초미세먼지 유도성 염증반응에 대한 김( Porphyra tenera) 추출물의 개선 효과
⁃ 연구노트 ⁃
박선경․강진용․김종민․한혜주․신은진․허호진 경상대학교 응용생명과학부(BK21 Plus), 농업생명과학연구원
Improving Effect of Porphyra tenera Extract on Ultra-Fine Dust-Mediated Inflammation
Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong Min Kim, Hye Ju Han, Eun Jin Shin, and Ho Jin Heo Division of Applied Life Science (BK21 Plus), Institute of Agriculture and Life Science,
Gyeongsang National University
ABSTRACT Ultra-fine dust smaller than 2.5 µm in diameter (PM2.5) is the causative agent of numerous health hazards and systemic dysfunctions. Absorbed PM2.5 is not easily removed from the body and triggers immediate adverse effects such as oxidative stress and inflammatory-mediated reactions. To evaluate the improving effect of Porphyra tenera on PM2.5-induced toxicity, we investigated the cell protective effects in vitro, and anti-inflammatory effects in a mouse model. P. tenera was extracted using water and 80% ethanol. The water extract showed relatively higher total poly- saccharide content than the ethanolic extract, whereas the ethanolic extract had relatively high total phenolic and fla- vonoid contents. Cell protective effect was evaluated by measuring the intracellular reactive oxygen species contents and cell viability in PM2.5-induced cytotoxicity in nasal epithelial (RPMI-2650), lung epithelial (A549), and brain neuroblastoma (MC-IXC) cells. The results indicate that water extract exerts more effective cell protection. The anti-in- flammatory effect of the water extract was subsequently evaluated by measuring malondialdehyde (MDA) contents and inflammation-mediated protein expression levels in lung and brain tissue of the PM2.5-exposed mouse model.
Significant inhibition of MDA production was observed as an oxidative stress marker. The water extract also effectively regulated inflammation-mediated protein expressions in the lung tissue, including toll-like receptor (TLR)-2, TLR-4, phospho-JNK (p-JNK), and pro-inflammatory cytokines (interleukin (IL)-1β, tumor necrosis factor-α and IL-6). Further- more, exposure to the water extract also regulated the expressions of TLR-2, TLR-4, and IL-1β in the brain tissue.
Taken together, these results indicate the potential of P. tenera extracts as immunomodulators of PM2.5-mediated inflammation.
Key words: anti-inflammation, cell protection, PM2.5, Porphyra tenera, ultra-fine dust
Received 2 December 2019; Accepted 16 January 2020 Corresponding author: Ho Jin Heo, Division of Applied Life Science (BK21 Plus), Institute of Agriculture and Life Science, Gyeongsang National University, Jinju, Gyeongnam 52828, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-55-772-1907
Author information: Seon Kyeong Park (Graduate student), Jin Yong Kang (Graduate student), Jong Min Kim (Graduate student), Hye Ju Han (Graduate student), Eun Jin Shin (Graduate student), Ho Jin Heo (Professor)
서 론
세계보건기구는 미세먼지에 대한 가이드라인을 제시해왔 고, 2013년에는 국제암연구소에서 대기오염과 미세먼지를 1군 발암물질로 지정하면서 인체 위험성을 경고하고 있다 (WHO, 2016). 2016년 경제협력개발기구(OECD, 2016) 보 고서에 따르면 실외 미세먼지와 오존으로 인한 조기 사망률 이 중국, 인도, 카스피해 인근, 한국 순으로 높았으며, OECD 국가 중에서는 우리나라가 미세먼지에 의해 가장 높은 조기
사망률을 보이는 것으로 나타났다(Jo 등, 2018).
미세먼지(particulate matter, PM)는 대기 중에 떠다니 는 황산화물(SOx2-), 질소산화물(NOx-), 납(Pb), 오존(O3), 일산화탄소(CO) 등과 함께 수많은 오염물질을 포함하는 미 세한 먼지를 말하는 것으로 공기역학적 지름에 따라 분류된 다. PM의 표면적 크기는 염증 및 산화적 손상과 관련된 다양 한 질병의 유발매개변수라는 사실이 밝혀졌으며, PM10은 폐 포 내 대식세포에만 흡수되지만 입경 2.5 μm 이하의 초미세 먼지(PM2.5)는 폐포 내 대식세포뿐만 아니라 기도의 상피세 포에서의 염증반응, 심혈관 질환, 신경-정신질환 등 인체에 미치는 영향성이 매우 큰 것으로 보고되고 있다(Zhang 등, 2014). 특히 미세먼지는 비강/구강 및 호흡기, 심혈관 및 위장관 경로를 통하여 전신 순환뿐만 아니라 후각상피 세포 를 통하여 직접적으로 뇌 내피세포로 전달되어 뇌조직에서 도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 뇌조직으로 전달된 미세먼지는 reactive oxygen species(ROS)의 생성 및 toll- like receptor(TLR)와 결합함으로써 세포 내 inflammasome
을 형성하고 pro-inflammatory cytokine[interleukin(IL) -1β, tumor necrosis factor(TNF)-α, interferon(IFN)- γ]을 발현시킨다. 발현된 염증성 인자들은 중추신경계의 염 증반응을 유도함으로써 신경염증을 유발하며, 최종적으로 는 amyloid-beta peptide 생성 및 Tau 과산화를 유도하여 알츠하이머 질병과 같은 인지기능 장애를 유발할 수 있다 (Calderón-Garcidueñas 등, 2012). 이러한 까닭에 우리나 라에서는 미세먼지에 대한 건강피해를 낮추기 위해 미세먼 지 관리 종합대책을 수립하여 미세먼지 저감 대책과 보호 대책을 마련하였지만, 미세먼지 농도가 개선되기 위해서는 장기적으로 시간이 소요될 수밖에 없기 때문에 초미세먼지 로 유도될 수 있는 산화적 스트레스와 염증반응을 예방 및 개선시킬 수 있는 소재에 관한 연구가 필요하다고 판단된다.
