39(8), 1107～1112(2010) DOI: 10.3746/jkfn.2010.39.8.1107
발아 벼 열수 및 에탄올 추출물의 암세포주 증식억제 효과
김현영1․황인국1․김태명2․김대중2․박동식3․김재현3․이준수1․정헌상1†
1
충북대학교 식품공학과
2
충북대학교 수의학과
3
국립식량과학원 농식품자원부
Antiproliferation Effects of Ethanol and Water Extracts from Germinated Rough Rice
Hyun Young Kim1, In Guk Hwang1, Tae Myoung Kim2, Dae Joong Kim2, Dong Sik Park3, Jae Hyun Kim3, Junsoo Lee1, and Heon Sang Jeong1†
1Dept. of Food Science and Technology, and 2College of Veterinary Medicine and
Research Institute of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Chungbuk 361-763, Korea
3National Institute of Crop Science, Gyeonggi 441-797, Korea
Abstract
This study was conducted to investigate the effect of 70% ethanol and water extract of Korean rough rice (‘Ilpum’, ‘Goami2’, ‘Keunnun’, ‘Sulgaeng’, ‘Baegjinju’, and ‘Heugkwang’) before and after germination on pro- liferation of human cancer cell lines (HepG2, PC-3, and MCF-7). Antiproliferation effect was higher in ethanol extract than water extract, and was higher in after germination. ‘Ilpum’ ethanol extract after germination showed higher anti-proliferation effect on HepG2 and PC-3 cell lines than before germination. The cell viability on HepG2 and PC-3 cell lines of ‘Ilpum’ ethanol extract after germination was 27.23% and 5.05% at 1.0 mg/mL, respectively. The anti-proliferation effect on MCF-7 was the highest in ‘Ilpum’ and ‘Heugkwang’ 70% ethanol extract after germination and those cell viabilities were 7.27% and 17.00% at 0.5 mg/mL, respectively. These results suggest that germinated rough rice might have a potentially preventive effect on human cancer cells.
Key words: rough rice, germination, antiproliferation, human cancer cell lines
†
Corresponding author. E-mail: [email protected]
†
Phone: 82-43-261-2570, Fax: 82-43-271-4412
서 론
최근 건강에 대한 인식이 높아짐에 따라 식생활이 건강에 미치는 영향에 대한 관심 또한 높아져 여러 형태의 건강식품 에 대한 수요가 증가하고, 특히 주식으로 하는 쌀과 현미를 대체 건강식품으로 변환시키는 연구도 많이 진행되고 있다.
또한 쌀의 과잉생산과 소비감소, 그리고 쌀시장 개방으로 인한 농촌경제 및 사회적 문제점을 해결하기 위해서는 단순 히 에너지 또는 영양소 공급원으로서가 아니라 생리활성 기 능이 풍부한 건강 보조식품으로 소비하는 쌀이 개발되어야 할 필요성이 대두되고 있는 실정이다(1).
일반적으로 식물종자는 알맞은 조건이 주어지면 발아하 며, 발아가 진행됨에 따라 생리활성이 증가되고 구성성분의 변화가 일어나기 때문에 발아에 의한 영양소 증가를 위한 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 곡류에 대한 연구로는 발아 중 탄수화물 변화(2), 단백질과 아미노산 변화(3), 지방 산 변화(4,5), 무기질 변화(6) 및 비타민 변화(3,7) 등과 각종
효소나 효소 저해제의 일종인 트립신 저해제의 변화(2,8)에 관한 연구들이 진행되었으며, 발아현미에 대한 연구로 발아 정도에 따른 항산화 활성 변화(9) 및 비만억제 활성(10) 등이 진행되었을 뿐 벼 자체를 발아시킨 연구는 Kim 등(11)이 보고한 몇 가지 암세포주의 증식억제에 대한 연구를 제외하 고는 찾아보기 어려운 실정이다.
본 연구에서는 6종의 벼에 대한 발아 전과 후의 물과 에탄 올 추출물이 인체유래 암세포(간암, 유방암 및 전립선암) 증 식에 미치는 영향을 살펴보고 암 예방의 효과가 있는 기능성 식품으로서의 개발 가능성을 살펴보고자 하였다.
