ver (P Periodic Acid Methenamine S

(1)

대한임상병 리사회지

:

제 19권 제

1

호

1987

신조직 에 서

Periodic Acid Methenamine S iI ver (P AM)

염색법에 대한 고찰

과 리 여O

챔

근

조 오 원

’

벼O 이u 하「 셔O

째

검 한

A Study of Periodic Acid Methenarnine Silver (P AM) Staining in Kidney

Seung In Kim , Keun Y oung Oh Dept. 01 Pathology ,

Hanya:γl용

University Hospital

= Abstract=

The J ones and Gomori methenamine silver methods rely on the production of aldehyde groups from the carbohydrate components of the reticular fibers and basement membranes after exposure to a periodic acid acid solution. The released aldehydes then reduce the silver of the methenamine silver complex to visible metallic silver. The gold chloride solution functions to tone the tissue section, and sodium thiosulfate functions to remnH' excess unreacted silver and gold.

I .

서 론

PAM

염색법은

Gomori

(1946) 에 의한

glycogen

빛 mucin의

chromic acid . methenamine silver

염 색 법 을 근거 로

Jones(1953)

가 신사구체 의 특수 도은 법으로써 고안하여 보고한 것이다. 이 방법은 현재 까지 신사구체 기저막， 요세관 기저막，

mesangium

셰포， 초자적 원주， 간， 비장 빛 럼프절 등의 세망 섬유(교원섬유)

,

폐포벽 모세혈관의 기저막의 특수 염색법으로서 널리 응용되고 있다.

또한 PAM염색을 일반염색 (H-E) 과 조합하여 응고 괴사조직에 이용하면 괴사병소 내의 명변 재현 에 대만히 효과적이다. 이 경우 괴사병소 내에 남아 있는 교원섬유-기저막， 혈관계 구축이 PAM 염색 에 의해 명료하게 도은되며， 특히 H-E염색에 세포 및 그 생산물이 염색되고， 동시에 eosin으로 괴사물

질을 어느 정도 동정할 수 있다. 그 외에 PAM염색 으로 진균， 균막의 다당체를 가진 세칸과 바이러스，

그 외 각종 생 체 내 색 소

(hemosiderin , bilirubin , hematoidin , melanine , lipofuchsin

등) 도 잘 도은 염색된다.

외국에서는 Jones의 원법 외에 失島(야지마)의 변 법이 유명하다. 失島법은 Jones법 보다 기저막이 예 민하게 염색되는데 염색 온도가 높기 때문에 과염색 되기 쉽고 도은염색 후의 판정이 어렵다. 그러나 Jones법은 失島법에 비하여 염색온도가 낮기 때문에 염색시간을 약간 길게 한다. 이러한 경우 과염색보 다는 오히려 불충분한 염색이 되기 쉽다. 그러므로 PAM 염색은 안정된 성적이 나오지 않는 어려운 염 색법에 속한다. 따라서 각 병리검사실에서 독자적인 개량을 가미한 변법이 다수 생겨나고 있으나 여기에 서는 비교적 실패가 적은 Jones법을 중심으로 설명

-185-

(2)

하고 失島법에 대해서도 설명을 하기로 한다.

PAM

염색법은 그대로 전자현미경용 특수염색으 로서도 이용이 가능하다.

11. PAM

염색법의 원리

종전

PAM

염색법의 원리는 PAS 반응의 이론에 의한 것으로 이해되어 왔다. 그러나 최근에는 이러 한 사고방식에 의문을 가지는 샤실이 失島들에 의하 여 지적되었다. 생체 내의 색소， 전자현미경용 초박 절표본의 신사구체 기저막과

mesangium

세포의 기 질 등은

periodic

acid에 의 한 산화과정 을 생 략하여 도 도은염색이 된다. 한편 전자현미경 검체의

PAM

염 색 에 서 는

periodic

acid에 의 한 산화를 행 하는 것 이 도은염색이 빠르면서도 비특이적인 은입자의 침 착이 적다.

