영지버섯( Ganoderma lucidum)의 폴리페놀화합물과 Pancreatic Lipase 저해 활성
류은아1․최지혜1․성기운1․정신교1,2
1경북대학교 식품공학부
2경북대학교 식품생물산업연구소
Isolation of Polyphenol Compounds from Ganoderma lucidum and Pancreatic Lipase Inhibitory Activities
Eun-Ah Ryu1, Ji-Hye Choi1, Gi-Un Seong1, and Shin-Kyo Chung1,2
1School of Food Science and Biotechnology and
2Food and Bio-industry Research Institute, Kyungpook National University
ABSTRACT In this study, a Ganoderma lucidum methanol extract was fractionated according to the polarity of the solvent, Diaion HP 20 gel column chromatography was used to isolate the polyphenol compounds in the ethyl acetate fraction that showed the highest antioxidant capacity. The anti-obesity effects of each fraction were examined by measuring, the pancreatic lipase inhibitory activities. The polyphenol compounds were identified by HPLC. The antioxidant capacity and pancreatic lipase inhibitory activities in the ethyl acetate fraction were the highest among them (P<0.05). To isolate the polyphenol compounds, the ethyl acetate fraction was obtained with 30%, 60%, and 90% ethanol fractions by Diaion HP 20 gel chromatography. The DPPH (1.93 mM gallic acid equivalent) and ABTS (5.36 mM Trolox equivalent (TE)) radical scavenging activity, FRAP activity (5.92 mM TE), total phenolic content (121.46 mg%), and total flavonoid content (24.91 mg%) in 60% ethanol fraction were the highest (P<0.05). The pancreatic lipase inhibitory activity in the 60% ethanol fraction (1,000 μg/mL) also showed the highest activity as 93.30% (P<0.05). HPLC was used to identify the polyphenol compounds (gallic acid, quercetin, naringenin, kaempferol, and hesperetin) from the G. lucidum methanol extract, ethyl acetate fraction, and 60% ethanol fraction. Among them, the 60% ethanol fraction showed the highest content of total polyphenol compounds. Hesperetin (186.19±5.76 μg/mL) and quercetin (178.60±6.41 μg/mL) were obtained at high levels, followed by naringenin, kaempferol, and gallic acid (P<0.05).
Key words: Ganoderma lucidum, solvent fractions, polyphenols, antioxidant, pancreatic lipase inhibitory activity
Received 25 September 2019; Accepted 2 December 2019 Corresponding author: Shin-Kyo Chung, School of Food Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-53-950-5778
Author information: Eun-Ah Ryu (Graduate student), Ji-Hye Choi (Graduate student), Gi-Un Seong (Graduate student), Shin-Kyo Chung (Professor)
서 론
인간의 수명은 늘고 있지만 현대사회에서 스트레스, 운동 부족, 잘못된 식습관으로 인하여 노화, 비만, 당뇨, 암 등 각종 질환의 발병률이 증가하고 있다(Kim 등, 2017b). 이를 예방하기 위한 건강 기능성 식품소재 개발을 위해 다양한 약용식물들로부터 유용성분 분석, 항산화, 항비만과 같은 효 능의 연구가 활발하게 진행되고 있다(Jin 등, 2017; Kim 등, 2018b).
비만은 섭취에너지와 소비에너지의 불균형에 의해 유발 되며 에너지 대사 이상으로 인체에 흡수된 지방산이 trigly- ceride로 재합성되고 과잉으로 존재 시 인체 여러 조직에 축적되는 상태로 정의된다(Bray와 Popkin, 1998). 이러한 triglyceride를 2-monoacylglycerol과 fatty acid로 분해 하는 key enzyme으로 작용하는 지방분해효소인 pancre- atic lipase의 작용을 억제하는 방법이 주목받고 있으며(Kim 과 Kim, 2015), 상황버섯(Lee 등, 2010), 백자인(Kim 등, 2006)과 같은 약용식물로부터 이러한 메커니즘을 이용한 비만치료제 개발 연구가 진행되고 있다. 현재 항비만 의약품 으로 사용되는 lipstatin의 유도체인 tetrahydrolipstatin (Orlistat)은 체내에 섭취된 지방의 약 30%를 소화 흡수하지 않고 배설해낼 정도로 효능이 매우 우수하다(Hadvary 등, 1988). 그러나 최근 위장장애, 과민증, 지용성 비타민 흡수 억제, 담즙분비장애 등의 부작용이 있는 것이 보고됨에 따라 보다 부작용이 적은 새로운 항비만 물질의 개발이 요구되는
실정이다(Collins와 Williams, 2001).