최근 육상자원고갈로 해양자원을 활용한 연구가 주목을 받고 있으며, 특히 해조류는 다양한 생리활성물질을 함유한 식품소재로써 연구 중요성이 대두되고 있다(Lee 등, 2017).
우리나라 연안에 분포하는 해조류는 약 600여 종이며 그중 김은 2014년도 기준으로 397천 톤으로 전체 해조류의 36.2
%로 가장 많은 생산량을 가지고 있다. 김(Porphyra tenera) 은 보라털 목 보라털 과 김 속에 속하는 홍조류로 해태(海 苔), 해의(海衣), 해우라고도 부르며, 아시아 지역인 우리나 라, 일본, 중국 등지에서 널리 섭취되고 있다(Lee 등, 2017).
김에는 비타민 A, 칼슘 및 요오드를 포함하는 무기질, 콜레 스테롤을 낮추는 taurine 등이 풍부하며, 다른 해조류와 달 리 threonine, tryptophan, methionine과 같은 필수 아미노 산이 풍부하다. 더불어 단백질 함량이 높고 열량이 낮아 식 물성 고단백식품으로 알려져 있다(An과 Koo, 2017; Noda, 1993). 또한 김에 함유된 페놀성 화합물, 플라보노이드는 항산화 활성 및 아질산염 소거능을 가지는 것으로 보고되고 있다(Heo 등, 2006). 김에 존재하는 복합다당체에는 3,6- anhydro-L-galactose와 ester sulfate로 구성된 포피란 (porphyran)이 가장 대표적이며, xylose, mannose로 이루 어진 hemicellulose와 같은 김 고유의 복합당 또한 보고되 고 있다(An과 Koo, 2017). 특히 porphyran이 나타내는 항 산화, macrophage 활성화, 혈중 콜레스테롤 저하, 항암, 면 역 활성 및 항염증에 대한 연구들이 보고되고 있으며, 식품 이상의 가치를 지닌 기능성 소재로의 가능성이 대두되고 있 다(An과 Koo, 2017; Jiang 등, 2012; Lee 등, 2015). 따라 서 본 연구에서는 김을 활용하여 초미세먼지에 노출된 다양 한 세포 및 동물 조직에서 그 보호 효과를 검증함으로써 초 미세먼지 유도성 관련 질환 및 예방 소재로의 가능성을 확인 하고 이를 산업화 기초자료로 활용하고자 하였다.
재료 및 방법
실험재료 및 추출물 제조
본 실험에 사용된 김(P. tenera)는 2018년 2월 전라남도 완도에서 채취된 것을 구입하였으며, 염분 및 불순물 제거를
위하여 흐르는 물에 수세하였다. 수세된 김은 동결건조기 (Ilshin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea)를 이용하여 건조시 키고 분말화하여 냉동보관(-20°C)하였다. 김 추출물은 건 조분말 10 g에 물(증류수)과 80% 에탄올을 각각 500 mL 첨가하여 40°C에서 2시간 동안 환류냉각기를 사용하여 추 출하였다. 추출물은 No. 2 거름종이(Whatman Inc., Kent, UK)를 사용하여 진공 여과하였다. 여과액은 회전진공농축 기(N-N series, EYELA Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축 후 동결건조 하여 냉동보관(-20°C)하며 실험에 사용 하였다.
총 페놀성 화합물 함량 측정
총 페놀성 화합물 함량은 추출물 1 mL에 증류수 9 mL와 Folin-Ciocalteu reagent 1 mL를 혼합하였고, 상온에서 5 분 동안 반응시켰다. 이후 7% sodium carbonate 용액 10 mL와 증류수 4 mL를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응 시켰다. 최종 반응물은 분광광도계(spectrophotometer, UV-1601, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 760 nm 에서 흡광도를 측정하였고 갈산을 사용하여 작성된 보정선 에 대입하여 총 페놀성 화합물 함량을 계산하였으며, 이를 갈산 당량(mg gallic acid equivalent(GAE)/g of dried weight)으로 나타냈다(Park 등, 2019).
총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 추출물 1 mL에 diethylene gly- col 10 mL와 sodium hydroxide 1 mL를 혼합하여 30°C에 서 1시간 동안 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 총 플라보노이드 함량의 계산은 루틴을 사용하여 작성된 보정선에 대입하여 총 플라보노이드 함량을 계산하였고 이 를 루틴 당량(mg RE(rutin equivalent)/g of dried weight) 으로 나타냈다.
총 polysaccharide 함량 측정
총 polysaccharide 함량은 추출물에 5% phenol 용액과 sulfuric acid 1 mL를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값은 glucose를 사용하여 작성된 보정선에 대입하여 총 poly- saccharide 함량을 계산하였다(Mohammed 등, 2013).
세포 배양
본 실험에 사용된 비강세포(RPMI-2650)는 한국세포주 은행(Seoul, Korea)으로부터 구입하여, 10% fetal bovine serum(FBS) 및 1% 페니실린(50 units/mL)/스트렙토마이신 (100 μg/mL)이 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) 배지를 사용하여 배양하였다. 폐세포(A549) 는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 구입하여 10% bovine calf serum(CS) 및 1% 페니실린(50 units/mL)/스트렙토마이신(100 μg/mL)
이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle medium을 배양액 으로 사용하였다. 뇌신경세포(MC-IXC) 역시 ATCC로부터 구입하여 10% FBS 및 1% 페니실린(50 units/mL)/스트렙 토마이신(100 μg/mL)이 포함된 minimum essential me- dium을 배양액으로 사용하여 37°C에서 5% CO2 조건하에 배양하였다.
