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백서에서 재조합 Lentivirus를 이용한 생체내 Erythropoietin 전달체계의 개발
충북대학교 의과대학 내과학교실, 의학연구소
이 미 자․김 승 택
In vivo Erythropoietin Delivery Using Lentiviral Vector in Rats
Mei-Zi Li, M.D., Seung-Taik Kim, M.D.
Department of Internal Medicine and Medical Research Institute College of Medicine, Chungbuk National University
Background : Erythropoietin (EPO) is a 30.4kDa glycoprotein that serves as the primary regulator of red cell production in mammals. Recombinant erythropoietin has been used in the treatment of anemia associated with numerous chronic diseases. Ex vivo therapy of recom- binant EPO, however, requires large dose and frequent administration, which gives financial impact to the patients. In vivo delivery of EPO using gene therapy method can solve this pro- blem.
Methods : Recombinant lentiviral vectors containing the rat EPO gene were made by co- transfection of 293T cell with pRRL-cPPT-CMV-EPO-PRE-SIN, pMDL, pVSVG, and pREV plas- mids. These viruses were concentrated and intramusculary injected into the groin muscles of Fisher 344 rats. Sequential complete blood counts were measured periodically thereafter.
Results : Virus doses of 6×107 infectious units and 6×106 infectious units produced signi- ficantly increased hemoglobin and hematocrit values, being 24.9±0.19g/dL, 66.9±0.62% (P<
0.01, N=5) and 18.4±0.55g/dL, 54.6±1.71%(P<0.01, N=5), respectively at 40 weeks after in- jection, over values of control animals receiving normal saline (15.2±0.42g/dL, 44.6±0.49%, N=5).
Conclusion : Lentiviral vectors are able to transduce skeletal muscle and are capable of achieving sustained expression and systemic delivery of EPO following intramuscular admini- stration. Gene therapy using lentiviral vectors may provide a practical strategy for in vivo delivery of therapeutic proteins. (Korean J Hematol 2003;38:176～182)
Key Words : Gene therapy, Erythropoietin (EPO), Lentiviral vector, Skeletal muscle
1)
이 논문은 과학기술부 한국과학재단 지역협력연구센터사업 충북 대학교 생물건강산업 개발센터의 연구비로 연구되었음.
접수 : 2003년 7월 7일, 수정 : 2003년 8월 11일 승인 : 2003년 8월 14일
책임저자 : 김승택, 충북 청주시 개신동 산 48 충북대학교 의과대학 내과학교실 Tel : 043)269-6354, Fax : 043)273-3252, E-mail : [email protected]
서 론
적혈구 조혈인자(Erythropoitin; 이하 EPO로 약함)는 30.4kDa의 당단백으로 적혈구생성에 가장 중요한 역할을 하는 조혈인자이다.1,2) 이는 주로 신장에서 만들어지며 저산소증이 가장 강력한 생성자극인자이다. 재조합 EPO 는 만성 신부전에 따르는 빈혈, 암, 만성 염증성 질환, 후천성 면역결핍증 등에 병발하는 빈혈의 치료에 이용될
뿐만 아니라, 수술 전에 투여하여 타인 적혈구의 수혈 필요 성을 감소시키기 위하여도 이용된다. 또한 재생불량성빈 혈, 불응성빈혈 등의 소위 특발성 조혈장애에 의한 빈혈에 서도 이용된다. 그러나 재조합 EPO는 고용량을 반복적으 로 사용여야 하므로 경제적 부담이 상당하다. 따라서 장기 적이며 안정적으로 EPO의 공급이 가능한 치료법의 개발이 시급한 실정이다.
