5-Lipoxygenase에 의한 성숙 파골세포의 조절
노아롱새미·문미란·정지은·임미정# 숙명여자대학교 약학대학
(Received September 1, 2012; Revised September 7, 2012; Accepted September 10, 2012)
The Regulatory Role of 5-Lipoxygenase in Mature Osteoclasts
A Long Sae Mi Noh, Miran Moon, Ji-Eun Jeong and Mijung Yim# College of Pharmacy, Sookmyung Women’s University, Seoul 140-742, Korea
Abstract — 5-Lipoxygenase (5-LO) catalyzes the formation of two major groups of leukotrienes, LTB4 and cysteinyl leu- kotrienes (CysLT), and it has been implicated as a promising drug target to treat various inflammatory diseases. Since its role in mature osteoclasts (mOCs) had not been reported, we investigated the effect of 5-LO inhibitors on mOCs. We showed that 5-LO inhibitors dose-dependently decreases the number of mOCs. The effects of 5-LO inhibitors were reversible, sug- gesting that they did not cause any cellular damages in mOCs. We further demonstrated that the suppression of mOCs by 5-LO inhibitors was caused mainly by disruption of the actin ring formation. Similar effects were shown with CysLT receptor (CysLTR)1 antagonist in mOCs. The mRNA expression of CysLTR1 and the production of CysLT were increased in mOCs.
These results indicate that CysLTR1 mediates the suppression of mOCs by 5-LO inhibitors. Taken together, this study dem- onstrated that 5-LO plays important role in mOCs and possibly a novel therapeutic target for bone resorption diseases.
Keywords □ 5-LO, CysLTR1, mOCs, bone loss
골다공증은 골(뼈) 퇴행성 질환으로 골밀도가 감소하고 그에 대한 질적 변화로 인해 골의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가 능성이 높은 상태를 의미한다. 골다공증은 노인의 삶의 질을 급 격히 저하시키는 문제점을 지님에도 불구하고 발병율이 매우 높 아 그에 따른 대책이 시급한 실정이다.
건강한 골은 일생 동안 골이 지속적으로 형성되고 파괴되며, 이를 골의 재형성이라 한다.1)골을 구성하는 두 가지 세포 중 조 골세포는 골을 구성하는 기질성분을 분비하고 합성하며 골표면 사이의 무기질 이동에 관여하는 골세포로 중요한 역할을 수행한 다. 한편, 파골세포는 골의 기질 성분을 용해시켜 칼슘염과 인산 염을 유리시키는 골흡수 분해를 담당함으로써 골의 농도를 유지 시키는 기능을 수행한다. 또한 조골 및 파골세포는 밀접한 관계 를 맺고 있어, 파골세포의 분화는 조골세포에 의해 엄격하게 조 절된다.1,2)즉, 조골세포는 파골세포 분화인자인 Macrophage Colony-Stimulating Factor(M-CSF or CSF-1) 및 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappaB Ligand(RANKL, OPGL,
ODF, or TRANCE)을 통해 파골세포의 분화를 조절함으로써 체 내 골형성과 골파괴의 동적인 평형을 유지한다.2-5)여러 요인으 로 인해 이 균형이 깨지면 골의 생성보다 흡수가 증가하여 결국 골 손실 (bone loss)이 일어나게 된다.
5-Lipoxigenase(5-LO)는 arachidonicacid(AA)의 산화를 유도하 여 leukotrienes(LT)를 합성하는 효소로,6)호중구, 호염구, 호산 구, 단구, 대식세포, 비만세포 등에 존재한다.7) 5-LO는 AA로부 터 leukotriene A4(LTA4)를 생성하며, 이는 LTB4나 LTC4로 바 뀐다. LTC4는 추가적으로 LTD4와 LTE4로 전환될 수 있다.
LTC4, LTD4, LTE4는 Cysteinly leukotriens(CysLTs)으로 불린 다. LTB4는 BLT1과 BLT2 수용체를,8,9) Cysteinly leukotriens 은 CysLT receptor 1(CysLTR1)과 CysLT receptor 2(CysLTR2) 수용체를 매개한다.10-12)
5-LO는 천식, 심혈관계 질환, 비염과 같은 염증반응의 조절자 로 잘 알려져 있다.13)최근 골대사에 관여함이 일부 보고되어, 5- LO 결손 생쥐에서 피질골의 두께가 증가되었으며, 난소적출에 따른 골 손실이 감소되었다.14)또한 5-LO 활성이 억제된 경우 골절 후 회복도 빠른 것으로 나타났다.15,16)이상의 보고로 미루 어 5-LO는 골대사에 중요한 역할을 담당하고 있을 것으로 생각 되나, 성숙 파골세포에 있어서 5-LO의 역할은 거의 알려진 바가
#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 02-710-9572 (팩스) 02-710-9871 (E-mail) [email protected]
종설
실험방법
시약
MK886, Rev5901, Montelukast는 Cayman chemical(MI, USA)에서 구입하였다. 그 외 모든 시약들은 Sigma-Aldrich(St.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
마우스 골수세포의 배양
ICR mouse(6~9주, 수컷)를 경추 탈골한 후 70% 에탄올로 소 독하였다. 경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다.