영지버섯(Ganoderma lucidum)은 담자균류의 구멍장이 버섯과(Polyporaceae), 영지속에 속하는 버섯으로 일명 만 년버섯 또는 불로초라고도 불리며, 전 세계적으로 약용으로 널리 사용되는 버섯 중의 하나이다(Cha 등, 2011). 영지버섯 은 항산화(Kim 등, 2017a), 항비만(Joo 등, 2018), 항균 활 성(Jung과 Jung, 1992), 항염증(Seo 등, 2017), 항암(Kim 등, 2004; Hwang 등, 2018) 등의 다양한 생리활성을 가지 는 것으로 보고되어 왔다. 이러한 영지버섯에는 polysac- charide, triterpene, polyphenol, nucleoside, steroid 등 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있으며(Bea 등, 2005), 이러한 생리활성 물질은 고분자 물질(polysaccharide)과 저분자 물질(triterpene, polyphenol 등)로 구분할 수 있다 (Joo 등, 2018). 저분자 물질 중 대표적인 폴리페놀화합물은 우리 몸에 있는 활성산소를 해가 없는 물질로 바꿔주는 항산 화 물질 중 하나이며, 활성산소에 노출되어 손상되는 DNA 의 보호와 세포구성 단백질 및 효소를 보호하는 항산화능이 커서 다양한 질병에 대한 위험도를 낮춘다(Cho 등, 2013).
또한 flavones, flavonols, tannins 등과 같은 일부 폴리페놀 화합물은 pancreatic lipase 저해 활성이 우수하여 비만 치 료제로의 사용이 가능한 것으로 보고되었다(Kim 등, 2018a).
따라서 본 연구에서는 항비만 기능성 소재로 영지버섯의 활용성을 증대하기 위하여 영지버섯 추출물을 용매의 극성 에 따라 분획하였다. 그중 활성이 가장 우수한 분획물을 Diaion HP 20 gel chromatography로 폴리페놀 성분을 분 리하였다. 폴리페놀 분획물의 항산화능 및 pancreatic li- pase 저해 활성을 조사하였으며, HPLC를 이용해 폴리페놀 화합물을 분석하였기에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
실험 재료 및 시약
본 실험에서 사용한 영지버섯(Ganoderma lucidum)은 경상북도 칠곡군 왜관읍 소재의 버섯농장에서 재배하여 건 조된 버섯을 절단 및 분쇄하여 25 mesh의 체를 통과한 분말 을 실험에 사용하였다.
실험에 사용한 gallic acid, Trolox, (±)-catechin, quer- cetin, naringenin, kaempferol, hesperetin, 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2’-azino-bis(3-ethylben- zothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS), potassium persulfate, 2,4,6-tris(2-pyridyl)-1,3,5-tri- azine(TPTZ), ferric chloride, Folin-Ciocalteu regent, sodium acetate, 3-(n-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS), ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), lipase from porcine pancreas, 4-nitrophenyl butyrate, n,n-di- methylformamide는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을, tris-hydrochloride는 Promega Co.(Madi- son, WI, USA), calcium chloride는 Shinyo Pure Chemi-
cals Co., Ltd.(Osaka, Japan) 제품을 사용하였다. Aceto- nitrile은 HPLC용으로, 기타 용매 및 시약은 일급시약으로 Duksan Co.(Seoul, Korea)의 제품을 사용하였다.
