모델의 제작

체중 23-25g의 male ICR mice (중앙실험동물, Korea)를 구매하여 12시간씩 낮과 밤이 교대되며 40-70%의 습도를 유지하고 stainless-steel cage에서 1 주일간 사육하며 적응기를 거쳤다. 먹이와 물은 자유 롭게 먹도록 하였다. 그 후 정상군을 제외한 모든 실 험군에 인슐린 저항성을 일으킨다고 알려진 Surwit's

high fat, high sucrose diet (HFD, Research Diets #D 08020201, 45 kcal% Fat and 32 kcal% Sucrose)를 8 주간 섭취시켜 비만형 제2형 당뇨병을 유발했다 (Table 1).

모든 동물 실험 과정은 경희의료원 동물실험윤리 위원회의 승인(KHMC-IACUC:11-032)을 받았다.

3. 실험군 배정 및 연구 계획

실험군은 ICR mouse 10마리씩 정상군(ND), 대조군 (HFD), 복합처방 투여군(Complex Herbal Medicine, CHM), Metformin 투여군(Met)으로 나누어 진행하였 다. 정상군을 제외한 나머지 2개 군들은 Surwit's high fat, high sucrose diet를 8주간 섭취시켜 비만형 제2 형 당뇨병을 유발했다. Metformin 투여군은 Surwit's high fat, high sucrose diet에 복합처방을 0.5%의 비 율로, 복합처방 투여군은 Surwit's high fat, high su- crose diet에 복합처방을 5%의 비율로 섞어 8주간 섭 취하도록 하였다.

4. 체중 측정

체중은 실험 개시 일에 최초 측정 한 후 매주 1회 씩 측정하였고, 실험종료일에 마지막 sampling하기 전에 측정하였다. 체중 측정은 아침 사료 공급 전에 일괄적으로 전자저울(CAS 2.5D, Korea)을 사용하여 측정하였으며, 측정 시 mouse의 움직임에 따른 체중 오차를 최소화하기 위해 플라스틱 bowl에 mouse을 올려놓고, mouse가 안정 상태에 이르러 나타나는 체 중을 기록하였다.

5. Fasting Blood Suger(FBS)및 Oral Glucose Tolerance Test(OGTT) 측정

FBS 및 경구 OGTT 검사는 실험 7주째 8시간 이 상 mouse를 금식시킨 후 공복 시 혈당을 측정한 뒤, glucose(1g/kg body weight)를 D.W.에 녹여 경구 투 여한 다음 30분 후, 60분 후, 90분 후 mouse의 tail vein에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 혈당 은 strip-operated blood glucose sensor(ONETOUCH Ultra Inverness Medical Ltd. Stockport. UK)기기를 이용하여 측정하였다.

6. 지질 및 당대사 분석

실험 시작 8주째 식이 제한 없이 실험동물을 희생 시키기 전 mouse의 심장에서 채혈을 시행하여 3,000rpm에서 20분간 원심분리 한 다음, 上淸液을 얻 어 -40 ℃에 보관한 후 total cholesterol(TC), high density lipoprotein(HDL) cholesterol, low density lip- oprotein(LDL) cholesterol, triglyceride(TG) 등의 생 화학적 분석을 시행하였으며, 동시에 fructos- amine(glycoprotein) 검사를 시행하였다.

7. 혈청 랩틴(Leptin) 측정

실험 시작 8주째 mouse의 심장에서 채혈을 시행하 여 3,000rpm에서 20분간 원심분리 한 다음 上淸液을 얻어 -40℃에 보관한 후 삼광재단에 의뢰하여 leptin 을 분석하였다.

leptin은 검체에 125I가 부착된 인간 leptin과 leptin 항혈청을 결합시키고, 이 결합체에 PEG 침전액을 넣 어, 결합된 form에서 leptin의 양을 측정하는 이중항 체법 원리를 이용하였다. 방사면역측정법으로 Human Leptin 125 Tubes RIA kit(USA, Linco Research, Inc)를 이용하여 측정하였다.

8. 지방 및 간 무게 측정

실험 시작 8주째 mouse를 희생시킨 후 개복하여 부고환 지방 조직(epididymal fat pad) 및 간의 무게 를 측정하였다.

9. 지방 세포 크기 측정

지방 조직 세포의 형태학적 관찰을 위해 부고환 조 직의 일부를 적출하여 10% formaldehyde 용액에 고정 및 탈수 후, paraffin 투과과정을 거쳐 포매하였다. 박 절편기로 약 2㎛ 두께로 박절하여 Hematoxylin and Eosin(H&E) 염색하였다. 염색된 지방조직을 카메라가 부착된 광학현미경(BX61, Olympus, Japan)으로 찍어 서 100배의 대물렌즈를 사용하여 개체 당 5장의 사진 을 얻은 후, 컴퓨터 영상분석프로그램(ImageJ or Image analysis program, Metamorph, Japan)과 크기분 석 프로그램(Float morphology, USA)으로 분석하였다.

Table 1. Composition of Experimental Diets.

ND(g) HFD(g) Complex Herbal Medicine(g)

Casein 22.00 22.00 22.00

L-Cysteine 0.18 0.18 0.18

Cornstarch 50.00

Maltodextrin 7.50 7.50 7.50

Soybean oil 4.00 2.50 2.00

Mineral mixture S10001 4.00 4.00 4.00

Sodium bicarbonate 1.00 1.00 1.00

Potassium Citmousee 0.40 0.40 0.40

Vitamin mixture V10001 1.00 1.00 1.00

Cholin bitartmousee 0.20 0.20 0.20

Sucrose 10.00 45.10 45.10

Coconut Oil 25.30 25.30

Herbal Medicine 5.00

Group abbreviation :ND; normal diet, HFD; high fat, high sucrose diet.

Table 2. Effect in Weight, Fasting Blood Sugar, Oral Glucose Tolerance Test(30,60,90 Minutes After Feed Intake in 7 Weeks), Fructosamine of Each Experimental Group.

