3T3-L1 지방전구세포에서 양제근 에탄올 추출물의 항비만 효과에 대한 연구
남건희1, 조경조1, 박예슬1, 곽혜원1, 위지향2, 김상용2, 구봉성3, 김영민1*
Study of Anti-Obesity Effect of Rumex Japonicus Houttuyn Ethanol Extracts in 3T3-L1 Preadipocytes cells
Gun He Nam1, Kyung Jo Jo1, Ye Seul Park1, Hye Won Kawk1, Ji-Hyang Wee2, Sang Yung Kim2, Bong-Seong Koo3, and Young Min Kim1*
Received: 1 May 2019 / Revised: 26 June 2019 / Accepted: 4 July 2019
© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Abstract: Rumex japonicus Houttuyn is known for its anti- inflammatory and anti-microbial effects. In this study, we determined the effects of ethanol extract of Rumex japonicus Houttuyn (RJHE) on anti-obesity activities in 3T3-L1 preadi- pocytes. In vitro experiments to prevent obesity and improve anti-obesity effects, research using 3T3-L1 preadipocytes is essential, it also distinctly represents morphologic and molec- ular changes. Our results showed that RJHE decreased the differentiation of 3T3-L1 preadipocytesusing oil red O stain- ing through decreasing the lipid droplet and had no cytotoxic- ity in 3T3-L1 preadipocytes using WST-1 assay (100 μg/mL and 200 μg/mL). Also, the concentrations of triglycerides(TG) were gradually reduced in 3T3-L1 preadipocytes cells with RJHE (N: 100%, 100 μg/mL: 64.5%, 200 μg/mL: 38.1%) using ELISA assay. And RJHE suppressed the Expression of PPARγ, C/EBPα and Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) in a dose-depen- dent manner by Western blot analysis. Taken together, our
results demonstrate that RJHE indicates anti-obesity effects in vitro situation and has potential uses in chemotherapeutic drugs.
Keywords: Rumex japonicus Houttuyn, 3T3-L1 preadipo- cytes, anti-obesity
1. INTRODUCTION
비만은 과도한 에너지 섭취와 영양의 불균형으로 인해 지방 세포가 축적된 상태를 의미한다. 이러한 비만은 고지혈증 및 고혈압 등 현대인의 건강문제를 야기시켜 사회적인 문제로 대두되고 있다 [1]. 비만은 체내의 지방전구세포가 지방축적 (ectopic lipid accumulation)으로 인해 지방세포로 분화되는 양이 급증하는 것이 주된 원인으로, 비만을 예방하고 개선하 기 위해서는 이러한 지방전구세포의 분화에 대한 연구가 필 수적이다 [2,3]. 지방전구세포의 분화가 유도 되면 세포 주기 가 정지되어 세포의 증식이 중단되고 성숙한 지방세포로의 분화 (adipogenisis)가 유도되는데 [4,5], 이 과정을 억제하는 과정에 대한 연구가 필요하다.
지방전구세포에서 성숙한 지방세포로의 분화를 억제시켜 비만을 치료하기 위해 다양한 화합물치료제가 사용되고 있 지만, 화학적으로 제작된 인공 화합물들은 세포 독성을 보여 장기에 영향을 줄 수 있으며 심지어 오심과 구토 등 다양한 부작용들이 초래한다. 이러한 문제를 해결하기 위해 안전하 고 부작용이 없는 천연물 유래 소재를 통한 연구가 활발히 진행되고 있는 추세이다 [6,7].