폴리페놀화합물 추출 및 분리
영지버섯 분말과 methanol을 1:20(w/v)의 비율로 실온 에서 24시간 동안 2회 추출한 후 여과 및 감압농축 하여 메탄올 추출물(4.25 g/100 g)을 얻었다. 이를 다시 10%
methanol에 현탁하여 n-hexane, ethyl acetate, n-buta- nol 순으로 용매 분획한 후 농축하여 n-hexane(0.25 g/100 g), ethyl acetate(2.10 g/100 g), n-butanol(0.70 g/100 g), water(1.00 g/100 g) 분획물을 얻었다. 항산화능이 가장 우수한 ethyl acetate 분획물을 Diaion HP 20 gel(Mitsu- bishi Chemical Co., Tokyo, Japan)을 충진한 column (230×300 mm)에 흡착시켰다. 이동상 용매를 30%, 60%, 90% ethanol 순으로 용출시켜 각 획분을 얻었으며, 이를 감압농축 후 동결건조 하여 실험에 사용하였다.
항산화능 측정
DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법을 이용하 여 측정하였다. 96-well plate에 시료 용액(10 mg/mL) 20 μL와 200 μM DPPH solution 180 μL를 가해 암실에서 30 분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 로 gallic acid를 사용했으며, 표준물질 검량선의 회귀식을 이용하여 gallic acid equivalent(mM GAE)로 나타내었다.
ABTS 라디칼 소거 활성은 Re 등(1999)의 방법을 이용하 여 측정하였다. ABTS solution은 7.4 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 1:1(v/v)로 혼합하여 암실에 서 24시간 동안 반응시켜 ABTS･+을 형성하였다. 그 후 용 액이 734 nm에서 흡광도 값이 0.9가 되도록 ethanol로 희 석하여 실험에 사용하였다. 96-well plate에 시료 용액(10 mg/mL) 20 μL와 희석한 ABTS solution 180 μL를 가한 후 7분간 암실에서 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하 였다. 표준물질로 Trolox를 사용하였으며, 표준물질 검량선 의 회귀식을 이용하여 Trolox equivalent(mM TE)로 나타 내었다.
FRAP 활성은 Benzie와 Strain(1996)의 방법을 이용하 여 측정하였다. Acetate buffer(300 mM, pH 3.6)와 40 mM hydrochloric acid에 녹인 10 mM TPTZ 및 20 mM ferric chloride solution을 10:1:1로 혼합하여 cocktail solution 을 제조하였다. 시료 용액(10 mg/mL) 25 μL에 cocktail solution 175 μL를 가하여 암실에서 30분간 반응시킨 후 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 Trolox를 사 용하였으며, 표준물질 검량선의 회귀식을 이용하여 Trolox equivalent(mM TE)로 나타내었다.
총 페놀성 화합물 함량은 Folin-Ciocalteu 방법(Single- ton 등, 1999)을 이용하여 측정하였다. 시료 용액(10 mg/
mL) 100 μL에 2 N Folin-Ciocalteu regent 50 μL와 20%
Table 1. Antioxidant capacities of solvent fractions from Ganoderma lucidum
Fraction Methanol extract n-Hexane Ethyl acetate n-Butanol Water DPPH (mM GAE)1)
ABTS (mM TE) FRAP (mM TE) TPC (mg%) TFC (mg%)
0.25±0.00c2) 1.24±0.01c 0.67±0.01c 16.15±1.55c 27.31±0.44c
0.08±0.00e 0.57±0.00e 0.14±0.01e 6.37±0.12d 3.92±0.32d
2.16±0.02a 4.33±0.06a 2.94±0.13a 70.65±3.19a 28.13±0.57b
2.04±0.02b 4.23±0.03b 2.53±0.01b 66.83±1.07b 53.04±0.39a
0.16±0.01d 0.91±0.02d 0.48±0.01d 15.96±0.62c 0.93±0.03e
1)DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity; ABTS, 2-2’-azino-bis(3-thylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radi- cal scavenging activity; FRAP, ferric ion reducing antioxidant power; TPC, total phenolic contents; TFC, total flavonoid contents.
2)Means with the different letters (a-e) within a row are significantly different (P<0.05).
sodium carbonate 300 μL를 가한 후 15분간 실온에서 반 응시켰다. 그 후 증류수 1 mL를 가하여 원심분리 후 얻은 상등액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하였으며, 표준물질 검량선의 회귀식을 이용하여 mg%로 나타내었다.