세포 내 ROS 생성 함량 측정
세포 내 ROS 생성 억제 효과는 96-well plate에 1×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시 간 후 0.5% FBS 또는 CS가 포함된 배지로 교환하여 시료를 처리하고 30분 후 초미세먼지(PM2.5)를 최종농도가 100 μg/
mL 되도록 전처리하여 24시간 동안 배양시켰다. 그 후 50 μM dichlorofluorescin diacetate를 처리하여 40분간 반응 시켜 형광광도계(Infinite F200, Tecan, Männedorf, Switz- erland)를 사용하여 485 nm(excitation wave) 및 535 nm (emission wave)에서 형광강도를 측정하였다(Park 등, 2019).
세포 생존율 측정
세포 생존율 측정은 시료와 초미세먼지를 전처리한 세포 에 MTT stock solution(10 mg/mL)을 처리하여 2시간 동 안 반응시켰다. 생성된 formazan crystal은 배지를 모두 제 거하고 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 20분간 상온에서 녹 여낸 후 microplate reader(Epoch 2, BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 570 nm(determi- nation wave) 및 650 nm(reference wave)에서 흡광도를 측정하였다(Park 등, 2019).
동물실험 디자인
본 실험에 사용된 동물은 6주령의 수컷 BALB/c 마우스로 Samtako(Osan, Korea)로부터 구입하였으며, 온도 22±2°C, 상대습도 50±5%를 유지하며 충분한 물과 사료를 지급하는 일정한 사육환경을 유지하였다. 모든 실험은 경상대학교 동물 실험 윤리위원회(IACUC 승인번호: GNU-180927-M0050) 의 승인 하에 수행하였다. 실험동물은 반입 1주일 동안의 적응 기간을 거친 후 정상대조군(normal control; NC), 초 미세먼지군(PM2.5) 및 김 추출물 식이군으로 나누어 4주 동 안 사육하였다. 초미세먼지군과 김 추출물 식이군은 whole body exposure 챔버 내에서 500 μg/m3의 농도로 일주일에 5회 미세먼지에 노출시켰으며, 정상대조군은 여과된 공기를 주입시켰다. 김 추출물 식이군은 음용수에 김 물 추출물을 녹인 후 노출 전 50 mg/kg of body weight 농도로 경구 투여하였다.
조직 내 지질과산화물 함량 측정
조직 내 지질과산화물(malondialdehyde; MDA) 측정을 위하여 실험동물을 희생시켜 뇌조직과 폐조직을 분리하였
다. 분리된 뇌조직과 폐조직에 phosphate-buffered saline 을 넣고 bullet blender(Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA)를 사용하여 균질화하였고, 원심분리(10,000×g, 10분, 4°C) 하여 상층액을 실험에 이용하였다. 상층액에는 1% phosphoric acid와 0.67% thiobarbituric acid(TBA) 를 혼합하여 water bath(95°C)에서 1시간 동안 반응시켰 고, 생성된 MDA-TBA 복합체는 532 nm에서 흡광도를 측 정하였다. MDA 함량은 표준곡선에 대입하여 mg protein에 대한 함량으로 표시하였다.
단백질 발현량 측정
뇌조직과 폐조직을 1% protease inhibitor cocktail (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)이 포함된 RIPA 용액(ProtinExTM Animal cell/tissue, GeneAll Bio- technology, Seoul, Korea)을 사용하여 균질화하였다. 균 질화된 조직은 원심분리(13,000×g, 15분, 4°C) 하여 상층 액을 실험에 사용하였다. TLR-2, TLR-4, p-JNK, TNF-α, IL-1β 및 β-actin은 western blot 분석방법을 이용하여 측 정하였다. Loading buffer(5×)와 혼합된 상층액은 95°C에 서 7분간 반응시켜 전처리하여 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)에서 단 백질을 분리하였다. 이후 poly-vinylidene difluoride(PVDF) 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)에 이동시켰다.
단백질이 이동된 PVDF 멤브레인은 5% skim milk(Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액으로 blocking 하여 희석된 1차 항체(1:1,000)와 10시간 동안 4°C에서 반응시 켰다. 반응된 멤브레인은 0.1% Tween20이 포함된 tris- buffered saline 용액에서 3회 세척하여 상온에서 2차 항체 와 반응시켰다. 멤브레인은 chemiluminescence(Bionote, Hwaseong, Korea)를 이용하여 band를 발현시켰고, iBrightTM CL1000 Imaging System(Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)을 이용하여 측정하였다. IL-6는 ELISA kit(BioLeg- end, San Diego, CA, USA)을 이용하여 측정하였다.
통계처리
모든 실험은 평균±표준편차로 나타냈으며, 각 평균값에 대한 유의성 검증은 SAS Software 9.4(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 실시하고, Duncan의 다중범위검정법 (Duncan’s multiple range test)으로 각 시료 간의 유의차 를 5% 수준(P<0.05)에서 검증하였다.