ND(n=10) HFD(n=10) CHM(n=10) Met(n=10)

Weight(g) Initial 23.2±0.79 23.3±0.82 23.7±0.67 23.2±1.03

Final 35.6±3.06 44.7±4.64*** 41.7±3.53 38.9±3.31††

FBS(mg/dL) 97.1±9.28 148±30.78*** 127.8±24.73 118.2±23.65†

OGTT 30ml(mg/dL) 232.5±45.10 332.0±37.34*** 334.4±29.48 300.1±18.08†

OGTT 60ml(mg/dL) 203.6±37.52 322.3±61.18*** 268±31.03† 248.2±37.57††

OGTT 90ml(mg/dL) 141.9±17.11 266.1±45.94*** 218.6±49.04† 200.0±33.15††

Fructosamine(㎛ol/L) 222.4±10.11 265.9±21.53*** 220.8±53.92† 228.9±21.05††

Group abbreviation : ND; normal diet, HFD; high fat, high sucrose diet, CHM; high fat, high sucrose diet with Complex herbal medicine, Met; high fat, high sucrose diet with metformin, FBS; Fasting Blood Suger, OGTT; Oral Glucose Tolerance Test.

Significantly different between the ND and the HFD by ANOVA (*** p<0.001). Significantly different between the HFD and the CHM by ANOVA(† p<0.05). Significantly different between the HFD and the Met by ANOVA(† p<0.05), †† p<0.01).

10. Stromal Vascular Cell의 분리

지방조직은 male ICR mice로부터 실험 시작 8주 째 mouse를 희생시킨 후 개복하여 부고환 지방 조직 (epididymal fat pad)을 채취하였다. Mouse으로부터 채취한 지방조직은 phosphate buffered saline(PBS, Gibco, USA)에 2% bovine serum albumin(BSA, Gibco, USA)를 넣은 용액에 넣은 다음 작은 조각으 로 분쇄하였다. 여기에 collagenase(Sigma, USA)와 DNase I(Roche, USA)를 넣어 37℃에서 30분간 shake하여 조직이 분쇄되도록 하였다. 2% BSA/PBS

에 5mM EDTA를 넣은 용액에 넣고 섞은 다음 1000rpm으로 3분간 원심분리 하였다. 상청액을 분리 한 다음 하층의 pellet을 제외한 나머지 용액을 제거 하고 PBS에 2% Fetal Bovine Serum(FBS, Sigma, USA)를 넣은 용액에 넣은 다음 100 μm cell strain- er(BD bioscience, USA)를 이용하여 불필요한 조직 을 제거하고 200 × g에서 10분 동안 원심분리 하여 하부의 모아진 세포를 RBC lysis buffer(eBioscience, San. Diego, CA, USA)에 10분 간 처리, 원심분리 하 여 SVC를 모았다.

11. Adipose tissue macrophage(ATM)에 대한 Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS) 분석

지방조직에서 분리한 SVC를 얼음에 넣고 세포수 를 측정한 다음 각 샘플당 106 cell 농도로 조정하였 다. FcBlock (20μg/ml) (BD Pharmingen, USA)를 넣 고 20분간 반응시킨 다음 fluorophore-conjugated된 1 차 antibodies인 CD45-FITC(BD Pharmingen, USA), F4/80-APC(eBioscience, USA), CD11b-phycoery- thrin(CD11b-PE, BD Pharmingen, USA) 혹은 isotype control antibodies인 Rat IgG2B FITC(BD, USA), Rat IgG2B PE(BD, USA), Rat IgG2a,k APC iso- type(eBioscience, USA)를 넣고 차광상태에서 20분간 반응시킨다. 2% FBS/PBS 용액로 세척한 다음 FACSCalibur(BD bioscience, USA)를 이용하여 분석 한다. 이후 FlowJo 프로그램(Tree star, inc, USA)을 이용하여 CD45(+), CD11b(+), F4/80(+)인 macro- phage의 퍼센트를 분석하였다.

12. 통계 분석

통계학적 비교분석은 GraphPad PRISM statistical package(ver 2.00, Graphpad software inc., San Diego, USA)를 이용하였고, 각 군 간의 비교는 one-way anal- ysis of variance(ANOVA)에 이어 Tuckey's post-hoc test로 사후 검증하였다. 표(Table)와 그림(Figure)에서 각각의 수치는 평균 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 표시 했으며, 양방 검정 유의도(two-tailed p value)는 p값이

<0.05 수준일 때를 기준으로 하였다.

결 과

1. 한약 복합처방 투여가 체중에 미치는 영향 체중은 8주간 모든 실험군에서 지속적으로 증가하 는 양상을 보였는데 대조군은 91.8%(23.30±0.82g에 서 44.70±4.64g으로 증가함)의 체중이 증가하여 정상 군이 53.4%(23.2±0.79g에서 35.60±3.06g으로 증가 함)의 체중증가를 보인 것에 비하여 유의한 비만이 유도되었다(p<0.001). 한약 복합처방 투여군은 8주간 의 고지방 고탄수화물 식이로 75.9%(23.70±0.67g에 서 41.7±3.53g으로 증가함)의 체중 증가율을 보여 대

조군보다 12.7% 체중증가가 억제되었으나 유의하지 는 않았다(Table 2).

2. 한약 복합처방 투여가 당대사에 미치는 영향 OGTT에서 FBS를 비롯한 모든 30분, 60분, 90분 후의 혈당에서 대조군이 정상군보다 유의성 있게 높 았고(p<0.001), 한약 복합처방군은 60분과 90분 후에 서 대조군보다 유의하게 낮았다(p<0.05). 메트포르민 군은 대조군에 비하여 FBS와 30분(p<0.05), 60분과 90분 후(p<0.01)의 OGTT 결과에서 대조군보다 혈당 이 유의하게 낮았다. 즉 한약 복합처방군이 60분과 (268±31.03mg/dL)과 90분에서(218.6±49.04mg/dL) 대조군과 비교하여 유의하게 고혈당을 억제하는 작 용이 있는 것으로 나타났으며(p<0.05) FBS(127.8±

24.73mg/dL)와 30분 후 혈당(334.4±29.48mg/dL)과 는 유의한 차이가 없었다(Table 2 & Fig. 1).

Fructosamine 농도는 정상군(222.4±10.11㎛ol/L)보 다 대조군(265.90±21.53㎛ol/L)에서 유의하게 증가하 였고(p<0.001), 한약복합처방 투여군(220.8±53.92㎛

ol/L)은 대조군보다 유의하게 낮았다(p<0.05)(Table 2

& Fig. 2).

3. 한약 복합처방 투여가 혈장 지질농도 및 Leptin 농도에 미치는 영향

LDL Cholesterol의 수치는 대조군 (18.5±7.74mg/dL)이 정상군(6.7±2.50mg/dL)과 비교 하였을 때 유의하게 높았으며(p<0.001) 한약 복합처 방군(11.6±2.63mg/dL)은 대조군과 비교하였을 때 유 의하게 낮았다(p<0.05).