1한남대학교 생명나노대학 생명시스템과학과
1Department of Biological Science and Biotechnology, Hannam University, Daejeon 34054, Korea
Tel:+82-42-629-8753, Fax:+82-42-629-8873 E-mail: [email protected]
2신안산대학교 식품생명과학과
2Department of Food Science & Bio Technology, Shinansan University, Ansan 15435, Korea
3포바이오코리아 기술개발연구소
3Research Center, ForBioKorea Co., Ltd., Seoul 08592, Korea
Research Paper
3T3-L1 지방전구세포가 insulin, dexamethasone, 3-isobutyl- 1-methylxanthine (IBMX)과 같은 호르몬에 의해 지방세포로 의 분화가 유도되면, 가장 핵심적인 단백질인 PPARγ와 C/
EBPα의 발현이 증가된다 [8-10]. 이들의 발현은 지방산과 중 성지방을 합성 시키는 Acetyl-CoA Carboxylase (ACC)의 발 현과 함께 둥근 모양의 지방세포를 만들어낸다 [11]. 또한, 분화된 지방세포는 Triglyceride (TG) 축적 되는데, 글리세롤 과 지방산 3개로 구성된 Triglyceride (TG) 생성은 비만 및 고 지혈증의 원인이 되는 중요한 요인이다 [12]. 따라서, PPARγ 와 C/EBPα, Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) 발현을 조절하 여 성숙한 지방세포의 TG 축적을 감소시키는 것이 매우 중 요하다 [13,14].
양제근 (Rumex japonicus Houttuyn)은 마디풀목 마디풀과 의 여러해살이풀로서 참소리쟁이라고도 하며, 전국 각지의 다소 습한 곳에서 분포한다. 동의보감에서는 혈증 및 피부병 에 효험이 있는 약재라고 명시되어 예로부터 식용 및 약용으 로 사용되었다 [15]. 이러한 양제근은 항염증 및 항균 등 여 러가지 효능이 보고되어 있으나 아직까지 양제근의 지방세 포 분화 억제를 통한 항비만 효과는 보고되어 있지 않다 [16- 19]. 따라서 본 연구는 양제근 에탄올 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하는 효과에 대해서 알 아보도록 하였다.
2. MATHRIALS AND METHOD
2.1. 실험재료
실험에 사용된 양제근의 원산지는 대한민국 경북 영천이며, 한약재시장에서 구입하였다. 양제근 200 g에 94.5% 에탄올 1600 mL를 가하여 72시간 동안 상온에서 교반기를 이용해 환류 추출하였다. 이러한 방법으로 추출된 양제근을 감압농 축기를 이용하여 감압 농축시킨 뒤 -86°C에서 보관하였다.
농도별 (100, 200 μg/mL) 양제근 에탄올 추출물제조하기 위 해 상기 추출물을 동일 용량의 DMSO (dimethyl sulfoxide) 에 녹여 준비하였다. 제조된 샘플은 −20°C에서 냉동 보관하 여 사용하였다.
2.2. 세포 배양 및 준비
3T3-L1 preadipocytes cells은 American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA)에서 분양 받았으며, 10% Bovine Calf Serum (HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1% antibiotics 가 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 사 용하여 5% CO2, 37oC 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
48시간 마다 trypsin-EDTA (HyClone Laboratories Inc, UT, USA)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 1×106 cells/mL로 분 주하고 계대배양 하였다. 실험은 3 passage number가 될 때까 지 계대 배양하여 안정화 시킨 후, passage number 10 가 될 때까지 실험을 진행하였다. Passage number가 10이 넘어갈 경우 질소 탱크에 보관중인 세포로 다시 실험을 진행하였다.
2.3. WST-1 assay
세포 배양용 12-well plate에 3T3-L1 preadipocytes cells 을 3.8×105 cells/mL로 분주하고 24시간 배양 뒤 RJHE를 (100, 200 μg/mL) 처리하였다. WST-1용액을 media volume의 10%
(v/v)만큼 첨가하여 60 분동안 5% CO2, 37°C 조건에서 배양 한 후, 96-well plate에 100 μL씩 분주하여 분광광도계 (FLUOstar Omega, BMG labtech, Ortenberg, Germany)를 이 용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2.4. 지방세포 분화유도
6-well plate에 3T3-L1 preadipocytes cells (지방전구세포)를 adipocytes cells (지방세포)로 분화시키기 위해 well당 1×106 cells/mL로 분주하여 세포가 confluent상태까지 배양시켰다.