이들이 상반되는 사실에 의하여 失島들은 PAM 염 색의 원리가 PAS반응과 같이 순수한 화학적인 것이 아니라 전자전하에 의한 물리화학적 반응이 관여하 고 있다고 생각하였다.

11 1.

표본제작

1 .

고 정

고정액으로써 Jones는 formalin용액， Camoy용 액， Boüin용액을 사용하였고，失島는 Helly용액을 권장하였다.

1) 10% formalin

수용액

2)

Camoy용액

ethanol ,

무수

... 60 ml chloroform ... 30 ml glacial acetic acid ... … 10 ml 3)

Bo디in용액

picric acid ,

포화수용액

... 15 ml formalin

원액

... 5 ml glacial acetic acid ... 1 ml

고정 후 수세하지 않고 ethanol에서 충분히

picric

acid를 제거한다. 탈파라핀 후 충분히 수셰하여 완 전히

picric

acid를 제거한다.

4)

Helly용액

potassium dichromate ... 2.5 g sodium sulfate ... 1 g mercuric chloride ... 5 g

증류수

... 100 ml

위 용액을 혼합 후 사용직전에

formalin

원액

5ml

를 첨가하여 사용한다. 이 고정액에 고정한 조직은

수세， 요오드화， 탈요오드 처리를 충분히 하여

potassium

dichromate와

mercuric

chloride를 완전 히 제거한다.

5)

Lillie의

10%

완충 formalin용액

formalin ,

원액

... 100 ml

증류수

... 900 ml sodium acid phosphate , monohydrate

"'4.0 gm disodium phosphate , anhydrous 6.5 gm

10% formalin

수용액에 장시간 담구어 방치한 조

직은

formalin

내에 생긴 의산(藏嚴)에 의해 세포핵

의 염색성이 저해될 뿐 아니라 기저막의 염색성도 저하되며

PAM

염색과정에서 비특이적 은입자의 침 착을 쉽게 일으키는 등의 결점이 있다. 따라서 장기 조직을 작게( 3mm) 하여 진탕기에 진탕하고， 고정 시간을 단축하는 것도 매우 중요하다. 만일 진탕하 지 않을 경우 4.C 에서 72시간 방치하면 매우 우수 하다. Camoy용액과， Boüin용액은 조직에 강한 수 축을 일으키는 결점이 있다. 또한 Helly용액에는 수 은과 크롬이 포함되어 있어 폐수처리 규제상 상용을 금하는 것이 바람직하다. 이와같은 결점을 해결하 는 뜻에서 Lillie의

10%

완충 formalin용액을 권장 하고 있다.

IV.

Jones으I

PAM

염색법

1 .

시 약

1. Gomori methenamine

silver용액

3 % methenamine

수용액

... 100 ml 5 % silver acetate

수용액

... 5 ml

위 용액을 혼합하여 사용 직전에

5%

붕사(Na2

B 4 0 7 • 10H 1 0)

수용액

12

ml를 첨 가한다

.

참고:

1)

Gomori용액의 제작에 따라 본 염색법의 결과 가 좌우된다. 그러으로 매우 중요한 과정이다.

2)

Gomori용액의 조제는 청결한 삼각 flask에 염 소를 제 거 한 증류수

100

ml를 취 하여

methena- mine

3gm을 용해한다. 이 용액에

5 % silver acetate

수용액 5ml를 pipette로 한 방울씩 떨어뜨 리면서 혼합한다. 한; 방울씩 가하는 것이 중요하며 한 번에 전량 5ml를 가해서는 안된다.

Silver

acetate

수용액 한 방울을 가하면 액체는 백탁으로

변한다.

가볍게 flask를 흔들어 백색침전이 소설되고 다시

(3)

액체가 투명해졌을 때 한 방울을 첨가한다. 이 조작 을 반복하여 천량 5ml를 완전히 용해한다.

3)

Gomori용액은 냉 장고 내에 보존하면

3-6

개월간 사용이 가능하다.

4) Methenamine

^{의 별 칭 으}^로^는

hexamethy- lena - mine , urotropin , hexamine

등이 있 다

.