결과 및 고찰
총 페놀성 화합물, 플라보노이드 및 polysaccharide 함량 분석
총 페놀성 화합물, 플라보노이드 및 polysaccharide 함량 을 분석한 결과는 Table 1과 같다. 총 페놀성 화합물 함량 측정 결과는 80% 에탄올 추출물(13.58±0.95 mg GAE/g
Table 1. Total phenolic, flavonoids, and polysaccharide contents of water and 80% ethanolic extracts from Porphyra tenera Water extract 80% EtOH extract Total phenolic contents (mg GAE/g of dried weight)
Total flavonoid contents (mg RE/g of dried weight) Total polysaccharide contents (%)
11.83±2.53b1) N.D.2) 46.23±0.39a
13.58±0.95a 66.16±7.35 19.14±0.53b
1)Results were shown statistically considered at P<0.05, and different small letters represent a statistical difference.
2)Not detected.
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Intracellular ROS contents in RPMI-2650 cells . (DCF formation, % of control) .
Water extract 80% ethanolic extract
g
f e e de c b c b b b b b
h a
A
PM2.5
Samples (μg/mL)
-
- +
- +
Vit.C 100 μM
+
1 +
2 +
5 +
10 +
20 +
50
0 100 200 300 400 500 600 700
Intracellular ROS contents in A549 cells . (DCF formation, % of control) .
Water extract 80% ethanolic extract
h
g f d e d e e c b b e b
h a
B
PM2.5
Samples (μg/mL)
- -
+ -
+ Vit.C 100 μM
+ 1
+ 2
+ 5
+ 10
+ 20
+ 50
0 50 100 150 200 250 300 350
Intracellular ROS contents in MC-IXC cells . (DCF formation, % of control) .
Water extract 80% ethanolic extract
h i
e
g d
f c e bc d d b b
j
C a
PM2.5
Samples (μg/mL)
- -
+ -
+ Vit.C 100 μM
+ 1
+ 2
+ 5
+ 10
+ 20
+ 50
Fig. 1. Intracellular ROS contents of water and 80% ethanolic extracts from P. tenera on PM2.5-induced oxidative stress in RPMI-2650 (A), A549 (B), and MC-IXC (C) cells. Results were shown statistically considered at P<0.05, and different small let- ters in the graph represent a statistical difference.
of dried weight)에서 물 추출물(11.83±2.53 mg GAE/g of dried weight) 대비 높은 함량을 나타내었으며, 총 플라 보노이드 함량은 물 추출물에서는 검출되지 않았으며 80%
에탄올 추출물에서는 66.16±7.35 mg RE/g of dried of weight로 상대적으로 높은 함량을 나타냈다. 총 polysac- charide 함량을 분석한 결과는 물 추출물(46.23±0.39%)에 서 80% 에탄올 추출물(19.14±0.53%)보다 약 2.41배 높은 함량을 나타냈다.
국내 자생 해조류 10종(감태, 곰피, 대황, 매생이, 모자반, 미역, 지충이, 청각, 톳, 파래)의 총 페놀성 화합물 및 플라보 노이드 함량을 측정한 결과는 공통으로 에탄올 추출물이 물 추출물보다 더 높은 함량을 나타냈다(Kim 등, 2015a). 플라 보노이드를 포함한 페놀성 화합물의 함량은 해조류의 항산 화 활성(라디칼 소거 활성, SOD 유사 활성, 환원력 및 지방 산패 억제 효과)과의 연계성을 나타내었으며, 산화방지 활 성 및 항노화 등 건강 기능성에 중요한 인자로 작용하는 것 으로 보고되고 있다. 또한 polysaccharide는 해조류의 주성 분으로 독특한 구조적인 특성으로 인해 생리활성이 강한 물 질로 알려져 있으며, 면역력 증강 및 항암 효과와도 관련된 것으로 보고되고 있다(Venkatesan 등, 2015).
초미세먼지(PM2.5) 유도성 세포 내 ROS 생성 억제 효과 비강세포(RPMI-2650)에서 초미세먼지 처리군(325.99%) 은 대조군(100.00%) 대비 약 3.26배 증가한 세포 내 ROS 함량을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용된 비타민 C는 약 72.29%로 효과적인 세포 내 ROS 생성을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 1A). 반면 김 추출물 처리군에서는 5 μg/mL 이상의 농도에서 80% 에탄올 추출물이 물 추출물 대비 상대 적으로 높은 세포 내 ROS 생성 억제 효과를 나타냈으며, 50 μg/mL 농도에서 80% 에탄올 추출물(143.03%)과 물 추출 물(198.87%)은 초미세먼지에 대하여 효과적으로 비강세포 내 ROS 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
폐세포(A549)에서 초미세먼지 처리군(596.70%)은 대조 군(100.00%) 대비 약 5.97배 증가한 세포 내 ROS 함량을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용된 비타민 C는 약 109.98
%로 대조군과 유의적인 수준으로 세포 내 ROS 생성을 억제 시켰다(Fig. 1B). 김 추출물은 80% 에탄올 추출물이 물 추 출물 대비 상대적으로 높은 ROS 생성 억제 효과를 나타냈으 며, 50 μg/mL 농도에서 80% 에탄올 추출물(306.20%)은 물 추출물(374.14%) 대비 유의적으로 높은 ROS 생성 억제 효과를 나타냈다.
0 20 40 60 80 100 120
Cell viability in RPMI-2650 cells . (MTT reduction, % of control) .
Water extract 80% ethanolic extract a
g b c cd e de e de e e f f cd c
A
PM2.5
Samples (μg/mL)
-
- +
- +
Vit.C 100 μM
+
1 +
2 +
5 +
10 +
20 +
50
0 20 40 60 80 100 120
Cell viability in A549 cells . (MTT reduction, % of control) .
Water extract 80% ethanolic extract bc
B
h a bcd bc ab bcd f efcde f fg def g
bcd
PM2.5
Samples (μg/mL)
- -
+ -
+ Vit.C 100 μM
+ 1
+ 2
+ 5
+ 10
+ 20
+ 50
0 20 40 60 80 100 120
Cell viability in MC-IXC cells . (MTT reduction, % of control) .