다음 10% Fetal Bovine Serum (HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1% antibiotics가 포함된 DMEM으로 배지를 교환해 주고 10 mg/ml Insulin, 0.1 μM Dexamethasone, 0.5 mM IBMX로 이루어진 hormonal cocktail을 이용해 분화를 유도시켰다. 그 후, 2일 마다 10 mg/mL Insulin 이 포함된 10% Fetal Bovine Serum (FBS; HyClone Laboratories Inc, UT, USA)과 1%
antibiotics가 포함된 DMEM으로 분화를 유도시켰다. 또한, RJHE의 지방세포 분화 유도 억제를 확인하기 위해 배지 교 환 시 RJHE를 처리하였다.
2.5. Oil Red O staining
지방전구세포 분화 시에 형성되는 지방의 함량을 확인하기 위해 분화 8일째에 Oil Red O staining을 실시하였다. 10%
Formalin을 이용해 30분간 고정시킨 후, 60% isopropanol을 이 용해 세포를 세척 후 Oil Red O solution (SIGMA-ALDRICH, Missouri, USA)을 처리하여 30분 간 상온 방치 후에 증류수 로 잔여 Oil Red O solution을 제거한 뒤에 도립현미경 (X400 magnification, Axiovert 100, Zeiss, Germany)을 이용하여 lipid droplet함량의 변화를 관찰하였다.
2.6. Triglyceride Quantification Assay
지방전구세포 분화 시 세포에 축적되는 Triglyceride의 함량 을 측정하기 위해 ELISA assay (Triglyceride Quantification Assay kit, Abcam Inc, Cambridge, UK)를 사용하였다. 분화 유도된 지방전구세포를 5% NP-40 solution을 이용해 균질화 시켜준 뒤 90oC 온도로 5분간 배양 후 상온에서 5분간 반응 시키 것을 반복하여 Triglyceride가 완전히 용해될 때까지 수 행하였다. 그 후에 Lipase와 함께 20분간 상온에서 반응시키 고 Triglyceride Probe와 Triglyceride Enzyme Mix와 함께 60 분간 상온에서 반응시켜 분광광도계 (FLUOstar Omega, BMG labtech, Ortenberg, Germany)를 이용해 570 nm파장에서 광 도를 측정하였다.
2.7. Western blot
지방전구세포에서 지방세포로 유도될 때 핵심적인 역할을 수행하는 단백질의 발현을 확인하기 위해 Western blot analysis
이 끝난 세포에 RIPA lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.4), 1% NP-40, 0.5% sodiumdeoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF]를 각 well에 150 μL씩 첨가하여 단백질을 분리한 후, 4oC에서 14,000 rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 추출한 단백질은 분광광도계 (FLUOstar Omega, BMG labtech, Ortenberg, Germany)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 그 다음, 8% acrylamide gel 을 이용하여 전기영동을 실시한 후 nitrocellulose membrane 에 transfer하였다. 5% Bovine serum albumin (BSA)을 이용해 1시 간 동안 blocking하고, PPARγ, C/EBPα, Acetyl-CoA Carboxylase (ACC), β-actin primary antibodies를 4°C에서 16시간 처리한 후에 secondary antibody를 결합시켜 4°C 에서 2시간 동안 반응 시킨 후 enhanced chemiluminescence (ECL) solution (Thermo, Massachusetts, USA)을 사용해 UVITEC Gel-imaging System (Philekorea, Gyeonggi-di, Korea)과 X-ray film을 이용해 관찰 하였다.
2.8. 통계처리
통계 프로그램인 ANOVA t-test 22.0 프로그램 (Statistical Package for the Social Science)을 사용하였고 실험 설계에 대 한 분산 분석은 t-test를 실시하여 유의성을 검정하였다. 각 자료는 3번이상의 반복된 실험을 통하여 얻어진 결과로 검 정하였고 P<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하 였다.
