Development of SCAR Marker for Discriminating between Violet Flowered Lines and White Flowered Lines in Chinese Bellflower (Platycodon grandiflorum A.)

청도라지와 백도라지의 구분을 위한 SCAR 마커 개발

박춘근*^†1·방경환*¹·김옥태*·김동순*·김동휘*·성정숙*·성낙술*·박희운*·이상철**

*작물과학원 인삼약초과, **경북대학교 농학과

Development of SCAR Marker for Discriminating between Violet Flowered Lines and White Flowered Lines in Chinese Bellflower ( Platycodon grandiflorum A.)

Chun Geon Park

^*†1

, Kyong Hwan Bang

^*1

, Ok Tae Kim

^*

, Dong Chun Jin

^*

, Dong Hwi Kim

^*

, Jung Sook Sung

^*

, Nak Sul Seong

^*

, Hee Woon Park

^*

, and Sang Chul Lee

^**

*National Institute of Crop Science, RDA, Suwon 441-857, Korea.

**Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea.

ABSTRACT : To develop a convenient method for discriminating between violet flowered lines and white flowered lines in Chinese bellflower, RAPD analysis was carried out and SCAR markers were generated. Eighteen specific RAPD bands were obtained from 6 OPERON primer sets. Two out of eighteen RAPD bands were cloned into pGEM - T - Easy vectors and then subjected to the nucleotide sequence analysis. PgR1 and PgR2 DNA fragment, each specific for violet and white flowered lines, consist of 887 bp and 863 bp sequences, respectively. Two SCAR markers were developed from RAPD clones: ^SPgR1 (355 bp) from PgR1 and ^SPgR2 (493 bp) from PgR2. One ( ^SPgR2 ) of these two markers was useful to differentiate between violet flowered lines and white flowered lines in Chinese bellflower.

Key Words : Platycodon grandiflorum , white flowered lines, violet flowered lines, RAPD, SCAR marker, discrimination

서 언

길경 ( ^도라지 , Platycodon grandiflorum A. DC.) ^{은 초롱꽃}

과 (Campanulaceae) ^{에 속하는 다년생 초본으로} , triterpen ^계 saponin 과 sterol 을 함유하고 있다 . 초롱꽃과 식물은 우리나라 에 8 속 25 종 9 변종이 기재되어 있는데 이중 길경은 세계적으 로 1 속 1 종 밖에 없는 식물로 관상용으로도 가치가 있는 대표 적인 약초로 알려져 있다 ( 이창복 , 1980; Mabberley, 1987).

우리나라에서는 백도라지가 약효가 좋다고 믿고 있으나 실 제 재배 시에는 이들을 구분하지 않고 함께 섞어서 심고 있는 실정이다 . 자생하는 도라지는 꽃색에 따라 청도라지 , 백도라지 로 구분하고 청도라지가 대부분이므로 이를 원종으로 다루고 있다 . 백도라지는 주로 농가에서 재배하는 도라지 중에서 볼 수 있으며 , 약용이나 식용으로는 아직까지 육성된 품종이 없 고 지방 재래종이 재배되고 있다 . 한편 중국에서는 길경을 화 색에 따라 백화길경과 자화길경으로 구분하여 심고 있는데 , 이 들이 맛과 생장에서 차이가 있다고 보고되고 있으나 아직까지

과학적인 근거는 미흡한 실정이다 ( 중국약재공사 , 1995).

약용 식물은 생육 지역에 따라 형태 , 생리 및 생태적 특성 등에서 차이를 보이기 때문에 그의 효율적인 이용을 위하여서 는 지역에 따른 유전 분석이 요구되며 , ^{외국산 약재와의 구분}

이나 국내 약용식물자원의 보호차원에서도 유전 분석이 요구 되고 있다 (Lee et al ., 1993). 도라지의 경우에도 재배지역에 따라 유용성분의 함량이 차이를 나타내는 것으로 보고되고 있 으나 , 지역에 따라 유전적 계통 분석은 이루어진 바가 없다 .

