미생물을 이용한 절삭유제의 부패성능 평가에 관한 연구
김영운†·홍광민*·정근우·박찬조 한국화학연구원신화학연구단유제화학연구센터
305-600 대전시유성구장동 100
*충북전산기계고등학교
361-823 충북청주시홍덕구분평동 1257 (2006년 5월 29일접수, 2006년 6월 28일채택)
The Study on Decomposition of Metal-working Fluids Against Microbes Young-Wun Kim
†, Kwang Min Hong*, Kunwo Chung and Chan-Jo Park
Surfactant & Lubricant Research Team, New Chemistry Division, Korea Research Institute of Chemical Technology, 100, Jang-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-600, Korea
*Chungbuk Mechatronics High School, 1257, Bun-pyeong-dong, Heungduk-gu, Cheong-ju, Chungbook 361-823, Korea (Received 29 May 2006; accepted 28 June 2006)
요 약
절삭유제의미생물에대한부패능을평가하기위하여미생물의성장유형을조사하고조절된균을절삭유제에접종 하여부패능을실험하였다. 미생물의성장곡선실험결과, 균의대수성장기는균의종류에따라다르게나타났으며
E. coli균의대수성장기는배양후 2시간, K. pneumoniae균은 3시간, P. aeruginosa균은 4시간, P. oleovarans균은
3시간이었다. OD 값을 0.5로조절한접종액의E. coli균수는 4.4~10.0×105 CFU/mL, K. pneumoniae균수는 1.8~9.5
×107 CFU/mL이었다. 미생물의부패에대한 pH의영향을살펴본결과, pH 6~8에서부패가왕성하게진행되었고 pH가
4이하, 10이상에서는균이성장하지못함을알수있었다. pH를중성으로유지하고내마모제의구조에따른부패능 을실험한결과, 에스테르형내마모제가에틸렌글리콜형내마모제보다부패가빠르게진행되어구조에따라부패능 의차이를나타내었다.
Abstract −Growth curves of microbes were examined to evaluate decomposition of metal-working fluids and decom- position properties of metal-working fluids were experimented using controled microbes such as E. coli and K. pnemo- niae. According to the results of growth curve of microbes, the growth period depended on species of microbes, 2 h of E. coli, 3 h of K. pneumoniae, 4 h of P. aeruginosa and 3 h of P. oleovarans after incubation. The colony count of E. coli and K. pneumoniae controled to OD of 0.5 ranged from 4.4~10×105 CFU/mL and 1.8×9.5×107 CFU/mL, respectively.
The decomposition of metal-working fluids was excellently progressed in the range of pH 6~8 than below pH 4 and above pH 10. In the case of controled fluids to pH 6~8, the decomposition of the fluid containing ester group was more accelerated than that of the fluid containing ethylene glycol.
Key words: Microbes, Metal-working Fluids, E.coli, K. pneumoniae, Colony
1. 서 론
여러가지금속재료의불필요한부분을절삭이요구되는형상으 로가공하는금속가공분야에서, 가공능률이나가공정밀도를높이 기위하여절삭유제라고불리는액상의물질이사용되고있다. 절 삭유제는공업규격에따라비수용성과수용성으로구분되고, 현재 비수용성절삭유제가절삭성능과부식방지성이우수하여주로사용 되고있다. 그러나최근에비수용성절삭유제에대하여가공작업과
정과폐유처리과정에서유독성과환경공해상의문제가제기됨에따 라각나라마다 ‘환경마크’ 인증제도를실시하여환경친화적인수 용성절삭유의개발과이들의사용이점차증가하고있다. 지금까 지개발된수용성절삭유제는비수용성절삭유제에비교하여절삭 성능저하, 거품생성및미생물증식에의한부패문제등이제기 되어이들을해결하려는연구가활발히진행되고있다. 지금까지절 삭성능을향상시키기위하여수용성내마모첨가제를합성하여첨 가제로사용하려는연구가주류를이루고있다. 수용성내마모제로 폴리알킬렌글리콜의지방산에스테르[1], 폴리알킬렌글리콜에테르
[2], 폴리알킬렌글리콜과경계윤활향상제인지방산의혼합물[3]인에
†To whom correspondence should be addressed.
E-mail: [email protected]
틸렌옥사이드와프로필렌옥사이드의에스테르[4], 이염기산의모노
에스테르[5], 히드록시스테아린산의에스테르[6] 등이있고, 이들을
첨가한절삭유제의절삭성능에관한논문이최근에발표되고있다.