유전자 치료법은 DNA 재조합 방법(recombinant DNA technology)을 이용하여 새로운 유전자(functioning gene) 를 직접 또는 간접적인 방법을 이용하여 세포에 삽입하여 그 세포의 생물학적 특성을 교정하거나, 또는 질병의 치료 에 필요한 단백질을 생산하게 하고 이를 질환의 치료에 이 용케 함으로서 치료효과를 얻는 방법이다.3～5) 이러한 유전 자요법의 특징을 살려 EPO를 생체 내에서 지속적으로 생 성케 할 수 있다면 다양한 질환에서 수반되는 빈혈의 치료 에 사용할 수 있을 것이다. 유전자요법에서 가장 중요한 부 분은 효과적인 유전자 이입방법과 이입된 유전자의 효율적 이며 안정적인 발현이다. Lentiviral vector는 retrovirus의 일종이나, 다른 retroviral vector와는 달리 분열하는 세포 뿐 아니라 성장이 멈춘 세포나 분화가 끝난 세포를 감염시 킬 수 있다는 점이 장점이다.6,7) 그 대표적인 예가 human immunodeficiency virus (HIV)를 근간으로 한 것으로, 몇 몇 accessary 유전자를 제거한 HIV 벡터의 경우 외막단백 질을 vesicular stomatitis virus의 외막단백질을 이용할 경 우 농축과정에서의 손실을 줄일 수 있을 뿐만 아니라8) 뇌, 간, 근육세포 등 광범위한 세포를 감염시킬 수 있고9～11) 14 개월 이상 지속적인 유전자 발현을 유도할 수 있음이 보고 된바 있다.12) 특히 요즈음 개발된 3세대 lentiviral vector는 wild type의 HIV가 생성될 확률이 미미하여 일반실험시설 에서도 조작이 가능할 정도로 안전성이 입증되어 있다.13) 이러한 특징을 가진 lentiviral viral vector를 이용하여 EPO 유전자를 생체 내의 분열이 멈춘 세포에 이입할 수 있다면 쉽게 생체내에서 EPO 발현체계를 만들 수 있을 것이다.
이에 본 연구진은 쥐의 EPO 유전자를 포함하는 lenti- viral vector를 만들고 대상세포에 이 recombinant lenti- virus를 감염시켜 EPO의 분비능을 분석한 다음, 실질적으 로 생성된 recombinant lentivirus를 쥐의 대퇴부근육에 주 사한 후, 적혈구 동태를 관찰하는 과정을 통하여 EPO 유 전자요법의 유용성을 검토하고자 하였다.
재료 및 방법 1. 시험관내 실험(in vitro test)
1) EPO 유전자를 가진 lentiviral vector 제작 (1) pRRL-cPPT-CMV-EPO-PRE-SIN plasmid 제작
Lentiviral 벡터의 명칭은 배열 유전자 순으로 명명된 것 으로 RRE : HIV Rev response element, cPPT : HIV-1 central polypurine tract, CMV : human cytomegalovirus promoter, X : multi-cloning site, PRE : human hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, EPO : rat erythropoitin gene, SIN : self inactivating을 약칭한 것이 다. pRRL-cPPT-CMV-X-PRE-SIN backbone plasmid는 Romain Zufferey박사(Salk Institute)로부터, 쥐의 EPO 유 전자가 들어있는 plasmid (pBSK-EPO)는 Jean-Paul Boi- ssel박사(Harvard University, USA)에게서, 293T 세포주 와 HeLa 세포주는 이찬희 교수(충북대학교 자연대학)로부 터 기증받아 사용하였다.