Water extract 80% ethanolic extract a
C
h ab
g bc
f ef dbc cdb cdcd d ef
PM2.5
Samples (μg/mL)
- -
+ -
+ Vit.C 100 μM
+ 1
+ 2
+ 5
+ 10
+ 20
+ 50
Fig. 2. Cell viability of water and 80% ethanolic extracts from P. tenera on PM2.5-induced cytotoxicity in RPMI-2650 (A), A549 (B), and MC-IXC (C) cells. Results were shown statisti- cally considered at P<0.05, and different small letters in the graph represent a statistical difference.
뇌신경세포(MC-IXC)에서는 초미세먼지 처리군(324.11
%)에서는 대조군(100.00%) 대비 약 3.24배 증가한 세포 내 ROS 함량을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용된 비타민 C는 약 71.96%로 대조군보다 더 낮은 세포 내 ROS 생성을 억제시켰다(Fig. 1C). 김 추출물은 80% 에탄올 추출물이 물 추출물 대비 상대적으로 높은 ROS 생성 억제 효과를 나타냈 으며, 50 μg/mL 농도에서 80% 에탄올 추출물(91.04%)은 대조군보다 낮은 수준의 ROS 함량을 나타냈으며, 물 추출물 (252.57%)과의 비교 시에도 우수한 ROS 생성 억제 효과를 나타냈다.
초미세먼지(PM2.5) 유도성 세포독성에 대한 세포 생존율 측정
비강세포(RPMI-2650)에서 초미세먼지 처리군(42.55%) 에서는 대조군(100.00%) 대비 약 57.45%의 세포 사멸을 나 타냈으며, 양성대조군으로 사용된 비타민 C는 44.26%의 생 존율을 나타냈다(Fig. 2A). 김 물 추출물은 농도 50 μg/mL (45.45%)에서 양성대조군과 통계적으로 유의적인 결과를 나타냈다. 반면 80% 에탄올 추출물 20 μg/mL(49.88%)에 서 초미세먼지 처리군 대비 증가한 세포 생존율을 나타냈으 며, 50 μg/mL 농도에서는 오히려 감소한 세포 생존율을 나 타냈다.
폐세포(A549)에서 초미세먼지 처리군(81.01%)에서는 대 조군(100.00%) 대비 약 18.99%의 세포사멸이 유도되었으 며, 비타민 C 처리군은 92.79%로 증가한 세포 생존율을 나 타냈다(Fig. 2B). 반면 김 추출물은 2 μg/mL 이상의 농도에 서부터 점차 증가하는 세포 생존율을 나타냈으며, 물 추출물 에서는 10 μg/mL(97.56%)에서 대조군과 통계적으로 유의 적인 결과를, 80% 에탄올 추출물에서는 5 μg/mL 농도에서 유의적인 결과를 나타냈다. 반면 80% 에탄올 추출물의 경우 50 μg/mL에서는 오히려 감소한 세포 생존율을 나타냈다.
뇌신경세포(MC-IXC)에서 초미세먼지 처리군(65.95%) 에서는 대조군(100.00%) 대비 약 34.05%의 세포사멸이 유 도되었으며, 양성대조군으로 사용된 비타민 C의 경우 76.87
%로 개선된 세포 생존율을 나타냈다(Fig. 2C). 김 물 추출물 과 80% 에탄올 추출물 모두 1 μg/mL의 농도에서 양성대조 군과 유사한 세포 생존율을 나타냈으며, 물 추출물의 경우 농도 50 μg/mL 농도(95.40%)에서 대조군보다 다소 낮지만 유사한 생존율을 나타냈다. 반면 80% 에탄올 추출물의 경우 농도 10 μg/mL 이상에서 오히려 감소하는 경향을 나타냈다.
미세먼지에 의한 산화적 스트레스 생성 경로는 명확하게 밝혀져 있지 않지만, 다양한 경로에 의하여 ROS의 생성 및 염증반응을 활성화시킴으로써 세포의 기능 저하를 유도하 는 것으로 알려져 있다. 특히 세포막에서 직접적으로 ROS의 생성을 유도하거나 polycyclic aromatic hydrocarbon 및 quinone과 같은 물질들은 산화-환원 관련 대사의 활성화를 통하여 ROS 및 반응성이 큰 친전자성 대사산물들(O2･-, H2O2, O2･-, ･OH)을 생성하게 되고, 세포막에 존재하는 re-
ceptor[epidermal growth factor receptor(EGFR), TLRs 및 nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)- like receptors(NLRs)], 세포 내 kinase[phosphoinositide 3-kinase(PI3K), Src 및 mitogen-activated protein kin- ases(MAPKs)], protein tyrosine phosphatase(PTPs) 및 전사인자들[nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2) 및 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells(NF-κB)]의 발현 및 활성을 유도하면
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
MDA contents . (nmole/mg of protein) .
Lung tissue Brain tissue
c
ab'
bc a'
b' a
Normal control PM2.5 exposure (500 μg/m3)
Water extract from P. tenera
Fig. 3. Inhibitory effect of water extract from P. tenera against lipid peroxidation in lung and brain tissues of PM2.5-exposed mice. Results were shown statistically considered at P<0.05, and different small letters in the graph represent a statistical difference.