그러나수용성절삭유제의부패정도를평가할수있는공인된부 패능실험방법은알려진것이없고오일의생분해도[7] 및수용성 유제의생분해도[8]를평가하는방법은알려져있다. 특히, 수용성 내마모제와경계윤활특성을향상시키기위한첨가제등의미생물에 의한부패능에관한연구논문은거의발표된바없다. 절삭유제의 부패액에서 출현하는주요 미생물은Escherichia coli (E. coli), Klepsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Paracolabactrum sp (P. sp), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Pseudomonas oleovorans (P. oleovorans), Proteus vulgaris 등의호기성균임이밝혀져있으며
[9] 본연구에서는위에서언급한여러가지호기성균중에서E. coli
와K. pneumoniae균을사용하여폴리에틸렌글리콜(PEG), 지방산 에스테르및절삭유제(비교대상으로 A사의부패방지제가처방되지 않은제품)의부패능을시험하였다.
2. 실 험
2-1. 실험재료
부패실험에사용된 PEG600은동양화학사의시약급, P6A는아디
프산과 PEG600을축합반응하여합성한폴리에스테르[10], 절삭유
제는부패방지제를처방하지않은 A사의제품을사용하였다. 부패 평가방법을확립하기위하여부패실험에사용하는호기성균은다 음과같이일정하게조절하여접종하였다[11].
①Nutrient broth 배지를제조한후고압증기멸균(121oC, 15 min)한다.
②멸균된배지에미리배양한고체평판배양의 colony를접종
하여 37oC에서하루동안진탕배양한다.
③ 600 nm의파장에서 O.D(optical density)값이 0.19가되도록 배양액적당량을취해멸균된새로운배지에접종한다.
④ 37oC의배양기에서배양하면서일정한시간간격으로시료를
채취하여 O.D 값을측정하고그래프에표시한다.
⑤위실험결과로작성된미생물생장곡선으로부터각균의대수 성장기에해당하는배양시간을확인한다.
⑥①~⑤의과정을통해대수성장기의균을배양한다.
⑦배양액을원심분리(2,000 rpm, 10 min)한후생성된 pellet을
O.D 값이 0.5가되도록완충용액(sodium phosphate)으로용해한다.
⑧ O.D 값이조절된균액을시험유제에접종한후시간에따른
균수를평판배양법에의해측정하고이것으로각시료의미생물에 대한부패도를평가한다.
2-2. 미생물성장곡선
일반적으로미생물의성장기는유도기, 대수기, 정지기, 사멸기등 의 4단계로구분되는데각단계마다균의특성이다르므로같은상 태의균을선택하기위하여미생물의성장곡선실험을행하였다.
미생물의성장속도를살펴보기 위하여E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, P. oleovarans균주를영양배지에서배양하여 colony
상태로냉장보관하였다가멸균되어있는 broth에접종하여 37oC
에서 24시간동안배양한후(overnight culture), 새로운 broth에일 정농도(600 nm에서 Optical Density≒0.19)를접종하여배양하면서 배양시간별로분광기를이용하여 OD 값을측정하고배양시간에따
른 OD 값의상관관계그래프를그렸다. 그래프를통하여대수성장 기의균을부패실험에사용하였다.
2-3. 균주조절및 부패도시험
대수성장시까지배양한균을 2차배양(subculture)을행한 후, broth를원심분리기(2,000 rpm, 10 min)로분리하여분리된 pellet을
sodium phosphate 완충용액(10 mM)으로용해시켜반복하여원심
분리하고완충용액으로 OD 값을일정하게조절하였다(약 0.5). 조 절된 액을 10 n(n=0~10) 배율로희석하여 petri dish에도말하여
37oC에서 48 시간동안배양기에서배양하여생긴 colony를 count
하여접종액의균수를조절한다음대상유제(PEG 600, PEG-ester, A사절삭유)에접종하여부패시간에따른 colony의수로유제의부패 정도를측정하였다.