pRRL-cPPT-CMV-EPO-PRE-SIN의 제작은 표준적인 분자생물학적 방법을 이용하였다.14) EPO 유전자가 들어있 는 pBSK-EPO plasmid를 EcoRI과 XhoI 제한효소로 소화 시킨 다음 agarose gel에 전기영동하고 원하는 크기의 band만을 추출(elusion)하여 EPO 유전자를 pBSK-EPO plasmid로부터 분리하였다. Multicloning site (X)를 EcoRI과 XhoI제한효소로 소화시킨 pRRL-cPPT-CMV-X- PRE-SIN plasmid를 phenol/chlorform으로 처리하여 정제 하였다. EPO와 lentiviral 벡터를 T4 DNA 결합효소를 이 용하여 16℃에서 하룻밤 배양하고, DH5α 균주에 전환 (transformation)시킨 다음, ampicillin (0.8mg/mL)이 함 유된 SOB agar plate에 분주하여 37℃에서 하룻밤 배양하 였다. 형성된 colony중 12개 정도를 무작위로 선정하여 mini-prep법을 이용하여 EPO가 정방향으로 삽입된 균주 를 찾아낸 다음, 이 균주를 배양 확대하고 mega-prep법을 이용하여 대량의 pRRL-cPPT-CMV-EPO-PRE-SIN plas- mid를 얻었다(Fig. 1).
(2) Recombinant lentivirus generation
제작된 pRRL-cPPT-CMV-EPO-PRE-SIN 23µg과 pMDL 15µg, pVSVG 8µg, pREV 11.5µg 각각을 혼합한 후 phenol/chloroform 추출을 통하여 정제하여 건조시켰 다. 하룻밤 동안 TE buffer에 녹인 후 calcium phosphate 법으로 293T cell에 transfection시켰다. 16시간 동안 CO2
배양기에서 배양한 후 상층액을 교환하고 48～72시간 더
Fig. 1. Construction of recombinant lentiviral plasmid containing an erythropoietin (EPO) gene. RSV : Rous sarcoma virus and HIV chimeric long terminal repeat, RRE : HIV Rev response element, cPPT : HIV-1 central polypurine tract, CMV : human cytomegalovirus promoter, PRE : human hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, U3LTR : deletion in the HIV-1 LTR U3 sequence.
R SV R R E cPPT C M V PR E
X
∆U 3LTR EcoR 1 Xho1
EPO
EcoR 1 Xho 1
EcoR 1 1
pB SK pR R L-cPPT-C M V -X -PR E-SIN
EcoR1 EcoR 1
Xho1 Xho1
T4D N A ligase Transform ation M ini-prep & m axi-prep
R SV R R E cPPT C M V EPO PR E SIN
EcoR 1 1
EcoR 1 1
pB SK pR R L-cPPT-C M V -X -PR E-SIN
EcoR1 EcoR 1
Xho1 Xho1
T4D N A ligase Transform ation M ini-prep & m axi-prep
R SV R R E cPPT C M V EPO PR E SIN
EcoR1 EcoR 1
Xho1 Xho1
T4D N A ligase Transform ation M ini-prep & m axi-prep
R SV R R E cPPT C M V EPO PR E SIN
배양하였다. 상층액을 수거하여 0.22nm filter에 통과시킨 후 30,000g 하에서 2시간 원심분리하여 가라앉은 lentiviral pellet를 TNE buffer에 다시 suspend하여 대상세포(target cell)로의 감염에 사용하였다.
(3) 바이러스 역가 측정
바이러스 역가는 lentivirus-GFP (green fluorescent protein)를 HeLa 세포에 감염시킨 후 녹색형광이 나타나는 세포수를 FACS로 측정하고, 상층액에서의 바이러스 p24gag 단백질을 ELISA kit로 측정하는 방법에 따랐다. 즉, 5×105 HeLa 세포를 6cm dishes에 배양하고 농축한 lentivirus-GFP를 DEAE dextran (10µg/mL)이 존재하는 조건에서 상층액에 넣어 HeLa 세포를 감염시켰다. 16시간 후에 다시 배양액을 바꿔준 후 48시간이 지난 다음 세포를 phosphate-buffered saline (PBS, NaHPO4․7H2O 1.44 g/L, KH2PO4 0.24g/L, NaCl 8g/L, KCl 0.2g/L, pH 7.4)에 3번 세척한 후 trypsin으로 처리하여 수확한 다음 2% paraformaldehyde로 고정시킨 후 FACS를 이용하여 판독하였다. 대조군으로는 바이러스에 감염시키지 않은 HeLa 세포를 사용하였다. 농축하기 전의 lentivirus-GFP 가 들어있는 배양액 1mL에서 p24gag 단백질을 ELECSYS 2010 (ROCHE)으로 측정하여, 바이러스 p24gag 단백질 1ng에 해당되는 녹색형광이 나타나는 HeLa 세포수에 근거 하여 바이러스 역가를 정하였다.