최근에는 다양한 식물의 유전자원 수집이 활발하게 추진되고 있으나 , ^{종내 또는 종간의 유전적인 연구가 미진하여 유전 특}

성의 파악 , 유전현상 구명 및 품종 육성을 위한 선발에도 어 려움이 있다 . 또한 우량 품종 육성 시에도 표현형 및 형태적 특성에 의한 육종은 장시간의 식물 생장기간으로 인한 노동력 과 비용이 과다 소요되며 , 환경의 영향을 받기 쉽고 , 관찰자의 경험에 의존하기 때문에 객관성과 정확성이 결여될 우려가 있 다 (Hu et al ., 1995).

한편 식물학적 특성으로는 잎의 모양 , ^{꽃의 색깔 및 꽃의}

1

These authors contributed equally to this paper

†

Corresponding author: (Phone) +82-31-290-6821 (E-mail) [email protected]

Received June 26, 2006 / Accepted January 31, 2007

크기 등으로 길경의 지상부 생육부위의 구별이 가능하지만 , ^청

도라지와 백도라지의 주 이용부위인 뿌리를 이들 특성을 이용

하여 구분하는 것은 불가능한 일이다 . RAPD 방법은 다양한

분석방법 중에 분석이 쉽고 , 간편하기 때문에 가장 보편적으 로 이용되어지고 있으나 , 반응조건에 따라 결과가 달라질 수 가 있어 재현성 있는 실험 결과를 기대하기가 어렵다 (Bang et al ., 2003; In et al ., 2005). 이러한 문제를 해결하기 위해

서 RAPD ^{분석 결과에서 생성된 특이} DNA ^밴드들을

cloning ^과 sequencing ^{과정을 거쳐 새로운} SCAR primer ^를

제작하여 PCR 을 수행하는 것이 필요하다 (Paran & Michl- more, 1993). 따라서 본 연구에서는 RAPD clone 으로부터 청 도라지와 백도라지를 구분할 수 있는 특이적인 SCAR 마커를 개발하고 , 이를 차후 육종의 선발마커로 활용코자 실험을 수 행하였다 .

재료 및 방법

1. 공시재료

도라지의 시험 재료는 2005 년 9 월경에 작물과학원 인삼약

초과 약용작물 시험포장에서 재배중인 청도라지와 백도라지의 순수 계통을 대상으로 각각 6 sample 씩을 사용하였다 .

2. DNA 추출

전체 DNA 추출은 CTAB 방법 (Murray & Thompson, 1980) 을 변형하여 사용하였는데 , 막자사발을 이용하여 1 g 정 도의 녹체를 액체질소에서 갈아 1.5 ㎖ tube 에 넣어 냉동고에 보관 ( − 70 ℃ ) 하여 시료로 이용하였다 . DNA 추출은 우선 시료 에 extraction buffer 1 ㎖를 넣어준 후 (Buffer: 100 mM Tris- HCl, pH 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% CTAB, 1%

polyvinylpyrolidine) ^{여기에 동량의} phenol : chloroform : isoa- mylalchol (25 : 24 : 1) 넣어주었다 . 그 다음 약 10 분 간격으로 천천히 흔들어 주면서 , 65 ℃에서 30 분간 처리한 후 12,000 rpm 에서 15 분간 원심분리한 다음 , 상등액을 채취하여 새 tube

에 옮겨주었다 . 이때 상등액이 깨끗하지 않을 경우 상층액과 동량의 chloroform : isopropanol (24 : 1) 을 넣고 손으로 천천히 약 5 ^{분간 흔들어 주었다} . ^{그 후} 13,000 rpm ^에서 15 ^{분간 원심}