3. 결과 및 고찰
3-1. 미생물성장곡선
E. coli및K. pneumoniae균을사용하여 2-1항에서서술한①~④의 실험과정을통하여배양시간에따른 OD 값을측정한결과다음
Fig. 1과같았다. Fig. 1에서와같이배양시간에따른 E. coli균의
OD 값은완만하게증가하여배양 4시간이후에 0.6으로거의일정
하게유지되었고, K. pneumoniae균의 OD 값은배양 5시간까지거 의선형적으로증가하였고 E. coli 균에비해 2.5배의 OD 값을나 타내었다. 배양 5시간이후부터는 OD 값이일정하게유지되어감 소 성장기로 진입함을 알 수 있었다. 이와 같은 결과로부터
K. pneumoniae가 E. coli보다성장속도가빠르고대수성장기도길 게나타남을알수있었다. 또한, 균의종류에따라최대대수성장
기(max △OD)가다르게관찰되었다. 최대대수성장시간대를찾기
위하여 Fig. 1에서시간에따른균의성장폭의차이를나타내는△OD
값을구하여보면, E. coli의경우는배양후 2시간대, K. pneumoniae
의경우는 3시간대로나타났다. 따라서접종액의균수조절실험에 서 overnight culture 후 subculture 시간을 E. coli는배양후 2시간
Fig. 1. Growth curve graphs of E. coli and K. pneumoniae in the flask using basal medium (Incubation temperature: 37oC).
의균을, K. pneumoniae는 3시간으로하여가장활동적인상태의 균을원심분리하여얻은후본실험에접종액으로사용하였다. Subculture는 overnight culture에비하여매우중요하다. 왜냐하면, overnight culture는일정하게 colony를취하지않아도 24시간동안
충분히배양하면 broth의균들은증식과사멸을반복하므로더자
라지않고일정수준에머물러있는반면에 subculture는정확한 OD
값과최대대수성장기를맞추지않으면균의양과상태가달라지 므로결과값에많은오차를유발하기때문이다.
Fig. 2와 3에 OD 값에따른E. coli와P. aeruginosa의성장곡선을 나타내었다. E. coli의경우, subculture시초기접종한균의 OD 값
(0.091 vs 0.194)에따라대수성장기의차이는크지않아 max□OD
값은약 1시간의차이를나타내었다. 한편, Fig. 3의 P. aeruginosa
균의성장곡선은 subculture시초기접종한균의 OD 값(0.025 vs
0.161 vs 0.191)의차이에따라성장패턴이크게달라져서 OD 값이
클수록미생물성장속도와대수성장기가빨라짐을알수있었으며
max□OD 값은배양후 7시간, 5시간, 4시간대에나타났다. 즉, 초 기배양균수가많아 OD 값이크면대수성장시에세포분열로인 하여균수가배가적으로증가하고 OD 값도균수에정비례하여높 아진다. Fig. 4에서보는바와같이, P. oleovaransrbs의성장곡선은
P. aeruginosa의패턴과비슷하였으나대수성장기와감소성장기가
빨라짐을알수있었다. 즉, 미생물균종에따라각기다른성장곡 선특성을나타냄을알수있었다.
3-2. 접종액의균주조절실험(inoculum control test) 및부패평가 실험 결과
E. coli와 K. pneumoniae의균을사용하여대수성장기까지배양
한후균수를조절한결과 Fig. 5와같았다. Fig. 5에서보는바와
Fig. 2. Growth curve graphs of E. coli (Incubation temperature:
37oC).
Fig. 3. Growth curve graphs of P. aeruginosa (Incubation tempera- ture: 37oC).
Fig. 4. Growth curve of P. aeruginosa and P. oleovarans in the flask using basal medium (Incubation temperature: 37oC).
Fig. 5. Colony count control of E. coli and K. pnemoniae (Incubation temperature: 37oC).
같이E. coli 균은 4.4~10.0 × 105 CFU/mL의범위를나타내었으며
K. pneumoniae균은 1.8~9.5 × 107 CFU/mL이었다. K. pneumoniae
균이E. coli에비해 102배많음을알수있었고이결과는미생물 성장곡선실험에서 OD 값의차이와같은현상으로해석할수있었 다. 또한, E. coli와K. pneumoniae 균의접종액의 OD 값은약 0.5
로같지만균수는현저한차이를보이고있으며균종에따라흡광 정도가다름을알수있었다.