Total cholesterol의 수치는 대조군(239.3±29.03mg/

dL)이 정상군(161.0±25.06mg/dL)과 비교하였을 때 매우 유의하게 증가하였으며(p<0.001) 한약 복합처방 군(260.6±34.08mg/dL)과 대조군과는 유의한 차이가 없었다.

Triglyceride의 수치는 대조군(267.6±74.51mg/dL) 이 정상군(134.3±51.19mg/dL)과 비교하였을 때 유의 하게 증가하였고(p<0.01) 한약 복합처방군(193.6±

80.24mg/dL)은 대조군과 비교하였을 때 유의하게 감 소하였다(p<0.05).

350

300

250

200

150

100

50

0 3 0 6 0 9 0

M inu tes

Blood glucose level (mg/dL)

N D H FD C H M M e t

Fig. 1. Fasting Blood Sugar, Oral Glucose Tolerance Test of Each Experimental Group.

Group abbreviation : ND; normal diet, HFD; high fat, high sucrose diet, CHM; high fat, high sucrose diet with Complex herbal medicine, Met; high fat, high sucrose diet with metformin, FBS; Fasting Blood Suger, OGTT; Oral Glucose Tolerance Test. (*** p<0.001). Significantly different between the HFD and the CHM by ANOVA(†p<0.05). Significantly different between the HFD and the Met by ANOVA(† p<0.05), †† p<0.01).

350

300

250

200

150

100

50

N D H FD C H M M e t

Fructosamine (umol/L)

Fig. 2. Fructosamine of Each Experimental Group.

Group abbreviation : ND; normal diet, HFD; high fat, high sucrose diet, CHM; high fat, high sucrose diet with Complex herbal medicine, Met; high fat, high sucrose diet with metformin. Significantly different between the ND and the HFD by ANOVA(*** p<0.001). Significantly different between the HFD and the CHM by ANOVA(† p<0.05). Significantly different between the HFD and the Met by ANOVA(†† p<0.01).

HDL cholesterol의 수치는 대조군(134.1±37.45mg/

dL)을 정상군(126.5±10.02mg/dL)과 비교하였을 때 증가하였으나 유의한 차이는 없었으며 대조군과 한 약 복합처방군(151.68±18.75mg/dL) 사이에도 유의한 차이는 없었다.

Leptin의 농도는 대조군(1.13±0.37ng/mL)이 정상군 (0.48±0.20ng/mL)과 비교하였을 때 유의하게 높았다 (p<0.001). 대조군과 한약 복합처방군(1.11±0.71ng/mL) 을 비교하였을 때는 유의한 차이가 없었다(Table 3).

Table 3. The Biochemistry Index and Leptin Level of Each Experimental Group After 8 Weeks.

ND(n=10) HFD(n=10) CHM(n=10) Met(n=10)

HDL Cholesterol(mg/dL) 126.5±10.05 134.1±37.45 151.7±18.75 137.727±12.57

LDL Cholesterol(mg/dL) 6.7±2.50 18.5±7.74*** 11.6±2.63† 9.85±2.42††

Total Cholesterol(mg/dL) 161.0±25.06 239.3±29.03*** 260.6±34.08 178.8±19.63†††

Triglyceride(mg/dL) 134.3±51.19 267.6±74.51*** 193.6±80.24† 181.7±48.47††

Leptin(ng/mL) 0.48±0.20 1.13±0.37*** 1.11±0.71 1.35±0.25

Group abbreviation : ND; normal diet, HFD; high fat, high sucrose diet, CHM; high fat, high sucrose diet with Complex herbal medicine, Met; high fat, high sucrose diet with metformin, HDL; high density lipoprotein, LDL; low density lipoprotein. Significantly different between the ND and the HFD by ANOVA(*** p<0.001). Significantly different between the HFD and the CHM by ANOVA(†

p<0.05), Significantly different between the HFD and the Met by ANOVA(†† p<0.01, ††† p<0.001).

Table 4. Fat & Liver Weight, White Adipocyte Size, and Adipose Tissue Macrophage of Each Experimental Group.

ND(n=10) HFD(n=10) CHM(n=10) Met(n=10)

Fat(g) 0.43±0.17 1.49±0.53*** 1.04±0.27† 1.01±0.33†

Liver(g) 0.99±0.25 1.07±0.27 1.12±0.31 1.14±0.16

White

Adipocyte size(㎛2) 5469.33±1428.582 12692.75±6028.285** 10804.22±7473.556† 8529.45±3917.313††

Adipocyte tissue

macrophage(%) 2.49±0.43 7.99±1.56*** 2.80±0.54†† 2.99±0.82††

Group abbreviation : ND; normal diet, HFD; high fat, high sucrose diet, CHM; high fat, high sucrose diet with Complex herbal medicine, Met; high fat, high sucrose diet with metformin. Significantly different between the ND and the HFD by ANOVA(** p<0.01,

*** p<0.001). Significantly different between the HFD and the CHM by ANOVA(† p<0.05, †† p<0.01). Significantly different between the HFD and the Met by ANOVA(† p<0.05, †† p<0.01).

2.5

2

1.5

1

0.5

0

Fat

Weight (g)

N D H FD C H M M e t

Liver

Fig. 3. Fat & Liver Weight of Each Experimental Group.

Group abbreviation : ND; normal diet, HFD; high fat, high sucrose diet, CHM; high fat, high sucrose diet with Complex herbal medicine, Met; high fat, high sucrose diet with metformin. Significantly different between the ND and the HFD by ANOVA(***

p<0.001). Significantly different between the HFD and the CHM by ANOVA(† p<0.05). Significantly different between the HFD and the Met by ANOVA(† p<0.05).

20000

15000

10000

5000

0

N D H FD C H M M e t

White Adipocyte Size

Fig. 4. White Adipocyte Size of Each Experimental Group.

Group abbreviation : ND; normal diet, HFD; high fat, high sucrose diet, CHM; high fat, high sucrose diet with Complex herbal medicine, Met; high fat, high sucrose diet with metformin. Original magnification = 100×. Hematoxylin and Eosin (H&E) staining. Significantly different between the ND and the HFD by ANOVA(** p<0.05). Significantly different between the HFD and the CHM by ANOVA(† p<0.05). Significantly different between the HFD and the Met by ANOVA(†† p<0.01).