분리하고 , 상등액을 취하여 새 tube 에 옮기고 상등액이 깨끗하 게 될 때까지 이를 2 회 반복하였다 . 그다음 동량의 isopropanol

을 첨가한 후 , − 20 ℃에서 1 시간 보관하였다가 10,000 rpm 에서

5 분간 원심 분리하여 DNA 를 침전시키고 70% ethanol 로

DNA 를 세척하였다 . 세척이 끝난 DNA 는 건조시킨 다음

100 ㎕ 를 distilled water 혹은 TE buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.4) ^{를 넣어 녹였다} . DNA ^농도는 Nano Drop En-1000 ^기기 (Dupont Agricultural Genomics Labora- tory, America) 를 이용하여 3 회 반복 측정하여 그 평균값을 구

하였으며 , ^각 DNA ^는 10 ng/ ^{㎕로 희석하여} PCR ^{실험에 이용}

하였다 .

3. SCAR analysis

청도라지와 백도라지 특이적인 SCAR 마커를 개발하기 위 하여 우선 총 24 개의 임의 프라이머들을 이용하여 RAPD 분 석을 수행하였다 . PCR 반응은 PCR buffer (1 M Tris-HCl, pH 8.0, 1 M KCl, 1 M MgCl

²

, 1% gelatin), 2.5 mM dNTP, 4 µM ^의 Primer, DNA 10 ng, Taq polymerase 1 Unit ^{이 혼}

합된 20 ㎕의 반응혼합물에 동량의 mineral oil 을 첨가한 후

DNA thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus, USA) 에서 94 ℃에 서 30 초간 denaturation, 36 ℃에서 30 초간 annealing, 72 ℃에 서 1 분간 extension 의 과정을 총 35 cycle 수행하였다 . 그 결 과 이들의 기원식물을 판별하기에 유용한 random primer 를 선발하였고 , ^이들 primer ^{를 이용하여} PCR ^{을 한 후} 1.0% ^아

가로스 겔에 전기영동하여 목적하는 DNA 의 다형성을 재확인 하였다 . Geneclean II kit 를 이용하여 아가로스 겔에서 청도라 지와 백도라지에 특이적인 DNA 밴드를 오려내어 target DNA 를 회수하였고 , 회수된 DNA 는 pGEM-vector 로 ligation

시킨 후 E. coli DH5 α에 transformation 시켜 성공적으로 tra- nsformation 된 colony 는 염기서열 분석을 수행하였다 . 염기서 열 분석은 automatic DNA sequencer (ABI377) ^{를 이용하였}

으며 , 분석된 염기서열 데이터는 BLAST (Altshul et al .,

1997) 를 이용하여 기존에 알려진 유전자 염기서열과 유사성이

있는지를 확인하였다 . 염기서열 분석을 통해 얻은 데이터를 바 탕으로 새로운 primer 들을 디자인하여 , 이들 SCAR 마커

( SPgR1 , SPgR2 ) 의 적정 PCR 조건을 탐색하였는데 , 10 ng DNA, 10 pM primer, 0.5 unit Taq DNA Polymerase 가 혼합 된 총 25 ^{㎕의 반응혼합물로} , DNA thermal cycler ^{에서 최초} annealing ^온도를 65 ^{℃를 시작으로} 1 ^{℃씩 낮춰} 10 cycle ^동안 touch-down PCR 을 수행하고 , 최종적으로 94 ℃에서 30 초 동안

denaturation, 55 ℃에서 1 분 동안 annealing, 72 ℃에서 1 분간

extension 의 과정을 25 cycle 수행하였을 때 가장 양호한 밴드 를 형성하여 이 조건으로 청도라지와 백도라지의 판별을 시도 하였다 .

결과 및 고찰

청도라지와 백도라지를 구분할 수 있는 RAPD based primer

를 선발하고자 총 24 개의 primer 를 사용하여 PCR 을 수행한 결과 , 밴드가 분명하고 다형성 밴드가 관찰되는 6 개의 primer

들을 선발할 수 있었다 (Fig. 1). 증폭된 PCR 산물들은 0.3 kb ^에서 2.0 kb ^{까지 다양하였으며} , ^총 46 ^{개의 증폭된} DNA ^밴

드를 얻었는데 이중 다형성을 나타내는 DNA fragment ^는 18

개였다 . 각 primer 에 의해 증폭된 밴드의 수는 4~12 개이었으

며 primer 한 개당 평균 7.7 개의 DNA 밴드가 증폭되었다

(Table 1).