(4) 대상세포에서의 EPO 분비능 분석
Lentivirus-EPO를 Hela cell에 감염시키고 배양한 후 상 층액을 수거하여 상층액 내의 EPO 농도를 ELISA법으로 측정하였다.
2. 생체내 실험(in vivo test)
1) 골격근 세포에로의 lentivirus 투여모델의 확립 Fisher 344 백서(120～150g)를 에테르 마취시킨 후, 대 퇴근 4～6곳에 위의 방법대로 제작한 lentivirus-GFP를 DEAE-dextran (20µg/mL)의 존재 하에서 천천히 주사하 였다. 2주 후와 10주 후에 쥐를 희생시키고 주사한 부위의 근육을 쾌속 냉동 절편 슬라이드를 만들고 confocal laser scanning microscope 하에서 GFP가 세포내에 존재하는지 의 여부를 확인하였다.
2) EPO 유전자 치료모델이 백서에서 혈구의 변화를 가져올 수 있는지의 검정
치료군은 위의 방법대로 제작한 lentivirus-EPO vector 를 DEAE-dextran (20µg/mL)하에서 Fisher 344 순종백 서 대퇴근 4～6곳에 주사하였다. 바이러스 역가는 각각 6
×106IU/mL (낮은 농도 바이러스 투여군, N=5)과 6×107 IU/mL(높은 농도 바이러스 투여군, N=5)로 하였으며, 대 조군에는 동일한 체적의 생리식염수를 주사하였다. 이후, 바이러스 주사 후 한달 간은 1주일에 2회, 2개월 째에는 1 주일간격으로, 그 후에는 2주 간격으로 꼬리정맥에서 채혈 하여 적혈구용적, 혈색소, 백혈구수, 혈소판수를 K-1000 자동혈구 측정기(TOA, Japan)로 측정하였다.
3. 통계학적 처리
유전자 치료군과 대조군 사이에서 시간에 따른 적혈구용 적, 혈색소, 백혈구, 혈소판의 비교는 Student's t-test로 처리하였다.
Fig. 2. Green fluorescent protein (GFP) expression observed by fluorescence microscopy. HeLa cells were infected with recombinant lentivirus-GFP (400×magnification).
Table 1. Erythropoietin production from infected HeLa cells
Viral vector Titer Erythropoietin (IU/mL) (mU/mL)
Lenti-EPO 4×105 124.0
Lenti-GFP 4×105 0.6
Abbreviations; EPO, erythropoietin; GFP, green fluorescent protein
Fig. 3. Stable and long-term gene expression from muscle cells by in vivo gene transfer using a lentiviral vector. After in vivo GFP gene transfer by direct injection of recombinant lentiviral vectors to non-dividing skeletal muscle of groin in experimental rats, GFP ex- pression was detected by confocal microscopy at 2 weeks (A) and 10 weeks (B). Bar=100µm.
결 과 1. 시험관내 실험(in vitro test)
1) 재조합 lentivirus의 생산 및 바이러스 역가 293T cell에 transfection된 pRRL-cPPT-CMV-EPO- PRE-SIN, pMDL, pVSVG, pREV에서 lentivirus가 만들 어지는지의 여부를 p24 단백질의 존재와 GFP를 발현할 수
있는 lentiviral plasmid를 이용하여 검증하였다. 그 결과 transfection이 이루어진 293T cell의 배양액에서 p24가 검출 되었으며. 이 배양액으로 감염시킨 HeLa cell에서 GFP의 존 재를 관찰할 수 있었다. GFP 유전자를 포함하는 lentivirus- GFP의 경우, transfection이 끝난 293T 세포주의 상층액의 농축액 1mL을 HeLa 세포에 감염시켜 형광현미경으로 관찰 한 결과, 형광을 발현하는 세포를 관찰할 수 있었다(Fig.