3. RESULT AND DISCUSSION
3.1. WST-1 assay를 통한 RJHE가 3T3-L1 지방전구세포 에 세포독성 여부 확인
RJHE에 의해 지방전구세포에서 지방세포로 분화 억제 효과 를 조사하기 이전에, RJHE가 3T3-L1 지방전구세포에 세포 독성 여부를 확인하기 위해 WST-1 assay를 통해 확인하였다.
세포의 증식 및 생존에 필수적인 에너지를 생산하는 미토콘 드리아에서 방출되는 dehydrogenase에 의해 Tetrazolium Salts (WST-1)와 반응하여 formazan이라는 오렌지 색깔을 띈 물질 이 생성된다. Formazan의 양은 세포 내 미토콘드리아의 양과 활성에 비례하여 증가하기 때문에, 이것을 통해 세포의 생존 능력을 정량화 할 수 있다 [20]. 3T3-L1 지방전구세포에 RJHE를 농도별 (100, 200 μg/mL)로 처리하고 Tetrazolium Salts (WST-1)와 반응시킨 결과, 3T3-L1 지방전구세포의 생 존율에 유의적으로 큰 영향을 미치지 못하였으며, Vehicle control로써 사용된 0.1% DMSO 처리 군 역시 세포독성을 보 이지 않았다 (Fig. 1). 따라서 RJHE는 3T3-L1 지방전구세포 의 증식률에 영향을 미치지 않아 세포 독성을 보이지 않는 것으로 판단된다.
3.2. RJHE의 지방세포 분화 억제 효과 확인
Insulin cocktail을 이용한 지방세포 분화 유도와 더불어
RJHE를 병행 처리하여 RJHE에 의한 지방세포 분화 유도 억 제를 Oil Red O staining을 통해 확인하였다. 실험에 사용된 Oil Red O Solution은 분화가 유도된 지방세포의 중성지방 부분만을 특이적으로 염색 시켜 관찰 할 수 있다. Fig. 2(a)에 따르면, 둥근 모양으로 분화된 지방세포의 수가 RJHE에 억제 된 것을 육안으로 확인할 수 있다. 대조군 (Negative control)에 서는 다량의 분화된 지방세포가 관찰할 수 있으나, RJHE를 처리한 군에서는 둥근 모양의 분화된 지방세포의 수와 크기 가 현저히 감소하는 것을 관찰 할 수 있다. 또한, 지방전구세 포 분화 시 세포에 축적되는 Triglyceride의 함량 또한 감소하 는지 확인하였다. 대조군 (Negative control) 대비 RJHE 처리 군에서 Triglyceride의 함량이 유의성 있게 감소하였으며 (N:
100 %, 100: 64.5 %, 200: 38.1 %), Oil Red O staining 결과와 유사하게 농도의존적으로 지방세포 분화 억제 효과를 나타 내었다. 따라서 RJHE 처리 시, Insulin cocktail 에 의해 지방 세포의 분화가 억제되는 것을 확인 할 수 있다 (Fig. 2(b)).
3.3. RJHE에 의해 발현되는 지방세포 분화 관련 단백질 의 발현 확인
Insulin 등에 의해 지방전구세포에서 지방세포로 분화되는 과정에서 PPARγ, C/EBPα와 같은 지방세포 분화 유도 단백 질들이 관여하여 핵심적인 역할을 수행한다고 알려져 있다.
또한 지방산과 중성지방의 합성에 중추적인 역할을 수행하 는 단백질인 Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) 또한 핵심적이 다. 따라서 본 연구에서는 RJHE에 의해 지방세포 분화가 억 제될 때 해당 단백질들의 발현을 확인하고자 하였다. Figure 3(a)에 따르면, 대조군 (Negative control) 대비 PPARγ와 C/
EBPα 단백질의 발현이 농도의존적으로 감소한 것을 관찰 할 Fig. 1. 3T3-L1 preadipocytes proliferation rate was measured by WST-1 assay. Cells were treated with various concentrations of CCE (0-200 mg/mL) for 24 hours through WST-1 assay. N represents untreated cells. The statistical analysis of the data was carried out by use of ANOVA test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <
0.001 compared to N (untreated groups). N.S; not significant (each experiment, n=3). The error bars represent the standard error.