Fig. 2 ^의 10 base ^인 OPC 08 primer ^{를 이용한} PCR ^결과 ,

약 1 kb 부근에서 청도라지와 백도라지 특이적인 band 가 나타 났다 . 한편 OPD 05 primer 를 이용한 PCR 결과에서는 약 0.6 kb 부근에 청도라지와 백도라지 특이적인 밴드가 각각 나타났

으며 , 1.1 kb 에서는 백도라지 특이적인 밴드가 관찰되었다 .

OPG 18 primer 를 적용한 결과에서는 0.9 kb 부근에서 청도라

지와 백도라지 특이적인 밴드가 나타났는데 , 이들 OPC 08 과

OPD 05 및 OPG 18 primer 를 포함한 총 6 개의 primer 를 청도라지와 백도라지를 구분하기 위한 primer 로 선발하였다

(Fig. 2).

Table 1.

The sequences of primers and number of polymorphic bands.

Primer Nucleotide sequence (5' to 3') No. of PCR

products No. of polymorphic bands

OPC08

^†

TGGACCGGTG 4 3

OPC18 TGAGTGGGTG 8 1

OPD05 TGAGCGGACA 8 3

OPF04 GGTGATCAGG 8 3

OPG18 GGCTCATGTG 6 4

OPN02 ACCAGGGGCA 12 4

Total 46 18

†

: Primers that reveal polymorphic fragments between violet flowered lines and white flowered lines in Chinese bellflower.

Fig. 1.

Differences of RAPD patterns using 24 random primers between violet flowered lines and white flowered lines in Chinese bellflower. Odd numbers : violet flowered lines

^.

Even numbers : white flowered lines

^.

Arrows indicate polymorphic DNA bands.

Fig. 2.

Profiles of PCR products obtained from genomic DNA using the 10-based Operon C08 (A), C18 (B), D05 (C), F04 (D), G18 (E)

and N02 (F) primers. Lane M, 1kb DNA ladder. Lanes 1-5 : violet flowered lines

^.

Lanes 6-10 : white flowered lines

^.

Arrows

indicate polymorphic DNA bands.

SCAR primer 의 제작 및 적용은 최근 벼를 비롯한 주곡 작 물과 약용작물분야에 대한 식물분류 및 작물유전육종 분야에 서 많이 이루어지고 있는 실정이다 (Adam-Blondon et al ., 1994; Bang et al. , 2004; Das et al ., 2005; Hernandez et al ., 1999; Naqvi & Chatto, 1996).

본 시험에서 청도라지와 백도라지를 구분하기 위하여 RAPD

분석을 수행한 결과 , 다형성을 나타내는 다양한 DNA 밴드들

을 얻을 수 있었는데 , 이들 중 OPG18 primer 를 이용하여

PCR 한 결과로부터 생성된 약 0.9 kb 크기의 청도라지와 백도 라지 특이적인 clone ^{을 대상으로} cloning ^과 sequencing ^{을 거쳐}

두 개의 특이적인 SCAR primer ( SPgR1 , SPgR2 ) ^{를 제작하}

였다 .

청도라지 특이적인 DNA fragment 는 887 bp ( PgR1 라 명명 )

의 염기로 구성되어 있었고 , 백도라지 특이적인 DNA fragment

는 863 bp ( PgR2 라 명명 ) 의 염기로 구성되어 있었다 (Fig. 3, Fig. 4). 분석된 염기서열 데이터를 BLAST (Altshul et al .,

1997) 를 이용하여 기존에 알려진 유전자 염기서열과 유사성이

있는지를 확인하였으나 유사성이 없는 것으로 조사되었다 . ^한

편 염기서열 분석을 통해 얻은 데이터를 바탕으로 새로운

primer ( SPgR1 , SPgR2 ) 들을 디자인하였으며 , 이들 primer 를 이용하여 청도라지와 백도라지 순수 계통을 대상으로 PCR ^을

수행하였다 (Table 2).