5)

Methenamine의 품질은 만든 회 사에 따라 다 르으로 염색에 적당한 양질의 것을 선택하는 것이 중요하다. 보존은 냉장고에 밀봉하여 저장한다.

2. 0.5 -1. 0% periodic acid

수용액

3. 0.2% gold chloride

수용액

4. 3 % sodium thiosulfate

수용액

참고:

1)

Jones법 의 변 법 으로써

periodic

acid로 산화 후 다시

chromic

acid로 산화시키는 방법이 있다(이 방법은 교원섬유가 함께 염색되는 일이 적다)

.

2) Methenamine

silver용액은 아래의 처방을 이 용한다.

3 % methenamine

^수용액

100

ml에

5%

silver acetate

수용액 5ml를 가하여 진탕 혼합한 다. 사용시

5%

붕사 수용액을

12 ml

첨가한다.

5.

Jones의 염색법 (사진

1 )

탈 paraffin한 후 흐르는 물에

5

분간 수세 한 다.

2 )

증류수에 행군다.

주으|φ

:2-3

회 교환하면서 충분히 수세한다.

3) 0.5-1.0% periodic acid

수용액에 10-15분 간둔다.

주의 æ

: 10%

formalin용액， Lillie의

10%

완충 formalin용액， Bo디in용액 등으로 고정한 절편은 산화시간 10-15분이 적당하다.

4 )

흐르는 물에

5

분깐 수세한다.

5 )

주의Q): 2-3 회 교환하면서 충분히 수세한다.

6) Methenamine

silver용액을 45-50.C 에서

1. 5-

3 시간 염색한다.

주의@

: Methenamine

silver용액 을 미 리 소정 의 온 도까지 가온해 두면 염색시간을 단축할 수

있다.

주의@: 천용 항온기를 준비하면 항상 일정 염색온 도를 유지할 수 있으며 안정된 염색 결과가 얻어진다.

Water

bath로는 좋은 결과를 기 대할 수 없다. 이것은 고온 다습이라 생각 된다.

주으I@

: Methenamine

silver용액 에 절 편을 침 적 시

키면 용액의 온도가 높아지므로 기포가 부 착된다. 이것을 방치하면 염색얼룩의 원인 이 되므로 염색시 작 후

10 , 20 , 30 ,

60분 경 과할 때마다 slide를 대나무 핀셋으로 조심 히 용액 중에서 꺼내어 다시 조심히 용액에 넣으면 기포는 간단하게 제거된다.

주의 (J)

:

Slide를 직 접 손가락으로 집 거 나 금속제 핀 셋을 사용하면 염색액이 은경반응(銀鏡反應)을 일으키므로 염색의 실패 원인이 된 다.

주으ICID

:

도은염색상태를 검경하여 확인하면서 목적 의 대상물(기저막， 진물， 점액다당체， 생 체 내의 색소 등)이 완전히 흑색으로 변할 때까지 염색한다. 단 약간 과염한 것처럼 염색하지 않으면 다음

gold

chloride용액에 서 흐리게 된다.

주의 CID: 도은염색 상태의 현미경에 의한 확인은 절 편이 육안적으로 황잘색이 된 후에 실시한 다. 도은의 침투가 가까와지면 10분 간격으 로 확인하면서 2-3 회 검경을 한다. 그러 나 불필요하게 몇 번씩 염색용액에서 꺼내 서는 안된다.

주으I@)

:

검경은 slide를 반드시 증류수로 씻은 후 가 급적 짧은 시간에 실시한다. 도은염색이 불 충분하여 다시 용액에 넣은 경우도 한 번 증류수에 행군다. 증류수를 통과하지 않으 면 은경반응이 일어나며 비특이적인 은업 자가 조직절편 위나 그 주변에 다량으로 부 착하는 경우가 있다.

주의@: 염색에 요하는 시간은 염색용액의 온도， 조 직절편의 종류나 두께에 따라 약간씩 다르 다.

주의@: 과도은 염 색 된 표본은

potassium ferricya-

nide의 희석 수용액으로 분별하여 탈은한 다. 이것은 이론적으로는 가능하나 실제적 으로는 분별얼룩이 생긴다.