총 플라보노이드 화합물 함량은 Zhishen 등(1999)의 방 법을 이용하여 측정하였다. 시료 용액(10 mg/mL) 70 μL에 50% ethanol 430 μL와 5% sodium nitrate 50 μL를 가하여 5분간 실온에서 반응시켰다. 그 후 10% aluminium nitrate nonahydrate 50 μL를 가하여 혼합한 후 6분간 실온에서 반응시킨 다음 1 N sodium hydroxide 500 μL를 가해 혼합 하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 (±)- catechin을 사용하였으며, 표준물질 검량선의 회귀식을 이 용하여 mg%로 나타내었다.
Pancreatic lipase 저해 활성 측정
Pancreatic lipase 저해 활성은 Kim 등(2007)의 방법을 변형하여 측정하였다. Lipase solution(10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 6.8)에 porcine pancreatic lipase를 2.5 mg/mL의 농도로 4°C에서 용해한 후 4,000 rpm으로 원심 분리 하여 상층액을 사용하였다. Enzyme buffer는 tris buffer(100 mM tris-hydrochloride, 5 mM calcium chlo- ride, pH 7.0) 850 μL와 lipase solution 30 μL를 첨가한 후 시료 용액 100 μL를 가하여 37°C에서 15분간 반응시켰 다. 효소반응 후 기질로 dimethylformamide에 용해한 20 mM 4-nitrophenyl butyrate 20 μL를 가하여 37°C에서 45 분간 반응시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조 구는 시료 대신에 추출 용매를 취하였으며 시료의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다.
HPLC를 이용한 폴리페놀화합물 분석
분획물의 폴리페놀화합물을 high performance liquid chromatography(HPLC)를 이용하여 분석하였다. 메탄올 추출물, ethyl acetate 분획물, 60% ethanol 획분을 0.45 μm syringe filter로 여과하여 실험에 사용하였다. HPLC (1260 Infinity Quaternary LC System, Agilent Technol- ogies, Santa Clara, CA, USA)로 YMC-Pack ODS-A col- umn(AA12S05-2546WT, 250×4.6 mm I.D., 5 μm, YMC
Co., Kyoto, Japan)을 사용하여 270 nm에서 분석하였다.
시료를 10 μL씩 주입하였으며, solvent A(0.1% acetic acid in distilled water)와 B(0.1% acetic acid in acetonitrile) 를 유속 1 mL/min으로 solvent A와 B의 비율을 10분까지 80/20(v/v), 40분까지 60/40(v/v), 50분까지 40/60(v/v), 55분까지 20/80(v/v), 60분까지 80/20(v/v)으로 하여 농도 기울기법으로 분석하였다. 표준물질로 gallic acid, quer- cetin, naringenin, kaempferol, hesperetin을 사용하였으 며, 검량 회귀식을 이용하여 폴리페놀화합물의 함량을 μg/
mL로 나타내었다.
통계 처리
모든 실험은 3회 반복하였으며, Statistical Analysis System(SAS, version 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 다중검정법(Duncan’s multiple range test)에 의하여 유의차를 검정하였다(P<0.05).
결과 및 고찰
영지버섯 폴리페놀 분획물의 항산화능
영지버섯 용매 분획물의 항산화능을 측정한 결과는 Table 1에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 활성은 ethyl acetate 분획물에서 2.16±0.02 mM GAE로 가장 높은 활성을 보였 으며, ABTS 라디칼 소거 활성 또한 ethyl acetate 분획물에 서 4.33±0.06 mM TE로 활성이 가장 낮은 n-hexane 분획 물보다 7.5배 이상 높은 활성을 나타내었다(P<0.05). Jeon 등(2012)의 연구에서 참취 용매분획물의 경우 ethyl ace- tate 분획물에서 가장 높은 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 을 보여 본 연구와 유사한 경향을 나타내었다. 산화 및 환원 반응에 의한 FRAP 활성에서도 ethyl acetate 분획물에서 2.94±0.13 mM TE로 높은 활성을 보였다(P<0.05). 총 페 놀성 화합물 함량은 영지버섯 메탄올 추출물에서 16.15±
1.55 mg%로 나타났으며, 각각의 분획물은 6.37~70.65 mg%의 범위로 나타났다. 그중 ethyl acetate 분획물이 70.65±3.19 mg%로 가장 높은 함량을 나타내었고, 가장 낮 은 함량을 나타내는 n-hexane 분획물보다 11배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다(P<0.05). 총 플라보노이드 함량은 영지버섯 메탄올 추출물에서 27.31±0.44 mg%로 나타났으
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Methanol extract
n-Hexane fr.
