[신진연구자 컬럼] 당(Carbohydrate).단백질의 상호작용에 관한 연구

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신진연구자 컬럼

서론

세포 내에서 생체물질은 생물학적 반응을 조절하고 중 재하는 역할을 한다. 일부의 생체물질들은 다른 생체물 질의 도움없이 독자적으로 생체 내에서 기능을 하기도 하지만, 생체 내에서 생물학적인 반응의 대부분은 생체 물질들 간의 상호작용을 통하여 일어나게 된다. 이러한 상호작용의 과정에서 생체물질들은 복합체를 형성하게 된다. 때문에 이러한 생체물질들 간의 상호작용에 관한 연구는 생물학적 반응을 이해하는 데 기본적인 바탕이 된다. 생체 내에서 당(carbohydrate)은 단백질의 folding 이나 단백질을 안정화시키는 역할을 할뿐만 아니라 세포 와 세포간의 communication 혹은 면역학적 반응에 있어 서 중요한 역할을 하는 생체물질로 알려지고 있다. 따라 서, 이러한 당에 관한 연구는 살아있는 유기체의 생물학 적인 과정에 대한 중요한 정보를 제공할 뿐 아니라, 잠재 적인 신약개발에 있어서 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

당과 단백질의 상호작용 연구를 위한 목적 단백질로 Vibrio cholera toxin protein이 가장 잘 알려져 있을 뿐 아니라 GM1 pentasaccharide와의 상호작용 정도 또한 상당하다고 알려져 있다. 이 독성단백질은 27 kDa의 CtxA와 12 kDa의 CtxB로 이루어져 있다. CtxB의 경우 pentamer를 형성하여 세포막에 위치하는 ganglioside

2001 포항공과대학교 화학공학과, 공학사 2003 포항공과대학교 화학공학과, 공학석사 2008 포항공과대학교 화학공학과, 공학박사 2008 포항공과대학교 환경연구소, 박사후 연구원 2009 University of California, Davis, 박사후 연구원 2012 포항공과대학교 화학공학과, 연구조교수 현 재 영남대학교 화학공학부 조교수

서 정 현

영남대학교 화학공학부 조교수 Applied Biotechnology and Biomaterials Lab.

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그림 1. 당의 생체 내에서의 다양한 기능(Bertozzi and

Kiessling 2001 [1])

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GM1과 상호작용을 하게 된다. Cholera toxin이 ganglioside GM1과 상호작용시 CtxA와 5개의 CtxB가 복합체를 형성한 후 ganglioside GM1 pentasaccharide와 결합한다. 이러한 상호작용 후 세포 내 감염기작을 일으키게 된다. 상호작용의 특징을 간단히 살펴보면 CtxB monomer는 GM1 pentasaccharide와 1:1로 결합하는 특징을 가지고 있 지만, 이러한 결합만으로는 세포 내 감염을 일으키지 못한다. CtxAB 복합체를 형성한 후 감염기작이 일 어나는 것으로 알려져 있다. Cholera toxin의 감염기 작에 관한 연구는 어느 정도 보고가 되어 있으나, 그 상호작용에 관한 연구는 아직 잘 밝혀지지 않았다.

한 연구그룹에서는 이러한 상호작용에 있어서 CtxB 가 GM1과 결합한 것보다 CtxAB 복합체가 GM1과 결합시 결합정도가 더 강하다고 보고하였다. 이러한 상호작용을 분석하기 위하여 non-labeling system인 surface plasmon resonance(SPR), electrochemical detection, 그리고 atomic force microscopy(AFM) 을 이용한 결과를 소개하고자 한다.

당의 표면 고정화 방법 개발

다양한 분석방법에 당을 이용하기 위하여 새로운 방법의 당 고정화 방법이 개발되었다. 기존의 보고

가 된 당 고정화 방법들은 당 구조가 복잡하고, 당의 변형과정중 구조가 깨지는 문제점들 때문에 복잡한 구조의 당들은 고정화시키기 어려웠다. 또한, 당지질 인 ganglioside GM1을 고체 표면에 고정화시키기 위하여 복잡한 과정을 거치고, 간접적인 방법들을 이용하였다[2-4]. 본 연구에서는 다양한 종류의 당 들은 직접적인 방법을 이용하여 금표면에 고정화시 키기 위한 방법을 개발하였다. 당의 환원당부분의 aldehyde group과 aminophenyl sulfide의 NH2

group을 결합시켜서 thiol group(SH)을 가질수 있 도록 변형하였다. 이러한 당은 금표면에 직접적으로 고정화 될 뿐만 아니라, 환원당부분을 변형시켰기 때문에 당의 활성부분은 그대로 유지된 상태로 금표 면에 고정화한다는 특징을 가지고 있다. 따라서 이 러한 당 고정화 방법은 당과 관련된 연구에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

당–단백질의 상호작용 분석

상호작용의 분석결과, 우선적으로 아직까지 보고 가 되지 않은 CtxA와 CtxB간의 상호작용은 세가지 분석방법을 통하여 얻어진 결과로 볼 때 비록 세포 내 감염기작을 일으키기 위해서 CtxA와 CtxB가 복 합체를 형성해야 하지만, 두 단백질간의 상호작용은

그림 2. 금표면에 당의 고정화를 위한 당의 변형 (Seo et al. 2007, 2011 [5,6])

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일반적인 ligand-receptor와의 상호작용과 거의 유 사한 값을 구할 수 있었다(184 pN).