7 )

8) 0.2% gold chloride

^수용액에

2-5

분간 염 색한다.

주의@: Slide에 부착된 여분의 비특이적인 은입자 는 가제나 휴지로 미리 깨끗이 닦은 후 염 화은 수용액에 넣는다. 이 때 절편이 상하 지 않도록 주의한다.

9)

흐르는 물에

5

분깐 수세한다.

10) 3 % sodium thiosulfate

수용액 에

2

분간 염 색한다.

11)

흐르는 물에 10분간 수셰한다.

-187-

(4)

주으I@: 충분히 탈 Hypo한다.

12)

Hematoxylin용 액 에

2-5

분간 핵 염 색 한 다.

주으I@: 후염색으로써 H-E염색을 한다.

Nuclear fast red

용액을 사용하여

3-5

분간 핵염 색을 하여도 좋다.

13)

색출하기 위해 흐르는 물에 수세한다.

14)

Eosin용액에

3

분간 후염색한다.

15)

탈수， 투명， 봉입한다.

주의@: Alcoh이계열로 탈수하고

xylene 1 , 11 ,

III로 투명한 후 봉입한다.

2 .

염색결과

황색~황갈색조의 배경에 세망섬유와 기저막은 흑색이고， mesangium은 흑색으로 염색된다. 과염 된 것같이 보일 경우는 mesangium세포의 핵은 보기 어렵다. 또한 사구체

•

계제(係路)인 모세혈관， 기 저막，

V on Brunn

nest의 기저막， 요세관 기저막 등 도 과염색되면 굵은 듯 보이므로 그들의 병변상을 정확히 파악하기 어렵다.

V.

失島으I

PAM

염색법

전술한 고정 항목에서 언급하였으나 PAM염색에 서는

10%

formalin용액에 장시간 침적시킨 조직을 염색성이 현저하게 저하된다. 失島는 이와같은 결점 을 보완할 목적으로 조직을 Helly용액에 고정하는 것을 고안하여 신사구체의 특수 도은염색법으로써 의 PAM 염색 정밀도를 현저하게 높였다. 그러나 Helly용액에는 수은이나 크롬이 함유되어 사용이 곤 란한 상태이다. 그래서 失島는 이에 버금가는 고정 액으로써 Boüin액을 권장하고 있다.

1 .

失島의 특징

1 )

고정액으로써 Helly용액을 사용하였다.

2 )

농후한

methenamine

silver용액을 사용한 점， 즉 초산은의 양이 Jones법의 약 2 배이다.

methenamine

_silver용_액

3 % methenamine

_수용액

... 50 ml 5 % silver acetate

수용액

... 5-6 ml 5 % borax

수용액

... 4 ml 3 % methenamine

_수용액

50

ml에

5 % silver

acetate용액

5 -

6ml를 가지고 백탁이 완전히 없어 질 때까지 흔들어 혼합한다. 끝으로

5 %.borax

수 용액 4ml를 가한다.

3) Jones

보강액을 사용하여 염색표본에 미묘한

대비와 아름다운 색조를 얻어지도록 한 점이다.

Jones

보강액

2 % oxalic acid ... 100 ml formalin,

중성

... lml

2.

失島의 염색법(사진

2 )

1 )

탈 paraffin 한다.

주으ICD

:

Helly용액으로 고정한 경우는 수셰 빛 요오 드화， 탈요오드 처 리 를 충분히 하여 중크롬 산과 승홍을 완전히 제거한다.

2 )

주으1m:

2

회 교환하여 충분히 수셰한다.

3) 0.5 -1. 0% periodic acid

수용액에 7-15분 간 산화한다.

4 )

흐르는 물에 수셰 후 증류수로 행군다.

주으|φ:2-3 분 흐르는 물로 수세하고 이어서 증 류수로

2

회 교환하여 충분히 행군다.

5) Methenamine silver

용액에 58-60⁰C 에 90-120분간 염색한다.

