사람 적혈쿠에서 안슐린 수용채의 정재 및 결합특성에 대한 연푸

대한임상병 리사회지 : 제 18권 제 1 호 1986

사람 적혈쿠에서 안슐린 수용채의 정재 및 결합특성에 대한 연푸

경희대학 부속병원 내과 내품비 연구실

팽 정 령·정 수경·서 광식·이 군자

Purification and Binding Chaτacteristics

of Insulin Receptors on Human Erythrocytes

Jung Ryung Paeng

,

,

=Abstract=

Insulin Receptor (IR) on Human erythrocyte was purified and determined its molecular weight by Gel Filtration Chromatography (GFC).

IR showed single peak on GFC and its molecular. weight was estimated to be approximately 350 K.D.

The optimal condition, in Binding procedure of radiolabeled insulin receptor, was pH 8.0, 37⁰C and lhr incubation.

We obtained same elution profile about insulin receptor purification before and after insulin binding procedure.

서 론

인슐린 수용체는 폴리 법라이드 구조안 단백질이다.

단백질 정제 기술은 생화학의 연구 중 가장 기초가 되 는 것으로 채조합 DNA 기술에 의해 생산되는 여러가 지 물질들 가운데 가장 큰 관심의 츠첨이 되는 것도 역시 단백질이다.

단백질을 변성없이 순수한 상태로 분리 하고저 한다 면 단백질 분야에 깊은 이해외- 기술이 펄요한 반면 축 적된 경험도 필요하다. 흔이 쓰이는 분리 정제볍에는 첨첨， 원심분리， 각종 크로마로 그라괴， 초한외여과볍，

HPLC, FPLC, electrophoresis, isolelectric focusing, chormatofocusing 등이 알려져 있다. 이 중 최근에 흔

히 쓰이는 방법으로 친화성 크로마로 그라피 및 isoel.

ectri cfocusing 이 다. 분리 정 제 에 는 장치 의 구비 와 기 술 뿐만 아니라 막의 제조， 충진제 제조 빚 충진，

ligand 의 Coupling 기 술， column 에 서 의 flow distri.

bution, sequence 조작， fractionation 과 같은 분리 공 정 상의 문제가 있다.

세포 외부로 부터 세포 내부로 신호가 전달되기까지 는 분자 안테 나(molecular antennae) 인 수용체 플 통하 여 이루어 진다. 인슐린 수용체 연구에는 정상 세포나

1-5) 세포막을 이용한 것이 대부분이었으나， 친화력과

수용체수가 세포의 기능이나 구조에 따라 영향을 받을 수 있으며 6) 수용체 자체의 변화가 수용체의 친화력 (affinity)을 변화시 킬 수 있으므로7) 수용체 자체의 구 조적인 변화를 연구할 필요성이 생기게 되었다. 인슐 린 수용체는 Jacobs 등이 쥐의 간 세포에서 Gavin 등 이 8) 임과구폐서， Harrison 등이 9) 태반 세포에서 분리

- 4 0 -

연구성적 하여 세포의 인슐린 수용체와 비교 관찰하였다.

이에 저자들은 사람의 적혈구로 부터 인슐린 수용체 를 분리하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

@ 적혈구 ... 인슐린 수용체에 태한 elution profile.

적 혈구막우로 부터 얻은 solubilized membrane pro-

tein 과 125I-Insulin 걸 함 반응을 한 후의 Solubilized membrane protein은 Fig. 1 과 같은 똑 같은 형 태 와 시간에 나타났다.

1251_ 1nsulin free form 앞에 나오는 peak는 수용체 추출시에 수용체의 상당수가 파괴되어 저분자량의 형 태로 나오는 것 낌-다

그외 의 나머 지 부분에 서 는 receptor complex peak 민­

이 나와 이를 인슐린 수용처}라 가정하고， 분차량을 득 정 확인해 본 결과는 Fig. 2 와 같이 350,000 daltons으 로 추정되었다.

@ 인슐린 특이 결합 컴사 텃 Scatchard 분석.

방사능이 최 돼 로 나타난 vejvo=1. 20(Fig. 1)인 관 획 을 125I-Insulin 과 결 합하지 않고 수용체 를 추출한 씨 료에서 fractÌ'on하여 이 분획에 인슐린 결합 구조가 곽 함된 것으로 추정하여 인슐린 특이 결합 검사를 시행 한 결 과 1251 -Insulin의 최 돼 결 합률은 3. 24:t0. 87% 었 고 비표지 인슐련에 의해 결합율이 경챙착2-로 감소되 어 적혈구막이나 정상 적렬구에서의 인슐린 수용체의 경 우와 같이 Sigmoid 곡선 형 태 를 취 하고 잇‘음을 보여 주고 있다 (Fig. 3).

이 를 Scatchard 방법 에 따라 분석 하였을 때 , upward concave, curvilinear 형 태 흘 브여 이 는 인 슐린 수용체 가 고친화성 수용첸 맞 저천화성 수용체의 서로 다른

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Fig. 1. Elution profile of solubilized membrane pctein frcm ]::rrr:an erythrccyte.