4. 한약 복합처방 투여가 지방 및 간 무게에 미치는 영향

부고환 지방층의 무게는 정상군(0.43±0.17g)과 비 교하면 대조군(1.49±0.53g)에서 유의성 있는 증가세 를 보였고(p<0.001), 한약 복합처방 투여군 (1.04±0.27g)은 대조군보다 유의하게 낮았다(p<0.05) (Table 4, Fig. 3).

간의 무게는 대조군(1.07±0.27g)과 정상군 (0.99±0.25g) 사이에 유의한 차이가 없었으며 한약 복합처방 투여군(1.12±0.12g)과 대조군(1.07±0.27g) 사이에도 유의한 차이가 없었다(Table 4, Fig. 3).

5. 한약 복합처방 투여가 부고환 지방 세포 크기에 미치는 영향

지방세포의 크기는 대조군(12692.75±6029.285㎛2)

에서 정상군(5469.33±1428.582㎛2)과 비교하여 유의 하게 증가하였으며(p<0.01), 한약 복합처방의 투여군 에서(10804.22±7473.556㎛2) 대조군보다 유의하게 지방세포의 크기가 감소하여(p<0.05) 한약 복합처방 이 지방세포의 크기를 유의하게 억제하는 것으로 나 타났다. 대조군의 지방세포 크기가 1.0배 일 때 한약 복합처방 투여군의 지방세포 크기는 대조군의 0.85배 로 감소하였다(Table 4 & Fig. 4).

광학현미경을 통한 지방세포의 관찰에서 각각의 지방세포를 살펴보았을 때 정상군보다 대조군에서 확연하게 지방세포의 크기가 증가되어있으며 대조군 의 지방세포는 각각의 크기가 정상군에 비하여 불균 일한 형태를 띤다. 한약 복합처방 투여군은 대조군과 비교하여 보았을 때 지방세포의 크기가 더 작고 주변 세포와 비교적 균일한 형태를 띠고 있다(Fig. 4).

12

10

8

6

4

2

0

N D H FD C H M M et

Adipose tissue macrophage (%)

Group abbreviation: ND; normal diet group, HFD; high fat, high sucrose diet group, CHM; high fat, high sucrose diet with Complex herbal medicine, Met; high fat, high sucrose diet with metformin. Significantly different between the ND and the HFD by ANOVA(***

p<0.001). Significantly different between the HFD and the CHM by ANOVA(†† p<0.01). Significantly different between the HFD and the Met by ANOVA(†† p<0.01).

Fig. 5. Adipose Tissue Macrophage Analysis Through Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS) of One Mouse.

6

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Adipose tissue macrophage(ATM)

FACS를 통한 adipose tissue macrophage의 퍼센트 분석에서 CD11b(+), F4/80(+)인 macrophage의 퍼센 트는 대조군이(7.99%)가장 높았으며 그 다음이 메트 포르민군(2.99%)과 한약복합처방군(2.80%)이었으며 정상군(2.49%)이 가장 낮았다. 대조군(7.99±1.56%)은 정상군(2.49±0.43%)에 비하여 유의하게(p<0.001) adi-

pose tissue macrophage가 증가하여 고지방, 고탄수화 물 식이로 유발된 비만한 쥐의 지방세포에서 염증수 치가 상승되어있음을 알 수 있다. 한약복합처방 투여 군(2.80±0.54%)은 대조군과 비교하였을 때 유의하게 adipose tissue macrophage가 감소(p<0.01)하여 한약 복합처방군에서 대조군과 비교하였을 때 지방세포의 염증이 억제되었음을 알 수 있다(Table 4, Fig. 5).

Figure 5의 FACS의 Q2구간의 퍼센트는 각 군의 mouse중 한 마리의 분석 결과를 나타낸다(Fig. 5).

고 찰

비만은 제2형 당뇨병 또는 심혈관계 질환을 초래 하는 대표적인 위험인자이다. 특히 중심성 비만은 이 상지질혈증과 고혈압 등과 함께 인슐린 저항성을 초 래하여 제2형 당뇨와 대사증후군의 가장 대표적인 위 험 요소이다¹⁾. 인슐린 저항성과 함께 베타세포가 파 괴되어 인슐린 분비에 이상이 발생하게 되면 제2형 당뇨가 발병하게 된다¹⁾.

Nurses' Health Study and the Physician's Health Follow-Up Study에서 당뇨병의 발병에 가장 큰 영향 을 미치는 요인이 바로 BMI인 것이 밝혀졌으며¹²⁾, 대규모로 진행된 Diabetes Prevention Program(DPP) 의 연구결과 평균 7%정도의 체중감량이 당뇨병 발생 을 58%나 줄였다고 발표하여 체중과 당뇨병이 직접 적으로 관련이 있음을 증명하였다¹³⁾.

비만, 특히 중심성 비만이 인슐린 저항성을 유발하 는 가장 큰 원인으로 주목을 받고 있으며 최근 많은 연구들을 통하여 비만, 인슐린 저항성과 저강도 만성 염증상태는 서로 깊은 관련이 있다는 것이 밝혀졌다

14). 염증 상태가 어떻게 인슐린 저항성에 영향을 미치 는지 그 기전에 관하여 분자 세포학적인 접근이 이루 어져왔지만 아직까지도 그 기전은 많은 부분에서 밝 혀지지 않은 상태이다. 이 과정에서 지방세포의 mac- rophage로 인해 발생하는 지방세포 조직의 염증이 인 슐린 저항성에 관여한다고 알려져 있다. 또한 지방세 포를 단순히 에너지 저장기관이 아닌 에너지 항상성 에 관여하는 중요한 내분비 조직으로 인식하게 되면 서¹⁵⁾ 지방조직에서 분비하는 다양한 cytokine(adipo- kine)에 대한 연구도 활발히 이루어졌다. 이러한 adi- pokine들은 macrophage와 상호작용을 하면서 지방조 직에서의 염증반응과 인슐린 저항성에 중요한 역할을 한다. 따라서 최신 연구들은 비만으로 유도된 이러한 염증상태를 개선시키고 염증과 adipokine과의 관계를 규명함으로서 인슐린 저항상태 또는 제 2형 당뇨를 치료하는 새로운 접근법에 주목하고 있다^28,35).