수 있다. 또한, Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) 역시 발현이 감소하여 지방세포 분화 억제뿐만 아니라 지방산과 중성지 방 합성에 영향을 주는 것을 확인할 수 있다. 더욱 정확한 발 현의 차이를 확인하기 위해 ImageJ Program을 이용해 단백 질 발현도를 수치화 하였으며, 발현의 차이를 확인하였다 (Figure 3(b)). 이상의 결과를 살펴볼 때, RJHE는 3T3-L1 지 방전구세포에서 분화에 핵심적인 역할을 하는 PPARγ 및 C/
EBPα 단백질의 발현을 억제시키고 지방산과 중성지방 합성 에 영향을 주는 Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) 단백질의 발 현 또한 억제시켜 RJHE가 항비만 효과를 나타내는 것을 확 인할 수 있다. 따라서 이러한 RJHE의 항비만 효과를 이용해 건강기능식품과 같은 기능성 소재로 사용하기 위해서는 RJHE의 항비만 효과를 가진 단일물질의 탐색 및 분리가 필 수적이다.
4. CONCLUSION
본 연구는 천연물 유래 물질을 통해 항 비만 치료제를 개발 하기 위한 기초 연구로써, 천연물인 양제근의 유효 성분을 에탄올을 통해 추출 및 분리하여 그 효과를 증명하였다. 선 행연구에서 항 염증 및 항암 등 여러가지 효과가 입증된 양 제근을 통해 아직 밝혀지지 않은 항 비만에 대한 효과를 입 증함으로써 기능성 식품 및 의약품 소재로써 양제근의 가능 성을 입증 할 수 있는 연구이다.
아직 임상 실험 및 동물 실험이 수행되지 않아 기능성 소재 로 활용되기에는 부족하며 연구에 사용된 추출물의 농도는 임상 실험에 사용되기 적합하지 않기 때문에 항 비만에 효과 Fig. 2. (a) Liqid accumulation was measured by Oil Red O
staining. The intracellular lipid droplets in the adipocyte cells were decreased in dose-dependent manner. Representative images of the cells were captured. The photographs were taken at a magnification of × 200. (b) The concentrations of triglycerides (TG) were measured by ELISA assay. The concentrations of triglycerides in the adipocyte cells were decreased in dose-dependent manner. Triglycerides content was quantified by measuring absorbance using FLUOstar Omega (BMG labtech, Germany). N represents untreated cells. The statistical analysis of the data was carried out by use of ANOVA test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <
0.001 compared to N (untreated groups). N.S; not significant (each experiment, n=3). The error bars represent the standard error.
Fig. 3. (a) The expression of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARγ), C/EBPα, Acetyl-CoA Carboxylase (ACC) and β-actin were analyzed by Western blot analysis. The β-actin probe served as protein-loading control. The figure shows non-adjacent bands from the same blot. (b) Relative band intensity of PPARγ, C/EBPα, Acetyl-CoA Carboxylase(ACC) using the Image program.
적인 성분을 분리 및 탐색하는 과정이 필수적이다. 이러한 한계점을 해결하기 위해 본 연구실에서는 양제근을 이용한 단일 물질의 탐색 및 분리를 HPLC (high-performance liquid chromatography)를 통해 진행 중에 있으며 in vitro 상의 효과 는 물론 in vivo 및 인체에 유효한 효과도 증명해내어 항비만 기능성 소재로써 활용이 가능할 것이라고 사료된다.
Acknowledgements
본 연구는 2019년도 (주)포바이오의 용역 사업에 의해 수행 되었음.
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