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「이 논문의 일부는 1985 당뇨벙 학회지 제 9 권에 발 표 되었음. J

재료 및 방법

CD Ghost cel1 제 조

Whool blood 50ml씩 채취하여 143 단휘의 헤파린 시 험관에 각각 10ml의 혈씩을 분주한 다음， 혼합한 후 (400g, 10분 200C) 원심분리후 혈장을 분리한다. 혈 구와 동일한 양의 생리 식염수로 흔합한 후 Böyum10)

의 Ficoll hypaque density gradient 원 심 분 리 방법 무 로 적혈구를 취해 생리 식염수로 2"'3회 세척한다. 다 음에 5mM phosphate buffer pH 8. 0으르 5"-'6회 셰 척 과 원섬 (30， OOOg) 을 각각하여 Ghost cell을 요은다.

@ 인슐련 수용체 추출과 125I-Insulin 결합 반응.

Ghost ce l1의 일부분은 Triton X-100.으로 처 리 하여 먼저 수응체를 추출하고 상층액을 1251-Insulin 과 (por- cine, cambridge nuc1ear, 90μcijμg) 37⁰C 에 서 1 시 간 혼합 배 양한 다음 G 4000 Sw Column(7.5mmX60cm,

Toy=Soda TSK gel column) 을 이 용한 high perfor- manc Iiquid chromatography(HPLC) 에 통과하여 나오 는 방사능을 l\Iodel 170 Isotope detector 로 계 측하였고 또 하나는 Ghost cell 윤 ¹²⁵1 -Insulin을 37⁰C 에 서 1 시 간 먼 저 결 합반응 시 킨 후 Triton X-100으르 추출하여 원 섬 분리후 상충액을 HPLC에 통과하였다. 마지악 한 가지는 Triton X -100.으로 용출시킨 후 윈섣 분리하여 상총액 을 HPLC에 통과하여 나오는 물질 을 Fraction"ð"}

여 수용체가 있는 Fraction(Fig. 6) 을 떠-로 무아 Gam-

bhir^U- l2) 방법에 따라 인슐련 수용체의 특이결합 컴사

를 시행하고 Scatchard13) 방법에 따라 분석 하였다.

@ Chromatography 조건.

Mobile phase : O. 05M phosphate buffer pH 7. 4 Flow rate : 1mljmin

UV detection : 280nm

Model 170 isotope detector : cell length 80cm Temperature : ambient control

@) 분자량 측정.

Protein Molecular Weight Markers MW -GF -200 Kit 를 이 용하여 측청 한 daltons 2-로 추정 되 었음.

컬과 350,000

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Fig. 4. Scatchard plot of insulin binding to crudely purified solubilized insulin receptor from human erythrocytes.

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Fig. 2. Determinatio"i1 of the molecular weight of insulin receptor by HPLC.

CD Blue Dextran (2, 000, 000)

@ DEAE Dextran (470, 000)

@ 껴-Amy업 se (2000,000)

@ ^A1cohol Dehydrogenase (150,000) 1.0

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Fig. 5. Effect of pH on 125I-Insulin binding to hu- man erythrocytes (Ghost celI) The pH of the buffer was adjusted bt 37⁰C, Then these were incubated for lhr.

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Fig. 3. Specific binding of 125I-Insulin to collected fraction which showed maximal radioactivity and was assumed to include insulin receptor.

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@ pH에 따른 결합능 검사.

Ghost cel1에서 추출련 인슐련 수용체을 일정 량씩 시 험관에 분주한 다음 pH 6"'9까지 4단계로 결합시험을 하였던 바 pH 6.0 에서 0.7% pH 8.0에서 6.2% pH 9 에서 4.2% 로 최대결합은 pH 8.0 근처에서 나다났다 (Fig. 5). 이 째 사용한 buffer G 의 조성 은 다음과 같다.

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천화력을 가진 두 개의 수용체가 있으며， 인슐린 수용 체 가 negative cooperativity를 갖고 있음을 시 사하여 ,

완전한 적혈구를 대상으로 할 때와 같이 분리된 수용 체에서도 장기의 특성이 유지되고 있음을 나타내는 것 이다 (Fig. 4).

h ν

『

Insulin Receptor

J

Fig. 6. Elution profile of solubilized membrane protein from human erythrocytes.

*

고 안

폴리웹타이드 흘몬 작용의 기전을 밝히기 위해서는 흘몬이 작용하는 특이 수용체를 정제하여 청체와 성질 을 규명하는 것이 필수적이라 하겠다.

인슐린 수용체에 대해서 사람 및 여러 종의 동물로 부터 여러 조직의 세포에서 연구되어 수용체가 존재한 다는 것은 이미 알려져 있다. 1-5,14) 사람의 적혈구 및 적혈구의 Ghost 제포막에서 인슐린 수용체의 역동 조 절을 관찰하여 인슐린과 특이적￡로 반응하는 인슐린 수용체 가 존재 함을 보고 하였 고15-16) 이 번 연 구에 서

Triton X- lOO을 이 용하여 적 혈 구로 부터 인슐린 결 합 구조물을 용해 시키고 원짐분리하여 얻은 부유액을 다 시 Triton X -100을 제 거 한 후 Gambhir^ll-12

) 법 에 따 라 득이 결 합 검 사를 시 행 하고， Scatchard assayl3) 하 여 upward concave, curvilinear 형 태를 보여 주었다.