재료 및 방법
재료
본 실험에 사용된 시료는 농촌진흥청에서 2008년 재배 생
산된 일반 벼인 일품벼(Ilpumbyeo), 백진주벼(Baeginjubyeo)
및 설갱벼(Sulgaengbyeo) 3품종과 특수미인 고아미2(Goami2),
흑광벼(Heugkwangbyeo) 및 거대배아미((Keunnunbyeo) 3 품종을 분양받아 실험에 사용하였다.
벼 발아
발아는 Kim 등(11)의 방법에 따라 품종별 벼 500 g을 20
o
C의 물로 수세하고 3일간 침지시킨 다음 발아기(TP-CB 400, EZIONE Inc., Beijing, China)로 발아시켰다. 발아 온도 는 37
oC, 습도는 85%로 유지시키면서 48시간 동안 발아시켰 으며, 발아된 싹의 길이가 1～1.5 cm 정도 된 후 발아를 정지 시키고 50
oC의 건조기(WFO-459PD, EYELA, Tokyo, Japan) 에서 2일 동안 건조시켜 수분함량을 7.0±1.0%로 조절한 후 80 mesh로 분쇄(Micro hammer cutter mill type-3, Culatti AG, Zurich, Swiss)하여 시료로 사용하였다.
추출물 제조
벼 및 발아 벼에 함유된 유효성분을 추출하기 위하여 물과 70% 에탄올을 사용하였다. 물 추출물은 시료 10 g에 증류수 500 mL을 가한 후 80
oC에서 1시간 동안 250 rpm으로 3회 추출하였으며, 추출물을 합하여 3,500 rpm으로 원심분리 하 여 침전물을 제거하고 상등액을 회전진공농축기(EYELA N-1000)로 농축한 후 동결건조(FD-5508, Ilshin Lab Co., Seoul, Korea) 하였다. 에탄올 추출물은 시료 10 g에 70%
에탄올 500 mL을 가하고 80
oC에서 3시간 동안 3회 환류추출 한 후 감압여과 하여 불용성 물질을 제거하였다. 여과된 추 출물은 회전진공농축기로 농축하여 용매를 완전히 제거한 다음 동결건조 하여 시료로 사용하였다.
암세포주 배양
본 실험에서 사용한 암세포는 HepG2(liver hepatoblastoma KCLB 88065), MCF-7(mammary gland adenocarcinoma:
KCLB 30022) 및 PC-3(prostate adenocarcinoma: KCLB 21435)를 한국세포주은행에서 분양 받아 사용하였다. 각각 의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)와 100 U/mL peni- cillin G, 50 μg/mL streptomycin을 첨가한 RPMI-1640 배지 (Gibco Co., New York, USA)와 DMEM(Gibco Co.)을 사용 하여 5% CO
2, 37
oC 배양기(EYELA, Vision scientific Co., Daejeon, Korea)에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양을 실시하였다.
암세포주 성장억제 효과 측정
발아 및 무발아 벼 추출물의 암세포 성장억제 효과를 측정 하기 위해 Ishiyama 등(12)의 방법에 따라 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay로 측정하였다. 즉, 1×10
5cell/well 농도로 96 well plate에 100 μL씩 분주한 후 37
oC, 5% CO
2배양기에서 24시 간 배양 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정 농도로 희석된 물 및 70% 에탄올 추출물 100 μL를 첨가하여 다시 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 2 mg/mL 농도의 MTT시약을 well당 10 μL씩 분주한 다음 37
oC, 5% CO
2배
양기에서 4시간 후 MTT시약이 포함된 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO) 100 μL를 가한 후 상온에서 발 색시키고, ELISA microplate reader(ELx808, Bio-tekⓇ
Inc., Winooski, VT, USA)를 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 암세포증식 억제율은 생존율로 표시하 였다.
통계분석
통계분석은 SPSS Ver 12.0 package program을 이용하여 각 측정 군의 평균과 표준편차를 산출하고 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였다.