2). FACS를 이용하여 GFP를 발현하는 세포의 수를 정량한 결과 1ng의 p24gag 단백질은 1.4×104개 정도의 HeLa 세포 를 감염시켰다.
2) 대상 세포에 재조합 EPO의 감염 및 분비능 측정 EPO 유전자을 포함한 lentiviral plasmid를 이용하여 lentiviral vector를 생성하고 이를 HeLa cell에 감염시킨 후 72시간 후에 배양액을 ELISA 방법을 이용하여 검사한 결 과 바이러스 역가가 4×105IU/mL로 감염시켰을 때, lenti-EPO에서는 124.0mU/mL, lenti-GFP (보고 유전 자)에서는 0.6mU/mL가 검출되었다(Table 1).
2. 생체내 실험(in vivo test)
1) 골격근 세포로의 lentivirus 투여의 확립
Fisher 344 동종 쥐의 좌우 대퇴근 4～6곳에 위의 방법 대로 제작한 lentivirus-GFP를 DEAE-dextran (20µg/
mL)의 존재 하에서 천천히 주사하였다. 2주 후와 10주 후 쥐를 희생시키고 주사한 부위의 근육을 쾌속 냉동 절편 슬 라이드로 만든 후 confocal laser scanning microscope 하 에서 관찰한 결과 근육세포에서 GFP가 2주째에는 물론 10 주째에도 발현됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
2) Lentivirus-EPO 투여 후 백서에서의 혈색소의 변화 각각 6×106IU/mL, 6×107IU/mL의 역가로 lentivirus-
A B
Fig. 5. Serial analysis of hematocrit of lentivirus-EPO treat- ed rats and control rats. Symbols are rats receiving lenti- virus-EPO of 6×107IU/mL((￭) or 6×106IU/mL (▲) and control rats receiving saline (•).
45 50 55 60 65 70 75
0w 4w 8w 12w 16w 20w 24w 28w 32w 36w 40w Weeks
Hematocrit(%)
Control (N=5)
High dose (N=5) Low dose (N=5)
≈
Fig. 4. Serial analysis of hemoglobin of lentivirus-EPO treated rats and control rats. Symbols are rats receiving lentivirus- EPO of 6×107IU/mL (￭) or 6×106IU/mL (▲) and control rats receiving saline (•).
16 18 20 22 24 26 28
0w 4w 8w 12w 16w 20w 24w 28w 32w 36w 40w Weeks
Hemoglobin (g/dL)
Control (N=5)
High dose (N=5) Low dose (N=5)
≈
Table 2. White blood cells and platelet counts in treated and control rats
White blood cells Platelets 103/µL 103/µL Saline control (N=5) 10.9±1.34† 525.3±55.57* Erythropoietin
6×106 IU/mL (N=5) 9.8±1.78† 484.8±60.53* 6×107 IU/mL (N =5) 9.9±1.47† 494.3±54.63* Data are expressed as mean±SD
*P>.05, †P>.06,
EPO를 백서 대퇴근에 투여 한 후, 백서의 혈색소는 각각 기저치 15.2±0.42g/dL, 15.3±0.25g/dL로부터 서서히 상 승하기 시작하여 주사 4주째에는 15.8±0.27g/dL, 17.6±
1.00g/dL, 주사 18주째에는 18.3±0.08g/dL, 24.5±0.47 g/dL까지 상승하였고, 이후에는 상승된 혈색소치를 유지하여 40주에서는 18.3±0.38g/dL, 24.6±0.64g/dL(P<0.01) 이었다(Fig. 4).