이상의결과로부터 CFU가조절되어그균수를알고있는접종 액(E. coli와K. pneumoniae)을실험대상유제인 PEG 600 50 wt％ 수용액(이하 P6라약함, pH 7.2), PEG-Ester 50 wt％수용액(이하
P6A라약함, 본연구실에서합성한 PEG 600과아디프산을반응하
여합성, pH 3.3) 및 A사의절삭유제(부패방지제를처방하지않음,
pH 9.9)에접종하여부패능실험을행하였다. 각유제의 pH를조절
하지않고E. coli 균에의한부패능실험결과, Fig. 6에서와같이유
제의 pH가 3.3인 P6A와 pH가 9.9인 A사의유제에서는균이적응 하지못하여부패가일어나지않음을알수있었다. pH가중성인
P6 유제는부패시간이경과하여도균수는거의일정하게유지되는 데이는 P6 유제가 E. coli균의발육을억제하지않고오히려영양 의공급원으로작용하고있다고보이며시간이경과할수록부패가 일어나리라예측할수있다. 즉, 미생물의성장은유제의 pH 6~8에 서가장활발하였는데일반적으로거의모든미생물은발육이가능
한최적 pH 조건을가진다고알려져있다[12]. P6A와 A사의유제
는균성장에부적당한산성과염기성이므로성장이거의되지못 하고사멸됨을알수있었다. 따라서, 절삭유를사용하는현장에서 도유제의 pH를일정하게유지하는것이사용수명을연장할수있 는방법일것이다. 그러나절삭유의사용중에 pH가감소하는이유 역시부패로인해생성되는부산물이산성을띠기때문이며결국 미생물에안정하여부패가잘일어나지않는유제를사용하는것이 중요하다.
pH의영향을배제하여유제의구조적차이에의한부패능을평
가하기위하여 pH를중성으로조절하여미생물이잘배양하는조 건에서 E. coli및 K. pneumoniae에의한부패능을실험하였다. 그
결과, Fig. 7에서와같이균이유제에잘적응하는것을확인할수
있었으며 pH를조절하지않았을때와다르게 P6A는일정수준까지 균이증식한후일정하게유지되면서부패가진행되었고 P6와 A사 유제는균의수가조금감소하는경향이관찰되었으나시간이경과 할수록일정수준을유지하며부패가진행되었다. P6A와 P6를비교
하여보면, P6A 유제에서균수가많은것으로관찰되었으며이와
같은이유는 P6A가균의증식에유리한에스테르형구조이어서부 패가빠르게진행되기때문으로사료된다. 유제에대한균의성장
정도를비교하기위하여 pH를조절하지않아도중성인 P6A 유제
에대하여E. coli와K. pneumoniae의성장유형을시험한결과, 성 장유형이거의유사함을알수있었다. 즉, 초기접종균수는다르 지만시간이경과할수록E. coli균수는일정하고P. pneumoniae의 균수는감소하여 8일이경과하면거의일정하게유지되었다. 이와 같은이유는균이성장및사멸을반복하면서영양원을이용하며 스스로내성과적정환경을유제로부터얻어미생물의대사작용에 사용하므로그유제가점차분해되어유제의 pH 등의물성이균이 성장하기에알맞은조건으로유지되어가는것으로생각된다. 또한,
균수는시간이경과함에따라같은유형으로변화하는것을알수 있는데이것은각균이부패에작용하는유형이같음을의미하는 것이다. 즉, 구조적으로약한부분에먼저균이작용하여분해됨을 알수있었다.
일반적으로절삭유제는 pH가염기성으로제조되고부패방지제를 처방하여사용되지만현장에서는가공칩의오염, 사용온도의변화 등으로인하여부패가일어나고있다. 따라서, pH에상관없이절삭 유제를부패평가하기위하여기존의방법(100배희석한유제 45 mL
에접종액 5 mL를넣고밀봉하여 37oC 인큐베이터에서배양을하
면서생균수측정)의조건을다음과같이변화하여부패실험을행 하였다. 즉, 기존의방법에주철칩(FC 20) 2 g과 mineral substrate 5 mL를넣고여러가지조건을바꿔가면서실험을행하였다. 실험 대상유제로 A사의절삭유제(부패방지제를처방하지않음, pH 9.9)
를사용하였으며접종액으로는 E. coli와K. pneumoniae의균을사 용하였다. 그결과를 Table 1에나타내었다. Table 1에서보는바와 같이 기존의실험방법에서는생장하지않았던 균이주철칩과
Fig. 6. Influence of pH on the decomposition against E. coli (upper) and K. pneumoniae (bottom) of metal-working fluids (Incuba- tion temperature: 37oC).