지방세포에서 분비되는 adipokine은 비만한 상태에 서 대부분 증가되고 지방 세포에 macrophage를 침윤 시켜 염증상태를 유발시키고 인슐린 저항성을 증가시 키게 된다. 그 외에 macrophage가 지방 조직으로 모이 는데 관여하는 요인은 복합적으로, 지방세포에서 분비

되는 adipokine의 작용과 더불어 비대된 지방세포가 사멸하여 이를 처리하기 위해 Adipose tissue macro- phage(ATM)에 의해 둘러싸이게 된다는 이론도 같이 제기되고 있으나 아직 확실시 되지는 않았다¹⁶⁾. 최근 임상 연구에서도 BMI와 지방세포의 macrophage의 숫 자 사이에 관련성이 있다고 보고된 바 있다¹⁷⁾. 현재까지 지방세포와 관련된 당뇨 치료제는 PPAR agonist인 Thiazolidinediones(TZD)계 약물로 제2형 당 뇨병 환자의 인슐린 저항성을 개선시켜 혈당을 강하 시키는 효과가 있다. PPAR는 주로 지방세포에서 발 현되며 TZD는 PPAR를 활성화시킴으로써 항당뇨 효 과를 발휘한다. PPARγ는 macrophage의 염증반응을 저해하고 염증반응을 억제하는 유형으로 macrophage 를 분화시키고 인슐린 감수성을 개선시키는 adipokine 의 분비를 증가시키고 GLUT-4의 작용을 활성화시켜

18) 전신적으로 인슐린 저항성을 개선시켜주는 효능 때문에 각광받았다. 그 뿐만 아니라 PPARγ는 여러 실 험연구들에서 심혈관계질환에 긍정적인 영향을 미친 다고 보고된 바 있지만 초기에 TZD계열 약물이 당뇨 병의 가장 흔한 합병증인 심혈관계 합병증 예방에 도 움이 될 것이라는 기대와는 달리 여러 임상연구에서 심혈관계 부작용들이 보고되어¹⁹⁾ 현재까지도 그 안전 성과 관련하여 논란이 제기되고 있는 실정이다²⁰⁾.

그 외에 GLP-1, GIP, PYY, Ghrelin등과 같이 위장 관에서 분비되는 호르몬(Gut hormone)들이 에너지 균형에 관여한다는 것들이 밝혀져 이와 관련된 치료 제가 개발되기도 하였다. 그 대표적이 예가 GLP-1인 데, GLP-1은 음식섭취에 따른 인슐린 분비를 증가시 키고 인슐린 감수성을 개선시킬 뿐만 아니라 중추신 경에도 작용하여 위장의 움직임을 지연시켜 포만감 을 느끼게 하여 에너지 섭취를 감소시키는 효과가 있 다. 이러한 작용은 결국 체중감소로 이어져 제2형 당 뇨환자에게 투여 시 혈당강하효과와 더불어 체중감 소의 효과가 있다고 밝혀져 있으며 그 중에서도 체간 의 지방량 감소가 가장 뚜렷하였다²¹⁾. 비만과 제2형 당뇨병의 밀접한 관계를 고려하여 보았을 때 GLP-1 의 중추와 위장관의 개입을 통한 체중과 지방량 감소 의 효능은 당뇨병 치료의 새로운 획을 그었다고 할 수 있다. 다만 짧은 반감기로 인하여 현재는 GLP-1 을 비활성화시키는 DPP-4를 억제하는 DPP-4 in- hibitor가 보다 널리 사용되고 있으나 이 약의 체중감

소의 효과는 거의 없는 것으로 알려져 있다.

이와 같이 최근의 제2형 당뇨병 치료제는 지방세 포의 adipokine과 관련되거나 위장관 호르몬의 변화 로 발생한 체중감소에 따른 지방량의 감소와 관련이 깊다.

현재까지 비만 치료 연구에 천문학적인 비용이 치 러졌음에도 불구하고 현재까지 비만을 치료하기 위 한 수많은 약이 시도되었다가 다양한 부작용으로 인 해 사라졌다. 미국 식품의약청(FDA)에서 승인된 Olistat이 유일하게 장기 사용 가능한 약으로 체내에 서 지방 흡수를 억제하여 몸 밖으로 지방을 배출하는 작용을 하지만 근본적인 치료는 되지 못하고 있으며 이전에 사용되었던 sibutramine은 심장발작과 뇌졸중, 두통, 혈압상승, 우울증, 불면증 등의 부작용으로 2010년 사용이 금지되어 현재 근본적으로 비만을 치 료하는 약은 거의 없는 실정이다.

현재까지 비만에서 나타나는 지방세포의 macro- phage의 침윤, 만성 염증상태의 개선을 통해 부작용 없이 인슐린 저항성과 제2형 당뇨를 치료하는 약은 아직 개발된 바가 없다. 지방세포에서 분비되는 adi- pokine과 macrophage가 유발하는 inflammation이 인 슐린 저항성을 발생시킨다는 연구결과는 향후 adi- pose tissue macrophage(ATM)의 침윤을 저해하는 기 전을 통하여 인슐린 저항성을 개선시키는 치료제 개 발의 연구가 진행될 것임을 암시한다.

한의학에서는 당뇨병을 消渴의 범주로 본다. 이를 지칭하는 용어 또한 다양한데 황제내경에서는 많이 마시고 많이 먹고 자주소변을 보는 것을 消癉이라 칭 하고 이는 살이 찌고 귀한 사람이 달고 기름진 음식 을 먹어서 생긴 병이라고 하였다. 기름진 것을 먹으 면 주리가 촘촘해져 양기가 밖으로 나가지 못하고 내 열이 생기게 되어 진액을 고갈시키기 때문에 갈증이 생기고 자주 배가 고프며 탁한 소변을 자주 보게 된 다³¹⁾. 따라서 그 치료는 陰虛爲本 燥熱爲標라고 하여 고갈된 음을 보해주면서 청열시키는 치법을 기본으 로 삼는다³⁴⁾.

본 연구에서 사용된 산수유 산약 지각 상엽으로 이루어진 복합처방은 기존의 많은 연구들에서 혈당 강하의 효과가 밝혀진 바 있는 한약물이다^5-11). 산수 유 산약 지각은 혈당강하의 효과가 입증된 수풍순기 환의 분할처방이며 상엽은 단일 약물로도 다수의 연

구에서 혈당 강하의 효과가 입증된 본초로 이들을 혼 합하여 복합처방을 구성하였다.