Ethyl acetate fr.
n-Butanol fr.
Water fr.
Pancreatic lipase inhibitory . activity (%) .
250 500 1000
b
d
c ab b
b
ab a
a
a c
c
c c
c
(μg/mL)
Fig. 1. Pancreatic lipase inhibitory activities of solvent fractions from Ganoderma lucidum. Means with the different letters (a-d) within the same concentration are significantly different (P<0.05).
Table 2. Antioxidant capacities of ethanolic fractions from Ganoderma lucidum by Diaion HP 20 gel column chromatography
Fraction 30% ethanol 60% ethanol 90% ethanol
DPPH (mM GAE)1) ABTS (mM TE) FRAP (mM TE) TPC (mg%) TFC (mg%)
0.97±0.03b2) 4.51±0.13b 4.65±0.23b 54.81±1.31c 9.93±1.39b
1.93±0.01a 5.36±0.20a 5.92±0.12a 121.46±0.45a 24.91±1.21a
0.53±0.00c 0.12±0.01c 1.76±0.03c 70.06±3.86b 11.26±0.00b
1)Abbreviations are the same as in Table 1.
2)Means with the different letters (a-c) within a row are significantly different (P<0.05).
0 20 40 60 80 100
Pancreatic lipase inhibitory . activity (%) .
250 500 1000 (μg/mL)
30% Ethanol fr. 60% Ethanol fr. 90% Ethanol fr.
b
b
b a a
a a b
c
Fig. 2. Pancreatic lipase inhibitory activities of Diaion HP 20 gel chromatography fractions from Ganoderma lucidum. Means with the different letters (a-c) within the same concentration are significantly different (P<0.05).
며, 각각의 분획물은 3.92~53.04 mg%의 범위를 나타내었 다. 그중 n-butanol 분획물이 53.04±0.39 mg%로 가장 높 았으며, ethyl acetate, n-hexane, water 분획물 순으로 높 았다(P<0.05). 따라서 항산화능이 가장 우수한 ethyl ace- tate 분획물을 Diaion HP 20 gel column chromatography 에 의해 폴리페놀 성분을 분리하였다.
Diaion HP 20 획분의 항산화능을 측정한 결과는 Table 2에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 활성은 60% ethanol 획분에서 1.93±0.01 mM GAE로 가장 높은 활성을 보였으 며, ABTS 라디칼 소거 활성 또한 60% ethanol 획분에서 5.36±0.20 mM TE로 30% ethanol 획분과 90% ethanol 획분보다 높은 활성을 나타내었다(P<0.05). FRAP 활성에 서도 60% ethanol 획분에서 5.92±0.12 mM TE로 높았다.
따라서 항산화 활성 모두 60% ethanol 획분에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, 30% ethanol, 90% ethanol 획분 순으 로 높았다(P<0.05). 총 페놀성 화합물 함량은 각각의 획분 에서 54.81~121.46 mg%의 범위를 보였고, 60% ethanol 획분이 121.46±0.45 mg%로 가장 높은 함량을 보였으며, 30% ethanol, 90% ethanol 획분보다 각각 2.2배, 1.6배 이 상 높았다(P<0.05). 또한 총 플라보노이드 화합물 함량에서 는 9.93~24.91 mg%의 범위로 나타났고, 60% ethanol 획 분이 24.91±1.21 mg%로 가장 높은 함량을 나타냈으며, 90% ethanol, 30% ethanol 획분 순으로 높았다(P<0.05).
Holasova 등(2002)의 연구에서 식물로부터 추출된 페놀 함 량이 높을수록 항산화 활성이 증가한다는 결과와 비교했을 때 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다. 따라서 총 페놀성 화합물 함량이 가장 높은 60% ethanol 획분에서 높은 항산 화 활성이 나타난 것으로 사료된다.