이것은 인슐련 수용체가 분리된 후라 하더라도 세포막 에 존재할 해와 똑같은 기본 성질을 갖고 있음이 업증 되었다.

이번 연구에서 G 4000 Sw Colunm을 사용한 HPLC 방법으로 인슐린 수용체 분리에 처음 시도된 것으로 생 각되 는데 , Hara 등6)은 Sephadex G 200 을 사용하여

MW 370， 000 인 수용체 를 분리 하였 고， Cuatrecasasl7)

는 Sepharose 6B Column을 이 용해 서 인슐련 수용체 분자 지 름(Stroke radius)이 70A 정 도의 MW 300,000

임을 보고 하였다.

또한 Harrison등 9)도 6% agarose gel filtration..9..로 태반 세포에서 용해된 인슐린 켈합 구조물의 분자량이 약 300,000 임 을 보고 하였 다. wheat germ agglutinin- sepharose 맞 insul in-sephrose의 affinity chromato-

graphy를 이용한 Yamaguchi 등은 인슐린 수용체를 보다 더 순수하게 청제 하였다. Sodium dodecyl sul- fate polyacrylamide gel electrophoresis에 서 인슐란 수용체의 분자량을 측정한 결과 비환원 상돼에서 320, 000, 300,000 및 270,000 등의 3개 의 고분자 랜 드로 나타났고 환원 상태에서는 135,000 벚 90 ， 000의 2개의 밴드로 나타났다 18)

Czech 등은 인슐린 수용체가 환원상태에서 125,000 rv135,OOO, 90,000^rv95,000 빚 40, 000^rv45, 000의 분자 량을 갖는 Subunit로 이 루어져 있음을 관찰하였고， 이 를 갖기 α， ß 및 ß1 이 라 하였 εL며 , 또한 350,000, 320,000 빚 290， 000의 분자량을 갖는 3개 의 disuIfide linked compIex도 관찰하여 이 를 각기 (α)2(껴)2' αzß‘，81 및 αz(‘，81)z르 제 안 하였 다 19-20)

저자동의 연구에서는 분자량이 큰 350， 000의 수용체 와는 별도로 매우 분자량이 큰 수용체와 갇은 정질의 물질이 존재하고 있다는 것이 밝혀졌으나 이는 Triton X-100으로 녹였더 라도 다시 aggregation 이 일 어 나 분 석하지 못했다. 이는 완전 적혈구를 대상으로 하였을 째의 6.50:t0.16% 에 비해 3. 24:t^0. 87%로 떨어져 있 는 이유가 아닐까 의성된다. 다 보고자의 경우에서 인 슐린 최대 결합융은 완전 척혈구의 경우와 차이가 없

었다 .6)

Triton X-100, digitonin과 같은 nonionic detergents 들은 수용체의 성질을 고유한 형태로 추출할 수 있는 장점이 있는 반면 yield 가 떨어지고 (20^rv60%) ， 단백 질 이 aggregated form으로 되 며 단백 철 의 분해 를 막지 못한다. 또한 Subunit에 대한 연구가 불가능하리라 본 다. 저자 동의 실험에서 거대한 고분자체가 존재하는 의 섬 은 SDS와 같은 ionic detergent 로 용해 할 경 우 어 떻게 되는지는 추푸 연구할 문제가 된다. Ruocho, Pilch, Czech등이 SDS를 이용한 특이 표지 Ligand를 이 용하여 irreversible한 조건 에 건 실 험 을 시 도했 다.

SDS 용액에 있는 단백칠은 1차 구조적인 특성을 갖고 있을 뿐만 아니 라 Subunit 까지 주출할 수 있는 강력 한 detergent 이 다.

이러한 연구들에서 비이온성 시 약인 Triton X-100 을 사용하였는데 이는 세포막을 분해하여 표지 인슐과

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득이적으로 결합시키는 능력을 파괴하였고나， 이를 초 고속 (300， OOOg) 2.로 원심분리시키면 부유물의 인슐린 결합체가 인슐과 특이적으로 결함할 수 있는 능력이 다시 나타남 이 관찰되 었 다.21) 추후 efficiency 가 큰 Column을 이 용하는 한펀 SDS-gel chromatography 를 이용한 연구로 결함율이 낮아진 원인과 분자체의 연구 가 필요찰 것이며 인슐린 수용체 뿐만 아니라 기타 단 백질의 연구에 도움을 출 수 있을 것으로 생각된다.

결 론

사람의 적혈구막으로 부터 용리시켜 HPLC에 의해 수용체가 완전한 적혈구에서의 인슐린 수용체와 유사 한 결합 특징을 보여 주어， 이러한 결과는 인슐린 수 용체의 결합 부위와 정상인의 적혈구로부터 분리될 수 있음을 시 사하므로 향후 방법 을 개 량하므로써 인슐린 수용체 자체의 구조와 변화에 대한 연구를 하는데 도 움이 되리라 사료된다.

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