결과 및 고찰
간암세포(HepG2) 성장억제 효과
최근 전 세계적으로 그 발병률이 급속하게 증가하고 있는 것으로 알려진 유방암, 전립선암 및 간암에 대한 항암활성을 살펴보았다. 6종의 벼 품종에 대한 발아 전후 물과 에탄올 추출물이 인체유래 간암세포주(HepG2) 성장억제에 미치는 영향을 측정한 결과 큰눈벼를 제외하고는 물 추출물보다는 에탄올 추출물이 간암세포주 성장억제 효과가 높게 나타났 다(Fig. 1). 1 mg/mL 농도에서 암세포 성장억제 효과를 살펴 보면 물 추출물의 경우 백진주 발아 및 무발아 추출물이 각 각 48.72 및 44.85%로 다른 품종에 비해 높게 나타났으며, 에탄올 추출물은 고아미 발아벼가 10.28%의 매우 낮은 생존 율을 보여 다른 품종에 비해 높은 증식억제 효과를 나타내었 다. 일품벼의 경우 무발아 에탄올 추출물에서는 42.36%의 생존율을 보인 반면 발아 시에는 동일 농도에서 27.23%의 생존율을 보여 발아 후 약 2배 정도 암세포 증식억제 효과가 증가하였다. Park 등(13)에 의하면 적미 추출물을 간암세포 주(HepG2)에 0.2 mg/mL 농도로 처리할 경우 생존율이 60%
이상으로 작았다고 보고하였는데 본 연구결과 품종은 다르 지만 동일 농도에서 유사한 결과를 나타내었다. 거대배아미 와 유색미의 발아 전후 항산화 활성을 비교한 연구에서는 발아 시 환원력과 라디칼소거능이 증가한다고 하였는데(14) 이러한 항산화물질의 증가가 본 연구에서의 암세포증식 억 제에 영향을 미친 것으로 생각된다.
전립선암세포(PC-3) 성장억제 효과
인체유래 전립선암세포주(PC-3) 성장억제에 미치는 발 아 전후 물과 에탄올 추출물의 영향을 살펴본 결과는 Fig.
2에서 보는 바와 같다. 물 추출물의 경우 에탄올 추출물에 비하여 암세포주 성장억제 효과가 작게 나타났으며, 두 추출 물 모두 저농도인 0.063～0.25 mg/mL에서는 전립선암세포 주의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났으며, 간암세포 주의 경우와는 달리 큰눈벼에서는 발아 전후 추출물 1 mg/
mL 농도에서 각각 98.45 및 70.98%의 생존율을 보여 성장억
제 효과가 거의 없는 것으로 나타났다. 일품 발아 에탄올 추
a
b
a
b
b a
b
a
a
a
b a a ab ab b c c c c
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Ilpum(EtOH) AG Ilpum(EtOH) BG Ilpum(water) AG Ilpum(water) A)
a a
a b
a
a b
a c
a
b b a a
a
b c a
b a
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V a b il it y ( % ) .
BG Goami2(EtOH) AG Goami2(EtOH) BG Goami2(water) AG Goami2(water) B)
a a
b c a
a a
c c a
c b b
b a
d b a
a a
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Baegjinju(EtOH) AG Baegjinju(EtOH) BG Baegjinju(water) AG Baegjinju(water) C)
a a
b c
ab
d b c
b c
c b
a a a
b b a
b ab
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Keunnun(EtOH) AG Keunnun(EtOH) BG Keunnun(water) AG Keunnun(water) D)
a a a a
ab
b c
b
a b
d c
b b
c
c a b
a b
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Sulgaeng(EtOH) AG Sulgaeng(EtOH) BG Sulgaeng(water) AG Sulgaeng(water) E)
b c c
b b
a b b
b b
d a a
a a
a c a a
a
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Heugkwang(EtOH) AG Heugkwang(EtOH) BG Heugkwang(water) AG Heugkwang(water) F)
Fig. 1. Antiproliferation effects of rough rice extracts before (BG) and after (AG) germination on human liver cancer cell (HepG2).