서 세포의 염증반응을 개시한다(Øvrevik 등, 2015; Yan 등, 2016). 최근의 연구(Heo 등, 2006)에 따르면 26종의 홍조 류에서 메탄올과 물을 이용하여 온도별(20, 70°C)로 추출한 추출물에서의 총 페놀성 화합물 함량은 메탄올 추출물이 물 추출물 대비 높은 함량을 나타냈지만, 항산화 활성은 동일한 경향성을 나타내지 못하였다. 또한 김 추출물에서는 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl 라디칼/superoxide anion(O2-) /hydrogen peroxide(H2O2) 소거 활성은 메탄올 추출물이 높게 나타났지만, hydroxyl 라디칼(HO･) 소거 활성은 물 추 출물에서 높게 나타났다. 일반적으로 해조류 추출물에서 나 타나는 항산화 활성은 fucoxanthin, phlorotannins 및 다른 페놀성 화합물 의한 것으로 추정된다고 보고되고 있지만, 이러한 연구 결과는 홍조류에서 나타나는 항산화 활성은 페 놀성 화합물에 국한된 것으로 보기 어렵다고 판단된다. Ngo 와 Kim(2013)의 연구에서는 해조류가 갖는 생리활성 기능 을 polysaccharides와의 관련성으로 보고하고 있으며, 특 히 홍조류의 carrageenan, 갈조류의 fucoidan, 녹조류의 ulvan과 같은 sulfated polysaccharide에 의한 항산화, 항 알레르기, 항응고 및 항암 효과를 나타낸다고 보고하였다.
따라서 본 실험에서 초미세먼지에 노출된 3가지 세포에서 물 추출물이 공통으로 나타내는 세포 보호 효과는 80% 에탄 올 추출물 대비 상대적으로 높은 함량을 나타내는 poly- saccharide에 의한 것으로 추측되며, 초미세먼지에 노출된 동물에 대한 개선 효과는 in vitro 세포 보호 효과의 결과를 바탕으로 물 추출물로 선정하여 진행하였다. 반면 김 80%
에탄올 추출물은 3가지 세포주에서 공통으로 농도가 증가함 에 따라 세포사멸을 오히려 촉진하는 결과를 나타냈다. 최근 의 연구(Kim 등, 2015b)에 따르면 김 에탄올 추출물의 경우 구강암(YD-10B) 세포주에서 미토콘드리아 apoptosis 관 련 단백질인 caspase, poly ADP-ribose polymerase, B- cell lymphoma-2와 같은 단백질 조절을 통해 세포사멸을 유도함으로써 항암 효능을 지닌 천연물 의약품으로의 가능 성을 제시하였다. 본 연구의 결과에서도 상대적으로 고농도 에서 나타나는 김 80% 에탄올 추출물의 세포사멸은 미세먼 지로 유도된 손상된 세포에서 오히려 apoptosis가 일부 유 도된 것으로 판단된다. 다만 보다 정확한 관련 기작은 각 추출물의 물질 분석 및 세포 내에서의 세포사멸 작용기전 등에 대한 추가 연구로 확인할 필요가 있을 것이다.
초미세먼지(PM2.5)에 노출된 마우스 폐 및 뇌조직 지질과산 화 억제 효과
한 달간 초미세먼지에 노출된 마우스 폐 및 뇌조직에서의 지질과산화물(MDA) 함량을 측정한 결과는 Fig. 3과 같다.
초미세먼지 노출군(2.47 mmole/mg of protein)의 폐조직 에서는 대조군(1.60 mmole/mg of protein) 대비 약 1.54배 증가한 지질과산화물(MDA) 함량을 나타냈으며, 김 물 추출 물 섭취군에서는 1.80 mmole/mg of protein으로 초미세먼 지 노출군 대비 효과적인 생성 억제 효과를 나타냈다. 뇌조
직에서의 지질과산화물(MDA) 함량을 측정한 결과는 대조 군(2.31 mmole/mg of protein) 대비 초미세먼지 노출군 (3.15 mmole/mg of protein)에서 약 1.36배 증가한 함량을 나타냈으며, 김 물 추출물 섭취군(2.51 mmole/mg of pro- tein)에서는 초미세먼지 노출군 대비 다소 감소한 지질과산 화물(MDA) 함량을 나타냈다.
MDA는 hydroxyl radical에 의해 불포화지방산이 산화 되면서 생성되는 aldehyde의 일종으로 산화적 스트레스에 의한 조직 손상을 확인할 수 있는 대표적인 생체 지표 중 하나이다. 미세먼지에 대한 명확한 메커니즘은 아직 밝혀지 지 않았지만, ROS 형성에 대한 다양한 잠재적인 원인 중 초미세먼지에는 As, Cr 및 Cd와 같은 중금속들이 존재하는 데 이러한 물질들은 metal-catalyzed ROS의 생성을 촉진 하여 조직 내 산화적 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Choi 등, 2004). 홍조류의 항산화 활성은 sulfated poly- saccharide에 의한 것이라는 많은 연구들이 보고되어 있으 며, 홍조류에 존재하는 carrageenan(iota, kappa, lambda) 은 sulfated galactan 계열의 물질로 그 구조적 차이에 따른 항산화 활성이 다르게 나타난다. Lambda carrageenan은 superoxide 소거 활성, iota carrageenan은 hydroxyl 라디 칼 소거 활성, kappa carrageenan은 MDA 생성 억제 효과 가 가장 뛰어난 것으로 보고되며, 이러한 결과는 갈조류의 대표적인 항산화능을 가지는 sulfated polysaccharide인 fucoidan과 비교 시에도 우수한 결과를 나타낸다고 보고하 였다(Rocha de Souza 등, 2007). 또한 Porphyra 속에서 주로 발견되는 sulfated galactan의 일종인 porphyrin은 20 개월된 노령 마우스 모델의 간과 뇌조직에서 superoxide dismutase와 glutathione peroxidase의 활성화를 통하여 조직의 항산화 능력을 증가시켰고 최종적으로 지질과산화물 (MDA) 생성 억제를 유도하였다(Zhang 등, 2004). 또한 sul- fated polysaccharide들이 구성하고 있는 카르복실기와 황 산기는 유해 중금속 및 양이온의 배출 효과가 있는 것으로도 보고되고 있어(Kim 등, 2000), 미세먼지에 존재하는 중금속
NC PM2.5 P. tenera TLR-2
TLR-4 p-JNK IL-1β TNF-α β-actin
A
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Relative protein expression . in lung tissue .