mineral substrate를첨가한유제에서는상온에서개봉하여실험하였 을때균이생장함을알수있었다. 따라서, 이조건을바탕으로
E. coli와 K. pneumoniae의균을간헐적으로접종하면서상온에서 개봉하여부패능을실험하여생균수를측정하였으며그결과를
Table 2에나타내었다. Table 1에서보는바와같이시간이경과하면
서부패가일어남을알수있었으며E. coli 균보다는K. pneumoniae
균이부패에더큰 영향을미침을알수있었다. 또한, E. coli와
K. pneumoniae의균을각각접종한경우보다는두균을같이접종
한경우에그균수가더많이나타남을알수있었다. 이는두균 사이의상호작용에의한것으로생각되어지며이와같은결과로부 터앞으로절삭유제의부패액에서출현하는다른미생물도이와같 이접종하여실험을행하면더좋은결과를얻을수있을것으로생 각된다. 하지만, 접종하고시간이경과함에따라균이계속성장 해나가지못하고사멸되어간헐적으로균을새로이접종을해야
Table 1. Decomposition results of metal-working fluid solution containing iron chip and mineral substrate against microbes Inoculum
Exp. Condition E. coli (5 mL) K. pneumoniae (5 mL) E. coli (2.5 mL) +
K. pneumoniae (2.5 mL)
Rust substrate Temp. Sealing state OD 0.5 OD 1.5 OD 0.5 OD 1.5 OD 0.5 OD 1.5
Cost iron chip 37oC Close × × × × × ×
Open × × × × × ×
RT Close × × × × × ×
Open × × △ △ △ △
Cost iron chip
+ M* 37oC Close × × × × × ×
Open × × × × × ×
RT Close × × × × × ×
Open △ △ ○ ○ ○ ○
※M*; mineral substrate, ○; good, △; normal, ×; bad
Table 2. Colony count of metal-working fluid solution decomposed with E. coli and K. pneumoniae Detection time(day)
Inoculum 1st inoculum 2nd inoculum 3rd inoculum 4th inoculum 5th inoculum
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
E. coli (5mL) OD 0.5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 0
OD 1.5 0 0 0 2 0 0 4 0 0 10 7 0 20 16 3
K. pneumoniae (5mL) OD 0.5 52 0 0 48 0 0 54 0 0 72 9 0 60 7 0
OD 1.5 90 38 1 159 47 2 192 60 22 359 242 48 1,000 272 168
E. coli (2.5 mL)
+K.pneumoniae(2.5 mL) OD 0.5 96 1 1 125 3 0 127 10 0 201 31 0 258 22 0
OD 1.5 346 44 10 369 52 13 514 227 38 727 127 87 2,000 1,000 392
Fig. 7. Decomposition against E. coli (upper) and K. pneumoniae (bottom) of metal-working fluids after pH adjustment (Incubation temperature:
37 oC).
하는문제점이있었다. (주)로터스엔진니어링에서연구한물리적 처리방법을이용한수용성절삭유부패방지기술에관한연구보고 서[13]에의하면미생물의살균효과를판단하기위하여절삭유를 순환시스템으로부패시켜부패한절삭유를표준액으로사용하여 간이미생물 kit로부패도를평가하였다. 실험결과, 부패절삭유에 존재하는균주는Bacillus thuringgiensis로판명되었으며보다정 확한절삭유의평가방법을확립하기위해서는절삭유에다양하게 기생하는균주를 배양하여평가하는것이바람직하다고사료되 었다.
4. 결 론
절삭유제의미생물에대한부패능을평가하기위하여미생물의 성장유형을조사하고조절된균을유제에접종하여부패능을실험 한결과다음과같은결론을얻었다.
(1) 미생물의성장곡선실험결과, 균의대수성장기는균의종류에 따라다르게나타났으며E. coli균의대수성장기는배양후 2시간, K. pneumoniae균은 3시간, P. aeruginosa균은 4시간, P. oleovarans
균은 3시간이었다.
(2) OD 값을 0.5로조절한접종액의E. coli 균수는 4.4~10.0 × 105 CFU/mL, K. pneumoniae 균수는 1.8~9.5 × 107 CFU/mL이었다.
(3) 미생물의부패에대한 pH의영향을살펴본결과, pH 6~8에
서부패가왕성하게진행되었고 pH가 4 이하, 10 이상에서는균이 성장하지못함을알수있었다.
(4) pH를중성으로유지하고내마모제의구조에따른부패능을
실험한결과, 에스테르형내마모제가에틸렌글리콜형내마모제보다 부패가빠르게진행되어구조에따라부패능의차이를나타내었다.
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