영지버섯 폴리페놀 분획물의 pancreatic lipase 저해 활성 영지버섯 용매 분획물의 pancreatic lipase 저해 활성을 Fig. 1에 나타내었다. 영지버섯 메탄올 추출물 및 용매 분획 물은 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 실험을 진행하였으 며, 각각의 lipase 저해 활성 결과는 농도 의존적으로 증가하 였다. 메탄올 추출물(1,000 μg/mL)에서 66.09%로 저해 활 성을 보였으며, Joo 등(2018)은 40°C에서 70% ethanol로 추출한 원형 영지버섯 추출물(1.0 mg/mL)의 경우 67.56%
의 저해 활성을 보여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다.
1,000 μg/mL의 농도에서 각각의 분획물은 56.71~86.26%
의 저해 활성을 나타냈다. 그중 ethyl acetate 분획물에서 86.26%로 가장 높은 활성을 보였으며, n-butanol(82.59%), n-hexane(67.32%), water(56.71%) 분획물 순으로 높았 다(P<0.05). Lee 등(2010)의 연구 결과에서 상황버섯 eth- yl acetate 층(4 mg/mL)에서 77.2%의 pancreatic lipase 저해 활성을 보였으므로 본 연구 결과가 더 높은 저해 활성 을 나타내었다. 일반적으로 폴리페놀화합물을 함유한 천연 식물 추출물은 지방세포의 분해를 억제하고 그 결과 지질 축적을 감소시킨다고 보고된 바가 있다(Kim 등, 2009).
Diaion HP 20 획분의 pancreatic lipase 저해 활성을
(A)
(B)
Fig. 3. HPLC chromatograms of standard compounds (A), and 60% ethanol fraction (B). a, gallic acid; b, quercetin; c, naringenin;
d, kaempferol; e, hesperetin.
Table 3. Contents of polyphenol compounds of methanol extract, ethyl acetate fraction, and 60% ethanol fraction from Ganoderma
lucidum (μg/mL)
Fraction Methanol extract Ethyl acetate 60% ethanol
Gallic acid Quercetin Naringenin Kaempferol Hesperetin
12.43±1.03bC1) 14.71±1.21cBC 15.48±0.84cB 30.81±2.13cA 12.35±1.54cC
8.21±2.04cD 49.74±3.45bC 56.87±4.30bB 73.30±3.49bA 70.04±4.52bA
23.50±1.14aD 178.60±6.41aA 154.07±4.14aB 82.11±1.08aC 186.19±5.76aA
Total 85.77±4.82c 258.15±16.00b 624.48±8.23a
1)Means with the different small letters (a-c) within a row are significantly different (P<0.05), and means with the different capital letters (A-D) within a column are significantly different (P<0.05).
Fig. 2에 나타내었다. 250~1,000 μg/mL 농도에서 60%
ethanol 획분이 가장 높은 lipase 저해 활성을 보였다. 특히 1,000 μg/mL 농도에서 60% ethanol 획분은 93.30%의 저 해 활성을 나타내었으며, 30% ethanol 획분과 90% ethanol 획분에서는 각각 64.99%, 61.19%를 보였다(P<0.05). 60%
ethanol 획분은 Diaion HP 20 gel chromatography에 의하 여 폴리페놀화합물이 분리되어 활성이 높아지기 때문에 ethyl acetate 분획물에 비해 더 높은 pancreatic lipase 저해 활성을 나타내었으며, 이를 이용하여 항비만 소재로 활용될 수 있을 것으로 판단된다. 천연 식물 추출물의 경우 단일물질로 정제되면 활성이 높아지는 경향을 보이므로 활 성물질의 추출 및 분리로 더욱 효과적인 pancreatic lipase 저해 활성을 가질 것으로 사료된다.