Normal control (NC) PM2.5 exposure (500 ug/m3) Water extract from P. terena
b b
a
b
b a
b a a b b a a ab a
B PM2.5 exposure (500 μg/m3)
P . tenera
TLR-2 TLR-4 p-JNK IL-1β TNF-α
0 2 4 6 8 10 12
IL-6 contents in lung tissue . (pg/mg of protein) .
b b
C a
Normal control PM2.5 exposure (500 μg/m3)
Water extract from P. tenera
Fig. 4. Effect of water extract from P. tenera in lung tissues of PM2.5-induced neuroinflammatory mice. Band images (A), rel- ative protein expression (B), and IL-6 contents (C). Results were shown statistically considered at P<0.05, and different small let- ters in the graph represent a statistical difference.
의 배출을 통하여 조직에서의 ROS 생성 억제를 통한 지질과 산화물(MDA) 생성 억제에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된 다. 따라서 본 연구에서는 초미세먼지의 노출은 호흡기관인 폐뿐만 아니라 뇌조직에 미치는 영향을 확인할 수 있었으며, 물 추출물은 효과적으로 미세먼지 유도성 산화적 스트레스 에 대한 항산화제로의 가능성이 있을 것으로 판단된다.
초미세먼지(PM2.5)에 노출된 마우스 폐조직 염증 관련 지표 변화
초미세먼지의 메커니즘은 궁극적으로 염증반응을 조절하 는 것이며, 대표적으로 제시되는 메커니즘은 세포막의 TLRs 와 결합함으로써 NF-κB의 경로의 활성화를 유도한다. In- hibitor of κB(IκB)는 NF-κB와의 결합을 통하여 NF-κB의 기능을 억제시키고 있는데 염증반응이 개시되면 IκB가 인산 화됨으로써 NF-κB는 핵 내로 이동하게 되어 pro-inflam- matory cytokine(TNF-α, IL-6, IL-8, IFN-γ)들의 발현을 유도한다. 뿐만 아니라 TLRs은 cytosol에서 NLR family, pyrin domain containing-3의 활성화를 유도하는데 이는 inflammasome이라는 단백질 복합체를 생성하게 되고, cas- pase-1의 활성화를 통하여 pro-inflammatory cytokine인 IL-1β를 활성화시켜 염증반응을 유도한다. 또한 IL-1β는 세포막에 존재하는 IL-1 receptor와 결합하여 NF-κB의 경 로를 활성화시킴으로써 염증반응을 연쇄적으로 촉발시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
초미세먼지에 노출된 마우스 폐조직에서의 염증 관련 지 표들의 변화를 확인한 결과는 Fig. 4와 같다. 초미세먼지에 노출된 마우스의 폐조직에서는 TLR-2의 발현이 증가하였 지만, TLR-4와의 상관관계는 확인할 수 없었다. 또한 초미 세먼지는 cytosol에서 MAPK 경로 중 JNK의 인산화(p- JNK)를 유도하는 것으로 나타났으며, 최종적으로는 pro- inflammatory cytokine(IL-1β, TNF-α, IL-6)의 발현량을 증가시키는 것으로 나타났다. 반면 김 물 추출물 섭취군의 경우 TLR-2 등의 감소를 유도함으로써 최종적으로 폐조직 내에 pro-inflammatory cytokine(IL-1β, TNF-α, IL-6) 의 발현량을 감소시켜 폐조직에서의 염증반응을 효과적으 로 개선하는 것으로 나타났다.
초미세먼지(PM2.5)에 노출된 마우스 뇌조직 염증 관련 지표 변화
초미세먼지에 노출된 마우스 뇌조직에서의 염증 관련 지 표들의 변화를 확인한 결과는 Fig. 5와 같다. 뇌조직에서는 폐조직에서와 유사하게 TLR-2의 발현을 증가시키는 반면 TLR-4 발현과의 상관관계를 확인할 수 없었다. 뿐만 아니 라 p-JNK 발현 증가를 유도하였으며, pro-inflammatory cytokine 중 IL-1β의 발현은 크게 증가시켰지만 IL-6 발현 에는 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 또한 김 물 추출물의 섭취는 TLR-2, TLR-4의 발현 감소를 유도하였 으며, 초미세먼지의 노출에 의하여 증가한 p-JNK에서 개선
에는 유의적 효과를 나타내지 못하였고, 최종적으로 pro- inflammatory cytokine인 IL-1β의 발현은 효과적으로 감 소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 김 물 추출물은 폐와 뇌조직에서 초기 염증 개시 단계에서 TLRs로 개시되 는 반응을 효과적으로 억제해줄 수 있을 것으로 판단된다.
미세먼지의 노출에 의한 세포 기능 저하는 다양한 메커니 즘에 의한 것으로 그 중심에는 염증반응의 활성화와 관련된 것으로 보고되고 있다(Øvrevik 등, 2015). Porphyra 속에 는 많은 polysaccharide가 함유하는 것으로 알려져 있으며, galactose, 3,6-lactone galactose 및 sulfate group으로 구성된 galactosan sulfate가 대표적인 물질로써 약 20~40
NC PM2.5 P. tenera TLR-2
TLR-4 p-JNK IL-1β β-actin
A
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Relative protein expression . in brain tissue .