山茱萸(Cornus officinalis)는 층층나무과(Cornaceae) 에 속한 낙엽소교목인 山茱萸 나무의 果實을 건조한 것으로 補益肝腎, 澁精固脫의 효능이 있어 眩暈耳鳴, 腰膝酸痛, 陽痿遺精, 遺尿, 尿意頻數, 崩漏帶下, 大寒 虛脫, 內熱消渴 등의 증상을 치료하는 효능이 있다²²⁾. 산수유에서 추출한 polyphenol을 streptozotocin 유발 당뇨병 동물모델에 투여하여 공복혈당과 식후혈당의 감소 및 advanced glycation end products(AGEs)의 합성을 억제하는 효능이 있다고 알려져 산수유의 유 효성분들이 혈당강하에 기여한다는 것이 밝혀진 바 있다⁵⁾.

山藥(Dioscorea rhizoma)은 마과(Dioscoreaceae)에 속한 덩굴성 참마(Dioscorea japonica) 또는 마 (Disocorea batatas)의 根莖을 건조한 것으로 健脾, 補 肺, 固腎, 益精의 효능이 있어 脾虛泄瀉, 虛勞, 咳嗽, 消渴, 遺精, 小便頻數 등의 증상을 치료한다²²⁾. 산약 추출물을 fructose식이 유발 인슐린 저항성 동물모델 에게 투여하였을 때 공복 혈당 식후혈당의 감소 및 인슐린 분비촉진을 통한 인슐린 저항성을 개선시키 는 효능이 확인되었다⁶⁾.

枳殼(Aurantii fructus)은 운향과(Rutaceae)에 속한 산등(Citrus aurantum L)의 미성숙한 果實을 건조한 것으로 破氣, 行痰, 消積의 효능이 있어 胸膈痰滯, 胸 痞, 脇脹, 噯氣, 嘔逆, 下利後重, 脫肛, 子宮脫垂 등의 증상을 치료한다²²⁾. 지각의 성분인 hesperidin, nar- ingin은 부분적으로 간 내 해당작용을 증가시키고 glycogen합성을 증가시키며 포도당 합성과정을 저해 하는 작용을 하여 혈당강하 효과가 있으며7) 또한 지 각의 성분인 hesperidin, naringin은 고콜레스테롤증 쥐에서 총콜레스테롤, LDL-cholesterol, VLDL-cho- lesterol 양을 유의성 있게 감소시켜 지질이상을 회복 시킨다는 보고가 있어 혈당강하 효과뿐만이 아니라 제2형 당뇨병의 지질이상을 개선하는데도 활용될 수 있다고 생각된다⁸⁾.

상엽(Mori Folium)은 뽕나무과(Moraceae)에 속한 뽕나무(Morus alba L.) 또는 기타 근연식물의 잎으로 消散風熱 淸肺潤燥 淸肝明目하는 작용이 있어 風熱 感冒, 肺熱燥嗽, 頭暈頭痛, 目赤眼花의 증상을 치료한 다²²⁾. 상엽은 에탄올 추출물을 고지방식이로 유발된

비만형 당뇨 동물모델에 투여한 결과 체중감소 및 간 내 지방축적 억제 등의 효과를 나타낸다고 알려진 바 있으며⁹⁾ 비-비만형 당뇨모델인 Goto-Kakizak(GK) rat 에서도 공복 혈당 및 당부하검사에서 식후 혈당 감 소, 인슐린 분비 촉진, 인슐린 저항성 개선, 소장에서 의 α-glucosidase 억제 효과를 나타낸다고 알려져 비 만형과 비-비만형 당뇨모델 모두에서 인슐린 저항성 개선의 효과가 있었다¹⁰⁾. 또한 건강인 대상 임상연구 에서 50g의 sucrose를 경구투여하면서 상엽추출물을 동시에 투여한 결과 식후혈당은 감소하고 인슐린 분 비는 증가하는 효능이 있었다¹¹⁾. 그 외에도 oxygen free radical을 조절하여 oxidative stress를 감소시켜 췌장에도 영향을 미쳐 당뇨병의 발현을 억제시킬 수 있는 가능성도 제기되는 등³⁶⁾ 단일약물로 다양한 연 구가 이루어져왔다.

이들 중 산수유 산약 지각은 수풍순기환의 분할처 방으로 수풍순기환은 이미 박²³⁾의 연구에서 고지방 고탄수화물 식이로 유발한 비만형 제2형 당뇨병 모델 에서 혈당강하와 PPAR-α 유전자 발현 증가 및 중성 지방 감소를 보고한 바 있으며, 이²⁴⁾의 연구에서도 내 당능 장애환자의 식후 혈당강하 효과를 보고한 바 있 어 그 효능이 입증된 바 있는 처방이다.

이에 이번 연구에서는 수풍순기환의 분할처방인 산 약, 산수유, 지각에 상엽을 추가하여 복합처방을 구성 하여 이 처방의 투여가 비만형 제2형 당뇨병에 미치 는 영향을 알아보기 위하여 고지방, 고탄수화물 식이 로 유발시킨 비만형 제2형 당뇨병 모델 mouse에 대하 여 8주간 정상군, 한약 복합처방투여군, 대조군, 메트 포르민 투여군으로 나누어 체중, 당대사, 지질농도, leptin의 농도, 지방과 간의 무게, 지방세포의 크기, 지 방 조직의 macrophage 등의 지표들을 측정하였다. 메 트포르민은 prediabetes 환자에게 당뇨를 예방하기 위 하여 처방할 수 있는 약 중에서 유일하게 FDA의 승인 을 받은 처방으로 당뇨병 초기에 가장 많이 사용되므 로 이번 실험의 양성 대조군으로 사용하였다.

8주간의 연구기간 동안 고지방, 고탄수화물 식이 로 모두 유의한 비만이 유도되었고(p<0.001) 대조군 과 비교하여 한약 복합처방 투여군의 체중이 7주차에 접어들어 감소하기 시작하는 양상을 보였지만 유의 하게 낮지는 않아 한약 복합처방이 직접적으로 체중 감소에 변화를 가져왔다고 보기는 어렵다. 이러한 결

과는 이전의 박²³⁾의 수풍순기환의 실험에서도 동일하 게 나타났으며 박²⁵⁾의 연구에서는 수풍순기환의 분할 처방이 대조군과 비교하였을 때 체중감소가 관찰되 지 않다가 마지막 8주째에만 유의하게 감소하였다는 결과로 미루어보았을 때 체중감소의 효과가 7에서 8 주 이후부터 두드러지게 나타나는 것일 가능성도 있 다고 본다.