기존의 보고들은 주로 CtxB와 GM1간의 상호작 용을 SPR이나 ITC와 같은 비교적 정성적인 분석방 법들을 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 CtxAB 와 GM1간의 상호작용을 분석함과 동시에 상호작용 시 GM1 pentasaccharide에서 monosaccharide의 역할을 밝히기 위한 연구를 수행하였다.

CtxB-GM1 상호작용과 CtxAB-GM1간의 상호 작용을 분석한 결과 정성적인 분석방법인 SPR과 전기화학분석 결과에서는 CtxB-GM1간의 상호작 용이 더 강한 affinity를 나타내는 결과를 보여줬다.

하지만, AFM을 이용한 force의 값에서는 CtxAB- GM1간의 상호작용이 약 90 pN 더 큰 결합정도를 나타냈다. 위의 두 분석방법에서 ctxB-GM1간의 상 호작용이 더 강하게 나타난 이유는 사이즈가 큰 CtxAB와 GM1상호작용시 steric hindrance때문에 결합의 방해를 일으켰다고 결론지을 수 있다. CtxB 의 경우 MALDI-ToF를 이용한 질량의 분석결과 monomer부터 pentamer까지 존재하기 때문에, 상 호작용시 CtxAB보다 결합이 쉽게 이루어질 수 있 어서 이와 같은 결과를 나타냈을 것으로 생각된다.

하지만 이러한 steric hindrance 문제가 적용되지 않

은 AFM을 이용한 분석방법은 직접적인 분석방법 이기 때문에 상호작용에 관한 정확한 정보를 제공하 였다고 생각된다. SPR의 분석결과 sialic acid가 없 는 asialo GM1의 association rate값이 가장 낮게 나 왔기 때문에 상호작용시 recognition 역할을 할 것으 로 생각되고, terminal galactose가 없는 GM3의 경 우 dissociation rate 정도가 크게 나타났기 때문에 stabilization역할을 하는 것으로 분석되었다. Merritt 의 보고에 따르면 X-ray crystallography분석결과 CtxB와 GM1간의 상호작용시“Two fingered grip”

model을 제시하였다[10]. 본 연구의 결과에서도 GM1과 유사한 two finger grip 형태를 가지는 LST-b의 경우 결합정도가 높게 나타남을 확인하였 다. 따라서 CtxAB와 GM1간의 상호작용시 이러한 형태의 구조가 중요함을 확인하였다. 또한, 다른 당 이 CtxAB와 상호작용시 재배열을 통하여 결합한다 는 사실도 확인하였다. 전기화학의 분석방법에는 다 른 방법들과 다르게 potential shift의 변화를 통하여 상호작용의 specificity를 확인하였다.

맺음말

본 연구에서는 당과 단백질간의 상호작용을 분석 하기 위한 기반기술로 새로운 방법의 당 고정화 기

그림 3. 다양한 당-단백질 상호작용 분석방법 (Seo et al. 2011, 2012, 2013[7-9])

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술을 개발하였다. 이러한 당고정화 방법은 많은 장 점을 가지고 있기 때문에 당과 관련된 생체모방기술 에 다양하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

Vibrio cholera toxin 단백질과 ganglioside GM1간 의 상호작용분석결과에서는 CtxA가 상호작용에 있 어서 결합정도를 강화시킴을 확인하였다. 또한 상호 작용에 있어서 sialic acid와 terminal galactose가 중 요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 상호작용시 GM1의 two fingered grip형태가 상호 작용에 있어서 중요하다는 것을 확인하였다. 본 연 구에서 이용한 각각의 분석방법들은 장점과 단점을 동시에 가지고 있으며, 분석방법마다 얻을 수 있는 정보가 다르기 때문에 상호작용의 분석시 다양한 분 석방법을 통한다면 상호작용에 대한 보다 정확한 정 보를 얻을 수 있을 것으로 생각된다.

이러한 당의 고정화에 대한 연구 및 당과의 상호 작용에 관한 연구는 genomics, proteomics 연구에 이어서, 최근에 각광을 받고 있는 glycomics 연구에 대한 폭넓은 이해를 할 수 있을 것으로 여겨진다.

참고문헌

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166(1994).