영지버섯 분획물의 폴리페놀화합물 분석
폴리페놀 표준물질인 gallic acid, quercetin, naringenin, kaempferol, hesperetin의 retention time과 비교하여 폴 리페놀화합물을 확인한 chromatogram은 Fig. 3에 나타내 었다. 표준물질에 의한 검량선의 회귀식으로 메탄올 추출물,
ethyl acetate 분획물, 60% ethanol 획분의 폴리페놀화합 물 함량을 분석한 결과는 Table 3에 나타내었다. Gallic acid, quercetin, naringenin, kaempferol, hesperetin의 retention time은 각각 3.42 min, 27.26 min, 32.80 min, 34.88 min, 35.35 min에서 확인되었다. 따라서 메탄올 추출 물, ethyl acetate 분획물, 60% ethanol 획분에서 gallic acid, quercetin, naringenin, kaempferol, hesperetin이 검출되었으며, 60% ethanol 획분에서 총 폴리페놀화합물 함량(624.48±8.23 μg/mL)이 가장 높았다(P<0.05). 그중 60% ethanol 획분에서 hesperetin과 quercetin의 함량이 각각 186.19±5.76 μg/mL, 178.60±6.41 μg/mL로 가장 높 았으며, naringenin(154.07±4.14 μg/mL), kaempferol (82.11±1.08 μg/mL), gallic acid(23.50±1.14 μg/mL) 순 으로 높았다(P<0.05). Diaion HP 20 gel chromatography 에 의한 분리가 진행될수록 활성 성분의 함량이 높아지는 것으로 보아 폴리페놀화합물의 분리가 이루어졌다고 사료 된다. Veljovic 등(2017)의 연구에 따르면 영지버섯에서 gallic acid와 quercetin, trans-cinnamic acid, kaempfer- ol, hesperetin, naringenin이 검출되었으며, hesperetin 및
naringenin의 함량이 가장 높아 본 연구 결과와 유사함을 보였다. 이때 hesperetin 함량은 3.222 μg/g, naringenin 함량은 2.856 μg/g이었으므로 본 연구 결과가 더 높은 폴리 페놀화합물 함량을 보였다. 60% ethanol 획분에서 가장 높 은 함량을 나타낸 hesperetin은 항비만 효과를 가지는 것으 로 보고된 바가 있다(Lim 등, 2014).
요 약
본 연구에서는 항비만 기능성 소재로서 영지버섯의 활용성 을 증대하기 위하여 영지버섯을 메탄올로 추출하고 이를 용 매의 극성에 따라 분획하였다. 그중 활성이 가장 우수한 ethyl acetate 분획물을 Diaion HP 20 gel chromatog- raphy에 의해 폴리페놀화합물을 분리하였다. 폴리페놀 분 획물의 항산화능 및 pancreatic lipase 저해 활성을 조사하 였으며, HPLC를 이용하여 폴리페놀화합물을 분석하였다.
용매 분획물 중 ethyl acetate 분획물에서 항산화능이 가장 높게 나타났으며, 활성이 가장 우수한 ethyl acetate 분획물 을 Diaion HP 20 gel chromatography에 의하여 30%, 60%, 90% ethanol 획분을 얻었다. 60% ethanol 획분에서 DPPH(1.93 mM GAE) 및 ABTS(5.36 mM TE) 라디칼 소 거 활성, FRAP 활성(5.92 mM TE)과 총 페놀성 화합물 함 량(121.46 mg%) 및 총 플라보노이드 화합물 함량(24.91 mg%)이 가장 높았다(P<0.05). Pancreatic lipase 저해 활 성 역시 60% ethanol 획분(1,000 μg/mL)에서 93.30%로 가장 높은 활성을 나타내었다(P<0.05). HPLC를 이용하여 메탄올 추출물, ethyl acetate 분획물, 60% ethanol 획분 (20 mg/mL)에서 폴리페놀화합물인 gallic acid, quercetin, naringenin, kaempferol, hesperetin을 확인하였다. 그중 60% ethanol 획분에서 hesperetin과 quercetin의 함량이 각각 186.19±5.76 μg/mL, 178.60±6.41 μg/mL로 가장 높 았으며, naringenin, kaempferol, gallic acid 순으로 높았 다(P<0.05). 따라서 영지버섯의 60% ethanol 획분의 강한 항산화능 및 pancreatic lipase 저해 활성을 나타내는 주요 활성 물질이 hesperetin 및 quercetin일 것으로 사료된다.
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