SCAR marker ( SPgR1 , SPgR2 ) 의 주요 특성들을 Table 2

에 나타내었는데 , 청도라지와 백도라지를 대상으로 SPgR2 primer 를 이용하여 PCR 을 하였을 때 청도라지에서는 약 500 bp 크기에서 두 개의 특이적인 밴드가 형성되었으며 , 백도라 지의 경우 한 개의 특이적인 밴드만 관찰되어 청도라지와 백 도라지를 구분할 수 있었다 (Fig. 5). ^{한편 백도라지 특이적인} SPgR2 primer 를 이용하여 PCR 했을 때 청도라지에서도 500 bp 크기에서 두 개의 DNA 밴드가 형성되었는데 , 이 결과는

백도라지 특이적인 DNA fragment 가 청도라지에서도 존재하

는 반복염기서열일 가능성이 큰 것으로 생각되며 , 그 결과 백 도라지 특이적인 우성 마커가 생성될 것으로 예상했던 것과는 다르게 청도라지에서도 DNA fragment 가 생성된 것으로 추정 된다 .

Fig. 3.

Nucleotide sequences of PgR1 clone.

^SPgR1

-F and

^SPgR1

-

R primer sequences for a SCAR marker are underlined.

^{Fig. 4.}

Nucleotide sequences of PgR2 clone.

^SPgR2

-F and

^SPgR2

- R primer sequences for a SCAR marker are underlined.

Table 2.

Characteristics of two SCAR markers used for discrimination of violet flowered lines and white flowered lines in Chinese bellflower.

Markers Size of markers

(bp) SCAR primer

sequences Annealing

Tm. (

℃

) Size of amplified

fragments (bp) Specificity SCAR markers

PgR1^†

(RAPD

marker) 887

Forward primer 5'TAAGTTCACAAAA -GAATTACCTGA 3' Revese primer 5' TAGGTGAATTAG -AGCTGTATGTGT 3'

55 355 N N

^§

(RAPD

PgR2

marker) 863

Forward primer 5' GAGGAGTATTTT -GTCAGATAAGGT 3' Revese primer 5' TAGGTGAATTAG -AGCTGTATGTGT 3'

55 493 co-dominant

type

^SPgR2‡

†

PgR stands for P: Platycodon, g: grandiforum, R: RAPD

‡

SPgR stands for S: SCAR marker, P: Platycodon, g: grandiforum, R: RAPD

§

N: no result

결론적으로 SCAR ^{마커는 청도라지와 백도라지를 구분하기}

에 유용한 방법으로 판단되며 , ^개발된 SCAR ^{마커는 도라지}

의 품종 육성 시 조기선발 마커 및 교배육종 시 F 세대 검정

에 활용될 수 있을 것으로 생각된다 . 또한 개발된 SCAR 마

커는 향후 순계선발 및 계통육성을 통한 도라지 품종 등록 시 품종의 표지자로 활용하여 다가오는 수입개방시대에 대비한 우리나라의 육성 품종에 대한 지적재산권 확보에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 판단되어진다 .

적 요

청도라지와 백도라지를 DNA 수준에서 구분하기 위하여 , RAPD 분석을 바탕으로 SCAR primer ( SPgR1 , SPgR2 ) 를 제 작하여 이를 적용한 실험 결과는 다음과 같다 .