당대사의 측정은 경구 내당능 검사(Oral Glucose Tolerance Test, OGTT)와 Fructosamine 수치의 측정 으로 평가하였는데 정상군과 비교하였을 때 대조군 이 공복혈당을 포함한 0, 30, 60, 90분에서 모두 유의 하게 혈당이 높게 측정되어 고지방 고탄수화물 식이 로 유의하게 내당능의 이상이 발생하였다고 볼 수 있 다. 한약복합처방 투여군이 대조군에 비하여 경구 당 부하 60분과 90분에서 유의하게 혈당 강하의 효과가 나타나(p<0.05) 대조군보다 인슐린 저항성이 감소하 였음을 알 수 있다.

Fructosamine(glycoprotein) 측정법은 단백질의 아 미노기가 비효소 반응으로 포도당과 결합하는 방법 을 이용한 것으로 지난 2-3주간의 혈당의 평균을 반 영하는 수치이다. Fructosamine의 농도는 대조군에서 정상군과 비교하였을 때 유의하게 증가되어 최근 2주 간의 평균혈당이 유의하게 상승하였음을 알 수 있으 며(p<0.001) 한약 복합처방군의 fructosamine 농도가 대조군보다 유의하게 낮아(p<0.05) 혈당강하의 가능 성을 보여준다고 할 수 있다.

이상지질혈증은 인슐린 저항성이 특징인 당뇨병과 대사증후군에서 가장 많이 볼 수 있는 지질대사 이상 으로, 인슐린의 지단백 생성 억제 효과에 장애가 발 생하여 혈중에 지단백 농도가 높아지고 간 내 중성지 방 함량이 많아지면서 죽상동맥경화증의 위험이 높 은 LDL을 생성하며 HDL의 분해를 촉진시켜 콜레스 테롤 역수송 작용을 저해한다²⁶⁾. 이상지질혈증이 당 뇨병 환자의 심혈관질환 합병증 발생 위험도에 기인 하는 바가 크기 때문에 당뇨병 치료에 있어서 이상지 질혈증의 교정은 매우 중요하다.

Total cholesterol의 농도는 정상군에서 가장 낮았 고 대조군은 유의하게 정상군보다 높았으나 한약 복 합처방군은 대조군과 비교하였을 때 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 본연구와 유사한 다른 박²³⁾의 연구에서도 수풍순기환의 투여가 total cholesterol의

농도에는 영향을 미치지 않았으며 그 후 박²⁵⁾의 수풍 순기환 분할처방 투여에서도 동일하게 관찰된다.

그 외 LDL-cholesterol과 중성지방의 농도는 정상 군과 비교하였을 때 대조군이 유의하게 높았으며 대 조군과 한약 복합처방을 비교하였을 때는 한약 복합 처방군이 유의하게 낮았으나(p<0.05) HDL-cholester- ol의 경우는 대조군과 정상군, 대조군과 한약 복합처 방들 사이에 모두 유의성이 없었다. 이상지질혈증에 대한 이러한 결과는 타 유사 연구결과들과는 조금씩 차이를 보이는데 박²³⁾의 연구에서는 수풍순기환 처방 의 투여가 중성지방 수치만을 유의하게 낮추었다고 보고하였으나 수풍순기환 분할처방을 투여한 박²⁵⁾의 연구에서는 유의성이 없었으며 송²⁷⁾의 연구에서는 수 풍순기환 분할처방이 HDL-cholesterol의 농도만을 유 의하게 높였다고 밝혔다.

지방조직(White adipose tissue)은 leptin, adipo- nectin, resistin, TNF-α, IL-6, MCP-1등을 비롯한 다 양한 adipokine들을 분비하면서 지방세포에 침윤하는 macrophage와 함께 만성 염증상태를 유발하고 인슐 린 저항성과 심혈관계 합병증 발생에 중요한 역할을 하고 있다¹⁵). 비만한 환자들의 만성 염증상태는 혈장 의 C-reactive protein과 TNF-α와 IL-6, MCP-1, IL-8 등과 다기능 단백질인 leptin과 osteopontin과 같은 염 증성 cytokine의 농도의 상승으로 확인할 수 있다²⁸⁾. 여러 rat과 mice를 통한 연구에서 실험적으로 TNF-α 를 감소시켰을 때 인슐린 저항성이 감소하였음이 밝 혀져 염증매개 물질이 인슐린 저항성과 관련이 있다 는 것이 밝혀지기 시작하였으며²⁾ IL-1과 IL-6도 인슐 린의 신호체계에 관여하여 인슐린 저항성을 증가시 키는 방향으로 작용한다는 것이 밝혀졌다. MCP-1과 IL-8등을 비롯한 여러 cytokine들은 macrophage를 지 방조직으로 유인하여 침윤한 macrophage가 염증을 매개하게 되면서 인슐린 저항성에 관여하는데 leptin 도 여기서 MCP-1을 비롯한 염증 매개물질을 생성하 는 역할을 한다²⁸⁾. Leptin은 이들 중 대표적으로 white adipose tissue에서 분비되는 adipokine으로 체 내 지방량과 비례하여 분비되어 비만의 지표로 사용 된다³³⁾. Leptin은 인간에서 포만감을 느끼게 하는 신 호를 전달하여 음식섭취를 조절하고 중추회로에도 영향을 주어 에너지 소비를 촉진시키는 기능이 있어 발견 초기에 비만치료에 활용할 수 있을 것이라고 여

겨졌으나 비만한 사람들은 오히려 leptin의 내성으로 인해 leptin의 농도는 높으나 체중감소의 효과는 기대 하기 어렵다³²⁾. 비만에서 나타나는 고leptin혈증은 만 성 염증상태와 같이 관찰되는데 이는 leptin이 macro- phage를 활성화시키고 TNF-α를 비롯한 다른 cyto- kine의 생성에 관여하는 것과 관련이 있다²⁹⁾.

이번 연구에서 leptin의 농도는 정상군과 비교하였 을 때 대조군에서 유의하게 증가하였으나(p<0.01) 한 약 복합처방군과 대조군 사이에 유의한 차이가 없었 다. 대조군에서 leptin의 농도가 증가하였다는 결과는 대조군이 정상군에 비하여 유의하게(p<0.001) 체중증 가가 일어났으며 leptin의 농도가 체중, 특히 지방량 과 비례한다는 연구들과 일치한다³³⁾. 한약 복합처방 군을 대조군과 비교하였을 때 leptin농도의 유의한 변 화가 나타나지 않았는데 한약 복합처방군이 지방무 게는 감소시켰으나 유의한 체중감소의 효과는 없었 기 때문이라고 생각되며, 박²³⁾의 연구에서 비만한 쥐 에게 수풍순기환을 투여하였을 때 leptin의 농도에는 변화를 주지 못했다는 결과와 유사하다. Leptin은 다 른 요인들에 의해서 많은 영향을 받으며 아직까지도 생체 내 작용이 정확하게 밝혀지지 않은 바가 많아 다른 연구들에서도 다양한 결과들이 보고되고 있다.