3) Lentivirus-EPO 투여 후 백서에서의 적혈구용적 의 변화
각각 6×106IU/mL, 6×107IU/mL의 역가로 lentivirus- EPO를 백서 대퇴근에 투여 한 후, 백서의 적혈구용적은
각각 기저치 44.6±0.29%, 44.6±0.49%로부터 서서히 상승하기 시작하여 주사 4주째에는 47.8±0.56%, 50.2±
1.32%, 주사 18주째에는 52.9±0.94%, 66.9±0.62%까 지 상승하였고, 이후에는 상승된 적혈구용적을 유지하여 주사 후 40주에서는 54.1±1.74%, 65.3±1.74% (P<
0.01) 이었다(Fig. 5).
4) Lentivirus-EPO 투여후 백서에서의 기타 혈액세 포 성분의 변화
각각 6×106IU/mL, 6×107IU/mL의 역가로 lentivirus- EPO를 백서 대퇴근에 투여 한 후 관찰한 백서의 백혈구수 와 혈소판수는 실험기간동안(시작부터 40주까지) 기저치 수준과 유의한 변화는 없었다(Table 2).
고 찰
본 연구는 재조합 lentiviral-EPO vector를 백서의 대퇴 부 근육에 주사하였을 때 적혈구의 상승을 가져올 수 있는 지의 가능성을 검정하고자 하였다. 본 연구에서 사용한 lentivirus는 retrovirus의 일종으로 사람에게서 후천성면역 결핍증 등의 질병을 일으킨다. 이 바이러스를 골격으로 하 여 만든 viral vector는 초기에는 상당한 위험성을 가질 수 있었으나 개량을 거듭한 결과 안전성이 입증되고 있다.
Retroviral vector의 장점에 더하여 이 vector는 분열하지 않는 세포로 유전자를 이입시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 세포를 체외에서 배양하는 번거로움 없이 직접 체내 에서 치료유전자를 원하는 대상세포에 이입시킬 수 있다.
본 연구결과를 보면 lentiviral plasmid에 GFP, EPO 등 의 유전자를 포함시키고 이를 packaging에 필요한 plasmid 와 함께 세포에 transfection시킬 때 세포로부터 recombi- nant lentivirus가 생성됨을 알 수 있었고, 이 virus를 대상 세포에 감염시켰을 때, 해당 단백질이 대상세포에서 발현 될 뿐 아니라 세포 외로도 분비될 수 있음을 알 수 있었다.
GFP 유전자를 포함한 재조합 lentiviral vetor를 제작하여 백서의 대퇴근에 주사하고 근육세포에서의 GFP의 발현을
괄찰한 모델에서 2주 후는 물론 10주 후까지도 녹색형광을 관찰할 수 있어서 외래 이입 유전자로부터의 단백질 발현 이 in vivo에서 장기간 가능하다는 것을 알 수가 있었다.
Kafri 등10)은 더 나아가 lentivirus-GFP를 근육세포에 주사 하여 30주 후에도 녹색형광을 관찰할 수 있다고 보고하였 다. 즉 근육세포를 대상으로 한 유전자요법은 장기간에 걸 친 유전자 발현이 필요한 질환에 매우 좋은 모델이 될 수 있음을 확인할 수 있었다.