출물의 경우 0.5 및 1 mg/mL 농도에서 암세포주의 생존율은 각각 74.60 및 5.05%로 농도 증가에 따라 성장억제 효과가 뚜렷하게 나타났으며, 고아미2 발아 에탄올 추출물도 처리 농도가 0.25 mg/mL에서 0.5 mg/mL로 증가함에 따라 암세 포주 생존율은 100.05%에서 20.84%로 급격하게 감소하는 경향을 나타내었다. 설갱과 흑광벼 발아 및 무발아 에탄올 추출물의 경우 1 mg/mL 농도에서 생존율은 각각 44.52에서 64.51% 그리고 59.95%에서 72.56%로 증가하여 발아 시 성 장억제율이 높게 나타남을 알 수 있었다. 발아과정 중에는 전곡에 함유되어있는 생리활성 물질의 종류나 양이 변화하
는데, 특히 phenol성 화합물이 증가(15)되고 SOD 유사활성 과 nitrite 소거능이 증가(9)되며, 그에 따라 항염증, 항돌연 변이작용 및 항암작용이 증가(16)한다는 결과로 미루어 볼 때 본 연구에서도 발아 시 다양한 생리활성 물질의 증가에 따라 전립선암세포주의 성장억제에 영향을 미쳤을 것이라 판단되며, 추후 이러한 생리활성 물질의 규명이 필요하리라 판단된다.
유방암세포(MCF-7) 성장억제 효과
발아 전후 물과 에탄올 추출물이 인체유래 유방암세포주
a d
c c
ab
a c c
b b
a b a
a a
b c b
b b
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y (% ) .
BG Ilpum(EtOH) AG Ilpum(EtOH) BG Ilpum(water) AG Ilpum(water)
a a
b c a
a a b c
a c c
b a
a
b b a
b a
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V a b il it y ( % ) .
BG Goami2(EtOH) AG Goami2(EtOH) BG Goami2(water) AG Goami2(water)
a a
b b b
a b
b b c
d b a
a a
c b a a
a
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Baegjinju(EtOH) AG Baegjinju(EtOH) BG Baegjinju(water) AG Baegjinju(water) C)
a c
b c c
c c d
b b
b b a
a
a b b
a a
c
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Keunnun(EtOH) AG Keunnun(EtOH) BG Keunnun(water) AG Keunnun(water) D)
b c c
a b
a d c
a b
a b a b
a
a a b
a a
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Sulgaeng(EtOH) AG Sulgaeng(EtOH) BG Sulgaeng(water) AG Sulgaeng(water) E)
c b c
b bc
b b
c c
a
a a a a
a
a ab a
a b
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Heugkwang(EtOH) AG Heugkwang(EtOH) BG Heugkwang(water) AG Heugkwang(water) F)
Fig. 2. Antiproliferation effects of rough rice extracts before (BG) and after (AG) germination on human prostate cancer cell (PC-3).
(MCF-7)의 성장억제에 미치는 영향을 측정한 결과는 Fig.
3과 같다. 물과 에탄올 추출물 모두 0.063～0.25 mg/mL의 낮은 농도에서는 유방암세포주의 성장을 억제하지 못하는 것으로 나타났지만 0.5～1.0 mg/mL 농도에서는 에탄올 추 출물이 물 추출물에 비하여 유방암세포의 성장을 효과적으 로 억제하는 것으로 나타났다. 물 추출물의 경우 큰눈 발아 벼 추출물(Fig. 3D) 1 mg/mL 농도에서 68.27% 생존율을 보여 나머지 품종에 비해 높은 억제율을 보였지만 큰 효과는 없는 것으로 판단되었다. 에탄올 추출물의 경우에는 큰눈 발아벼 에탄올 추출물 1 mg/mL 농도에서 6.88%의 생존율
을 보여 간암세포주(Fig. 1)보다는 유방암세포주에 대한 성 장억제 효과가 더 뛰어난 것으로 나타났다. 특히 일품 발아 에탄올 추출물(Fig. 3A)의 경우에는 0.25 mg/mL의 낮은 농 도에서도 약 50%의 성장억제 효과를 보여 가장 우수한 항암 효과를 나타내었다. 또한 흑광벼의(Fig. 3F) 경우 0.5 mg/
mL 농도에서 발아 전에는 약 50%의 생존율을 나타냈었지 만 발아 후에는 17%로 발아에 따라 항암효과가 증가하였다.