주으ICD

:

도은 염색할 때에 주의하여야 할 점은 기본 적으로 Jones법과 같다. Jones법의 주의@

-@를 참고바람.

주으I@: 失島법을 실시하기 전에 특히 주의해야할 점은 염색온도가 높기 때문에 어느 정도 염 색이 진행되면 그 이후 급속히 과염색된다.

약간 더 염색을 계속하는 편이 좋다고 생각 될 때는 60⁰C 의 항온기에성 염색병을 꺼내 어 잔열과 실온으로 염딱하면 과염을 방지 할 수 있게 된다.

6 )

증류수로 행군다.

주으I@:

2

회 교환하여 충분히 행군다.

7) 4 %

formalin용액에 적당히 행군다.

8 )

증류수에 수세한다.

주으ICD: 3 회 교환하여 충분히 수세한다.

9) 0.2% gold chrolide

수용액에

1 - 5

분간 조 색한다.

10)

주으ICID:

1 -

2 회 행꾼다.

11) Jones

보강액에

2-3

분간 둔다.

12)

13) 5 % sodium

thiosulfate용액에

2

분간 둔 다.

14)

흐르는 물에

5

분간 수세한다.

15)

Hematoxylin용액에 30-60분간 핵염색한다.

주의(])

: Hematoxylin

빛 eosin용액에 동시에 염색

(5)

하기는 어렵다.

16)

흐르는 물에 수세로 현색한다.

17) Eosin

용액에 30-60분간 후염색한다.

18)

탈수， 투명， 봉입한다.

주으I G:ID

:

Ethan이계열로 탈수하고， xylene으로 투명 하여 봉입한다.

2.

염백결과 Jones법 의 결과를 참조

.

V I.

결 론

PAM

염색법에 대해서 Jones법을 중심으로 기술 하여 설명하였다. 본 법에서 다음과 같은 결과를 얻 었다.

1 )

양질의 methenamine을 선택하고 보존관리에 유의하여 냉암소에 밀봉 보존할 것.

표

1

~ 염색온도와 소요시간과의 관계

2 )

본 법에서의 가장 중요한 요점은 현미경하의 염색상태 검사이다. 염색 대상물질 즉 예를 들면 신 사구체， 계제(係路)의 기저막， 요세관의 기저막， 폐 포벽， 진균류 등이 확실하게 흑색으로 변화된 시점 에서 도은염색을 하면 실패가 적다.

3 )

도은용액의 온도는 반드시 58-60⁰C 가 아니 어도 좋다. 온도가 높을수록 도은에 필요한 시간은 단축되며 기저막은 민감하게 염색되나 도은의 완료 판정이 어려워 과염색되기 쉽다. 또한 58-60⁰C 에서 도은염색하면 절편 위나 그 주변에 비특이적인 은입 자가 부착하기 쉬운 결점이 있다. 한편 도은용액의 온도를 너무 내리면 시간이 극도로 연장되어 실용적 이 못 된다. 55-55⁰C 에서 염색하면 실패가 적고，

후염색인 H-E염색도 염색이 쉬우므로 초심자는 이 정도의 온도에서 염색하는 것을 권하고 싶다. 온도 와 염색시간에 대한 기준을 표 1 에 제시하였으므로 참고하기 바란다. 이상 각 주의점에 유의하면서 보 다 좋은 염색표본을 제작에 참고하기 바란다.

60

⁰

C

1

시간 20분 1 시간 10분

사진

2.

PAM 염색

:

失島법，

paraffin

절 편

2

μm，

X300

신사구체의 전체상이다. 사구체내 모세혈관 기저 다. 또한

mesangium

영역 ↓ b의 기질도 검게 도은 막이 약간 엽게 염색되는 것같￡나 PAM 염색은 염색 되어있다. 혈극

• c ,

요관극

• d ,

근위곡뇨세관 Spike와 같은 기저막의 미세한 변화를 관찰하는데

• e ,

원위곡뇨세관

• f.

적합하다. 요셰관의 세포질 내에 미셰과립상으로 염 색 된 것 은 소모성 색 소