Lentivirus-EPO 바이러스 투여 후 혈색소 및 적혈구용 적의 변화를 보면 이식 후부터 서서히 증가하기 시작하여 제 18주째에 최고치, 즉 혈색소는 최고로 기저치의 163%, 적혈구용적은 기저치의 150%까지에 달하였으며, 이러한 증가상태가 그 후에도 지속되어 치료 38주 째에도 혈색소 및 적혈구용적이 증가된 상태를 관찰할 수 있었는데, 이는 투여 된 viral vector에 의하여 대퇴부 근육세포에 이입된 EPO 유전자로부터 EPO의 생성분비가 장기간 안정적으로 이루어짐을 의미한다. 반면 백혈구 및 혈소판의 변화는 없 었는데 이것은 EPO가 적혈구계에만 작용하므로 대부분의 임상연구실험에서 장기간 EPO를 투여하였을 때 백혈구 등 의 변화가 없었다는 결과와 일치한다.15)
본 연구진은 이미 retrovirus를 매개로 하여 혈관 평활근 세포에 EPO 유전자를 이입하고 이를 쥐 경동맥에 이식하 여 EPO를 분비하게 하는 연구결과를 발표한 바 있다.16) 비록 효과적인 EPO의 분비를 확인하였지만, 분열하는 세 포에만 이입이 가능한 retroviral vector의 특성상 혈관 평 활근세포를 체외에서 배양하고 이를 혈관벽에 이식시키기 위하여 작은 혈관을 조작하는 상당한 기술과 주의가 필요 하다는 단점이 있었다. 즉 retrovirus의 경우 viral vector를 제작한 후에도 ex vivo에서 평활근세포를 배양하고 이어 생 체 내로 이식하여야 하는 복잡한 과정을 거쳐서 이루어지 는 유전자요법이라는 단점이 있다. 본 실험에서는 lenti- viral vector를 제작하면 쥐의 근육세포에 직접 투여하여 유 전자이입을 시도할 수 있어 동물실험이 매우 간편하였다.
또한 치료유전자의 발현이 장기간 안정적으로 이루어질 수 있다는 점도 증명할 수 있었다. 투여한 바이러스의 양을 달 리해 본 결과, 혈색소 및 적혈구용적의 변화가 바이러스의 농도에 의존함을 관찰할 수 있었는데, 이는 투여하는 바이 러스의 역가를 달리하면 생성되는 EPO의 양을 조절할 수 있어 빈혈의 정도에 따른 치료가 가능함을 시사해 준다. 이 러한 점에 비추어, 만성 신부전 등의 질환 동물모델에서의 효용성에 대한 검토를 거치면 lentiviral vector를 이용한 EPO 유전자요법은 임상적으로도 쉽게 적용할 수 있는 유 전자 치료방법이 되리라 생각한다.
요 약
배 경 : Erythropoitin (EPO)은 30.4kDa의 당단백으로 서 적혈구생성에 가장 중요한 역할을 하는 조혈인자이다.
EPO는 빈혈을 수반하는 여러 질환의 빈혈 교정을 목적으 로 사용되고 있다. 그러나 고용량을 반복적으로 사용함에 따른 경제적 부담이 상당하다. 이러한 부담을 해결하기 위 해서 본 실험에서는 EPO 유전자를 포함하는 재조합 len- tivirus를 이용한 in vivo delivery system의 효용성을 동물 모델에서 검토하고자 하였다.
방 법 : EPO 유전자를 가지는 lentiviral vector인 pRRL- PPT-CMV-EPO-PRE-SIN을 pVSV-G, pMDL, pREV plasmid와 함께 293T 세포에 transfection하여 재조합 lentivirus-EPO를 얻었다. 바이러스를 농축하여 정상 백서 의 대퇴부 근육에 바이러스 역가를 달리하여 재조합 바이 러스를 투여한 후, 일정간격으로 CBC를 검사하여 효과를 검증하였다.
결 과 : 바이러스 역가가 6×107IU/mL과 6×106IU/mL 일때 백서의 혈색소와 적혈구용적은 현저하게 상승하였다. 바 이러스 주사 후 40주째에는 각각 24.9±0.19g/dL, 66.9±
0.62%(P<0.01, N=5)와 18.4±0.55g/dL, 54.6±1.71%
(P<0.01, N=5)로서 대조군에(15.2±0.42 g/dL, 44.6±
0.49%, N=5) 비하여 현저하게 상승하였다.
결 론 : Lentiviral vector는 골격근으로의 형질도입이 가 능할 뿐만 아니라 근육주사 하였을 때 EPO의 안정적인 발 현도 가능하였다. Lentiviral vector를 이용한 유전자 치료 는 in vivo에서 치료단백질을 장기간 필요로 하는 경우에 사용할 수 있음을 제시한다.
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