지방세포의 크기가 커져서 형태의 변화가 오게 되 면 지방세포에서 TNF-α 생성이 활발해지고 TNF-α가 chemoattractant protein-1(MCP-1)의 생성을 자극시켜 macrophage가 지방조직으로 모이도록 유도한다. 이 과정에서 leptin 또한 macrophage가 지방세포에 모이 는 것을 돕는다. 이러한 macrophage를 adipose tissue macrophage(ATM)라고 한다. 즉 비만한 상태에서는 지방세포에서 분비되는 adipokine들이 지방세포에 macrophage들이 침윤하는 것을 돕고 이로 인해 만성 염증상태가 지속이 되는데 이러한 상태가 인슐린 저 항성을 증가시키게 되므로4) 결국 염증상태의 개선이 인슐린 감수성 향상에 도움이 된다.

ATM은 세포 표면에 F4/80, CD11b등과 같은 표지 자를 갖고 있어 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)를 통한 분석에서 F4/80, CD11b에서 양성으 로 나타나는 비율로 지방세포로 유입되는 macro- phage의 증가 정도를 측정할 수 있다.

본 실험에서 정상군과 비교하였을 때 대조군의 지 방의 무게(p<0.001)와 지방세포의 크기(p<0.01)가 모

두 유의하게 증가하여 고지방 고탄수화물 식이가 지 방세포의 비대를 유발시켰음을 알 수 있었다. 지방세 포의 비대와 더불어 FACS 분석에서도 ATM의 비율 이 유의하게 증가하여(p<0.001) 체내 지방량이 증가 함에 따라 ATM이 증가하였음을 알 수 있었다. 식이 로 유발된 비만한 쥐의 부고환 지방조직을 F4/80과 CD11b 항체로 염색하였을 때 모두 양성으로 나타나 는 macrophage의 비율이 증가한다는 것은 이미 다른 연구에서 밝혀진 바 있다30). 한약 복합처방을 투여 한 군과 대조군을 비교하였을 때 한약 복합처방군의 지방의 무게(p<0.05)와 지방세포의 크기(p<0.05)가 유의하게 감소하였으며 ATM의 비율이 유의하게 낮 았다(p<0.01). 양성대조군인 메트포르민군이 한약 복 합처방군보다 지방의 무게와 지방세포크기의 감소폭 이 컸음에도(p<0.01) 불구하고 ATM의 비율은 한약 복합처방군에서 메트포르민군보다 유의하게 감소하 였는데 이는 한약 복합처방군이 지방량의 감소와 지 방세포크기 비대를 억제하는 효능과 더불어 지방세 포의 macrophage를 감소시키는 효능이 더 클 수 있 다는 것을 시사한다(Fig. 5).

본 연구에서 사용한 산수유 산약 지각 상엽으로 이루어진 복합처방은 다수의 연구결과에서 혈당강하 의 효과가 입증된 바 있으나 이전의 연구들은 비만한 쥐에게 이러한 한약물 경구 투여 시 체중, 혈당, 지질 대사, 지방세포의 크기 및 adipokine의 분비변화 등을 알아보았다면 본 연구에서는 이와 더불어 비만을 만 성염증상태로 보아 그 지표인 지방세포의 macro- phage의 비율을 알아보았다. 산수유 산약 지각 상엽 의 한약 복합처방을식이로 유발된 비만한 쥐에게 투 여하였을 때 체중은 감소하였으나 유의하지는 않았 고 OGTT를 비롯한 fructosamine의 수치는 유의하게 낮았다. 한약 복합처방은 leptin의 농도 및 간의 무게 에는 유의한 변화가 없었으나 부고환 지방층의 무게 와 지방세포의 크기는 유의하게 감소시켰고 그 중 ATM의 비율을 크게 감소시켰다. 이번 연구 결과는 본 연구에 사용된 한약 복합처방이 직접적인 체중감 소나 혈당강하의 효과 이외에 지방세포의 macro- phage를 감소시켜 염증을 개선시킴으로써 인슐린 감 수성을 증가시킬 수 있다는 가능성을 보여준다. 그 과정을 다양한 adipokine들이 매개하게 되는데 아직 한약물들이 이러한 adipokine들에 미치는 영향에 대

한 연구는 많이 부족한 실정으로 향후 adipokine들과 macrophage에 초점을 둔 연구가 많이 이루어져야할 것이다.

결 론

한약 복합처방이 Surwit's high fat, high sucrose 식 이로 유발한 비만형 제 2형 당뇨병 모델 mouse의 체 중, 공복혈당, 당 및 지질대사, 부고환 지방 무게 및 간 무게, leptin, ATM에 미치는 효과를 조사하여 다 음과 같은 결론을 얻었다.

1. 한약 복합처방 투여는 Surwit's high fat, high sucrose 식이로 인한 체중 증가 억제 가능성을 보였 다.

2. 한약 복합처방 투여는 공복 혈당(FBS)과 경구 당부하 검사(OGTT)에서 내당능을 회복시켰다.

3. 한약 복합처방 투여는 Fructasamine을 유의하게 감소시켰다.

4. 한약 복합처방 투여는 LDL-cholesterol, Triglyceride를 유의하게 감소시켰다.

5. 한약 복합처방 투여는 부고환 지방층 (Epididymal Fat Pad)의 무게를 대조군보다 유의하게 감소시켰다.

6. 한약 복합처방 투여는 Adipocyte Size, Adipose Tissue Macrophage를 유의하게 감소시켰다.

본 연구결과에 따르면 한약 복합처방은 비만형 제 2형 당뇨병 모델 mouse의 당 및 지질대사를 개선시 키고, 지방의 무게 및 ATM을 감소시키는 효과가 있 었다. 이 연구를 바탕으로 향후 추가적인 임상연구가 필요할 것이라 생각된다.

감사의 글

* 본 연구는 2009년도 경희대학교 연구비지원에 의한 결과임 (과제 고유번호 KHU-20090586).

참고문헌

1. Gardner D, Shoback D. Greenspan's basic & clin- ical endocrinology. McGrawHill. 2007:675-6.