Craig(17) 및 Adom과 Liu(18)는 전곡의 항암효과는 곡류에
함유된 영양성분 이외에 배아와 겨층에 다량 함유된 phyto-
chemicals에 의한 결과라 하였으며, López-Amorós 등(19)
a a
b b
b
a a
a a b
b c b
a a
b b d
a a
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Ilpum(EtOH) AG Ilpum(EtOH) BG Ilpum(water) AG Ilpum(water) A)
a a
b b a
a a a
b b
b b c
b
a b
c b b
a
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V a b il it y ( % ) .
BG Goami2(EtOH) AG Goami2(EtOH) BG Goami2(water) AG Goami2(water) B)
a a a
b b
a a b
b b
b b
b
a a a c b c
c
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Baegjinju(EtOH) AG Baegjinju(EtOH) BG Baegjinju(water) AG Baegjinju(water) C)
a b
c c a
a c
bc d
c
a b a a
b
b b b b
c
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Keunnun(EtOH) AG Keunnun(EtOH) BG Keunnun(water) AG Keunnun(water) D)
a b
ab b
b
a a b
c c
c b a a
a
b c
ab b
ab
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Sulgaeng(EtOH) AG Sulgaeng(EtOH) BG Sulgaeng(water) AG Sulgaeng(water) E)
b b
b c
a
a a c c
c
c c a a
a
c c b b
b
0 20 40 60 80 100 120 140
0.063 0.125 0.25 0.5 1
Concentration (mg/mL)
V ia b il it y ( % ) .
BG Heugkwang(EtOH) AG Heugkwang(EtOH) BG Heugkwang(water) AG Heugkwang(water) F)
Fig. 3. Changes in antiproliferation effects of rough rice extracts before (BG) and after (AG) germination on human mammary gland cancer cell (MCF-7).
은 발아 전후의 legume의 폴리페놀 함량 및 항산화 활성이 월등하게 증가하며, Lee 등(20)도 벼의 발아 시 비타민 E와 γ -oryzanol 함량이 증가한다 하였는데 본 연구에서도 벼를 발아시킴에 따라 이와 같은 항산화 물질들이 증가하고 그로 인하여 항암활성이 증가된 것으로 판단되며, 향후 이러한 항암성분들에 대한 연구가 필요하리라 생각된다.
요 약
발아 전후 6종의 벼(일품벼, 백진주벼, 설갱벼, 고아미2,
거대배아벼 및 흑광벼)의 물 및 에탄올 추출물에 대한 암세 포주 성장억제효과를 간암세포주(HepG2), 전립선암세포주 (PC-3) 및 유방암세포주(MCF-7)에 대하여 살펴보았다. 물 추출물은 1 mg/mL 농도에서 3종의 암세포주에 대하여 118.97～44.85% 범위의 높은 생존율을 보여 항암효과가 낮 았지만 에탄올 추출물은 90.82～5.04% 범위의 생존율을 보 여 물 추출물보다 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었다.
일품벼 발아 전후 에탄올 추출물은 간암세포주에 대하여 1
mg/mL 농도에서 각각 27.23 및 42.36%의 생존율을 보여
발아 시 항암효과가 증가하였으며, 특히 유방암세포주에 대
해서는 0.25 mg/mL 농도에서 각각 48.20 및 56.82%의 생존 율을 보여 다른 품종보다 성장억제율이 높았다. 또한 설갱벼 발아 전후 에탄올 추출물은 전립선암세포에 대하여 1 mg/
mL 농도에서 각각 44.52 및 64.51%의 생존율을 보여 발아 항암효과가 증가하였다. 추후 항암활성 물질의 분리 동정과 메커니즘 규명에 대한 연구가 수행되어야 할 것으로 판단 된다.
감사의 글
본 연구는 농촌진흥청 아젠다과제(과제번호: 200901AFT 143782462) 예산으로 추진된 연구의 일부로서 연구비를 지 원해 주신 농촌진흥청에 감사를 드립니다.
문 헌