총 24 ^{개의 임의 프라이머를 적용하여} 6 ^{개의 청도라지와 백}

도라지 특이적인 프라이머를 선발하였고 , ^{이들 프라이머를 이}

용하여 PCR 을 수행한 결과 총 18 개의 다형성을 나타내는

DNA fragment 를 확보하였다 . 확보된 DNA fragment 중 2 개 에 대한 염기서열 분석을 수행한 결과 , 청도라지 특이적인

DNA 밴드는 887 bp 의 염기서열로 구성되어 있었고 백도라지

는 863 bp 의 염기서열로 구성되어 있었다 . 이들 염기서열을 바 탕으로 두개의 SCAR primer ^{를 제작하였고} , ^{이중 백도라지 특}

이적인 SPgR2 ^{를 이용하여} PCR ^{한 결과} , ^{청도라지에서는 약} 500 bp 크기에서 두 개의 특이적인 밴드가 형성되었으며 , 백도 라지의 경우 한 개의 특이적인 밴드만 관찰되어 청도라지와 백도라지를 구분할 수 있었다 . 결론적으로 본 실험을 통하여

개발된 SCAR 마커는 청도라지와 백도라지를 구분하기에 유

용함을 확인하였다 .

LITERATURE CITED

Adam-Blondon AF, Sevignac M, Bannerot H, Dron M (1994) SCAR, RAPD and RFLP markers linked to a dominant gene (Are) conferring resistance to anthracnose in common bean.

Theor. Appl. Genet. 88:865-870.

Altschul FS, Thomas L, Madden AA, Schaffer, Jinghui Z, Zheng Z, Web M, Lipman DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

Bang KH, Park CG, Jin DC, Kim HS, Park HW, Park CH, Seong NS (2003) Discrimination of species specific DNA markers using RAPD and AFLP analysis between

Atractylodes japonica

Koidz. and

Atractylodesmacrocephala

Koidz. Korean J. Medicinal Crop Sci. 11:268-273.

Bang KH, Sung JS, Park CH, Jin DC, Park CG, Yu HS, Park HW, Seong NS (2004) Discrimination of

Atractylodes

rhizome white using anatomical characteristics and SCAR markers.

Korean J. Medicinal Crop Sci. 12:53-59.

Das M, Bhattacharya S, Pal A (2005) Generation and characteri- zation of SCARs by cloning and sequencing of RAPD products: A strategy for species-specific development in Bamboo.

Ann. Bot. 95:835-841.

Hernandez P, Martin A, Doraco G (1999) Development of SCARs by direct sequencing of RAPD products: A practical tool for the introgression and marker assisted selection of wheat. Mol. Breeding 5:245-253.

Hu J, van Eysden J, Quiros CF (1995) Generation of DNA- based markers in specific genome regions by two-primer RAPD reactions. PCR Methods Appl. 4:346-351.

In DS, Kim YC, Bang KH, Chung JW, Kim OT, Hyun DY, Cha SW, Kim TS, Seong NS (2005) Genetic relationships of

Panax

species by RAPD and ISSR analyses. Korean J.

Medicinal Crop Sci. 13:249-253.

Lee WB, Choi SY, Kim YS (1993) An application of random amplified polymorphic DNA (RAPD) to systematics of some species

Lilium

in Korea. Korean J. Plant Tax. 23:35-42.

Mabberley DJ (1987) The Plant Book. p. 461.

Murray YHG, Thomson WF (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 8:4321-4326.

Naqvi NI, Chattoo BB (1996) Development of a sequence characterized amplified region (SCAR) based indirect selection method for a dominant blast resistance gene in rice. Genome 39:26-30.

Paran I, Michelmore RW (1993) Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85:985-993.

이창복

(1980)

^{대한식물도감}

,

^향문사

., p. 725.

중국약재공사

(1995)

중국상용중약재

,

과학출판사

., p. 420-428.

Fig. 5.

PCR products of Chinese bellflower plant DNA using

SPgR2

primer. 0.5 kb SCAR markers were detected in

violet flowered lines and white flowered lines, respe-

ctively. Lane M, 1kb DNA ladder; lanes 1-6, violet

flowered lines; lanes 7-12, white flowered lines

^.