Normal control (NC) pm2.5 exposure (500 ug/m3) water extract from p.terena
PM2.5 exposure (500 μg/m3) Water extract from P . tenera
c
B
b a
c a a
b b a a
b a
TLR-2 TLR-4 p-JNK IL-1β
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
IL-6 contents in brain tissue . (pg/mg of protein) . a a
a
C
Normal control PM2.5 exposure (500 μg/m3)
Water extract from P. tenera
Fig. 5. Effect of water extract from P. tenera in brain tissues of PM2.5-induced neuroinflammatory mice. Band images (A), relative protein expression (B), and IL-6 contents (C). Results were shown statistically considered at P<0.05, and different small letters in the graph represent a statistical difference.
%를 차지하는 것으로 보고되었다(Fu 등, 2019). Porphyra 속으로부터 분리한 sulfated polysaccharide를 식이한 BALB/c 마우스 모델에서 Porphyra haitanensi로 분리한 polysaccharide는 T 세포에서 신호를 직접 활성화함으로 써 기능 조절을 유도하였고, Porphyra yezoensis에서 분리 한 polysaccharide는 수지상세포의 증식 및 성숙을 통해 간접적인 방식으로 면역기능을 조절하는 것으로 보고되었 다(Fu 등, 2019). 공통으로는 NF-κB의 신호전달 경로 조 절, Th1, Th2 및 regulatory T cells(T regs) 분화 및 활성 화를 촉진 및 Th1/Th2를 조절함으로써 면역항상성을 유지 시키는 면역조절기능을 나타내었다. Porphyra 속에서 주로
발견되는 sulfated polysaccharide인 porphyran은 mouse macrophage 세포인 RAW264.7 세포주에서 LPS로 유도된 염증반응에서 nitric oxide 생성과 nitric oxide synthase 발현을 효과적으로 억제시키는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 IκB의 인산화 및 분해를 저해함으로써 NF-κB의 활성 을 억제하는 것에 의한 것으로 보고하였다(Jiang 등, 2012).
뿐만 아니라 porphyran은 LPS로 자극된 RAW264.7 세포 주에서 세포 내 ROS 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, pro-inflammatory cytokine(cyclooxygenase-2, IL-1β, TNF-α)과 MAPK 경로(ERK, p38, JNK)의 인산화의 조절 을 통하여 항염증 및 항산화 소재로의 가능성을 나타냈다 (Lee 등, 2015). 본 연구 결과에서의 김 물 추출물이 나타내 는 TLR-2 및 TLR-4의 발현 억제는 염증반응의 초기메커 니즘을 효과적으로 저해할 수 있는 것으로 판단되며, NF-κB 경로 및 inflammasome의 형성을 억제하고 최종적으로 pro- inflammatory cytokine의 발현을 억제함으로써 항염증 효 과를 나타낼 수 있었던 것으로 판단된다. 이러한 결과들을 종합해볼 때 폐 및 뇌조직에서의 초미세먼지 유도성 염증반 응에 대한 개선 효과는 polysaccharide와 같은 생리활성물 질들을 포함하는 김 추출물이 면역조절물질로의 잠재적인 가능성이 있는 것으로 판단된다. 다만 김 추출물이 나타내는 미세먼지 대응 항염증 효과는 관련 유효물질의 동정 및 분리 를 바탕으로 동물모델을 활용한 추가적인 조직 특성적 기작 연구를 통해 보다 명확히 연구되어야 할 것으로 판단된다.
요 약
김(Porphyra tenera)의 초미세먼지로 유도된 in vitro 세포 보호 효과 및 동물모델에서의 염증반응에 대한 개선 효과를 검증하였다. 김 추출물에서 80% 에탄올 추출물에서는 총 페놀성 화합물 및 플라보노이드 계열의 함량이 높은 경향을 나타내었으며, 물 추출물에서는 상대적으로 높은 총 poly- saccharide 함량을 나타냈다. 3가지 in vitro 세포주[비강 (RPMI-2650), 폐(A549), 뇌신경(MC-IXC)세포]에서의 초 미세먼지 유도성 세포독성에 대한 세포 보호 효과를 측정한 결과, 물 추출물에서 세포 내 ROS 함량 및 세포 생존율이 모두 효과적으로 세포를 보호하는 것으로 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 김 물 추출물을 이용하여 초미세먼지에 노 출된 동물모델의 폐 및 뇌조직에서 지질과산화 억제 효과 및 염증 관련 단백질 발현량을 측정하였다. 폐와 뇌조직에서 효과적으로 MDA 함량을 감소시켰으며, TLR-2 및 TLR-4 의 발현을 억제시킴으로써 초기 염증반응의 개시를 저해하 는 것으로 나타났다. 이러한 TLRs의 발현 억제는 최종적으 로 pro-inflammatory cytokine의 발현을 감소시키면서 초 미세먼지 유도성 염증반응을 효과적으로 억제시키는 것으 로 나타났다. 따라서 본 연구의 결과는 초미세먼지로 유도될 수 있는 염증반응 및 관련 질환에서 김은 효과적인 천연 소 재로 판단되며, 이와 관련된 기초연구자료의 활용 가능성이
있다고 판단된다.
감사의 글
본 연구는 한국연구재단의 개인기초연구(2018R1D1A3B0 7043398)의 지원을 받아 수행된 결과로 이에 감사드립니다.
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