경골 원심부를 절단하고 슬개골을 탈골시켜 경골을 적출하였다.
뼈 양끝을 조금 잘라 한 쪽 끝에 25G의 주사바늘을 꽂고 α- minimum essential medium(MEM)을 흘려보내 골수세포를 시 험관에 모았다. 1200 rpm에서 5분 원심 분리한 후 10% fetal bovine serum(FBS)가 함유된 α-MEM으로 재현탁했다.
성숙 파골세포의 형성
초기 배양한 골수세포를 M-CSF 10 ng/ml로 하룻밤 배양한 후 부유세포를 M-CSF 30 ng/ml로 3일간 추가 배양했다. 접착 세포 를 회수 후 α-MEM에 10% FBS가 첨가된 배지에 M-CSF(30 ng/ml)와 RANKL(100 ng/ml) 존재하에서 4일간 추가 배양하여 성숙 파골세포를 얻었다.
TRAP 또는 actin ring 염색
세포를 10% formalin으로 10분간 고정한 후 ethanol-aceton (1 : 1)로 1분간 재고정하여 TRAP(tartrate-resistant acid phos- phatase) 염색하거나 또는 rhodamine-conjugated phalloidin (molecular probes, 40×)으로 37oC에서 1시간 처리하여 actin- ring을 염색하였다. 현미경하에서 관찰하여 3개 이상의 핵을 가 진 TRAP+ 세포를 성숙 파골세포로 판정하거나, 공초점 형광 현미경을 이용해 actin-ring의 생성을 감별하였다.
ELISA 분석
파골전구세포를 M-CSF 30 ng/ml, 또는 성숙 파골 세포를 M- CSF 30 ng/ml와 RANKL 200 ng/ml 존재 하에서 하룻밤 배양한 뒤 상등액을 회수하였다. CysLT의 생성 정도를 ELISA Kit (Biolegend, San Diego, CA, USA)으로 측정하였다.
RNA 분리 및 Real-time PCR 분석
Total RNA 추출은 Easy-blue(Intron Biotechnology, INC.)를 이용하였다. cDNA는 1 µg의 total RNA를 Power cDNA Synthesis
켰다. 추출된 RNA 2 µl에 PCR 혼합액 18 µl를 넣은 후 기포가 생기지 않도록 혼합하였다. PCR 혼합액은 SYBR® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, CA, USA)와 10 pmol의 primer(Cosmogenetech, Korea), 그리고 멸균 증류수를 포함한 다. Real time PCR 반응은 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) 장비를 사용하여 시행하였다.
Cycle threshold(Ct) value는 GAPDH를 기준으로 자동적으로 계 산되었으며, 실험결과 분석은 7500 System Sequence Detection Software version(Applied Biosystems, CA, USA) 프로그램을 사용하였다. Thermocycling은 먼저 95oC에서 10분간 유지하였 다. 이후 95oC에서 15초, 57oC에서 1분, 60oC에서 1분을 40 cycle 반복하였다. 분석을 위해 사용된 primer의 서열은 다음과 같다. CysLTR1 (F) 5'-CTGAGGTACCAGATAGAGG-3', (R) 5'-CTTGGTGCCTTGGAGGTACATT-3'; GAPDH (F) 5'-TCG- ACCACCAACTGCTTAGC-3', (R) 5'-GGCATGGACTGTGGT- CATGAG-3'.
MTT 분석
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetazolium bromide (MTT) 정량은 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다. 1×104 cells/well 농도로 96 well plate에 분주한 세포에 시료를 처리하 고 일정 시간 동안 배양하였다. 배양액을 버리고 PBS로 wash한 후, MTT 용액(0.5 mg/ml)을 100 µl/well 첨가하여 호일로 싼 상 태에서 5시간 동안 배양하고, Solubilization buffer(10% SDS in 0.01 M HCl)를 100 µl/well 첨가하고 다시 호일로 쌌다. 16~17 시간 동안 배양한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
통계처리
실험결과는 평균±표준편차 표기하였고, Student's t-test로 분 석하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
실험 결과 및 고찰
성숙 파골세포에 대한 5-LO 저해제의 효과
본 연구에서는 성숙 파골세포에 대한 5-LO의 기능을 규명하 기 위해 두 종류의 5-LO 저해제 MK886과 REV5901를 실험에 사용하였다. 성숙 파골세포는 마우스 골수세포를 M-CSF로 3일 간 처리하여 전구세포인 Bone Marrow Macrophages(BMM)를 생성한 후, M-CSF와 RANKL 존재 하에서 4일간 추가 배양함 으로써 얻었다. MK886과 REV5901을 24시간 처리하였을 때 성 숙 파골세포가 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 1A~C).
이는 농도 의존적 반응으로 MK886과 REV5901은 20 µM에서
최대 반응을 보였다. 반면 동일농도의 MK886과 REV5901은 파 골전구세포(BMM)를 감소시키지 않았다(Fig. 1D). 이상의 결과 로부터 5-LO 저해제는 성숙 파골세포를 특이적으로 감소시킴을 알 수 있다.
다음은 5-LO 저해제에 의한 성숙 파골세포의 감소가 세포사 에 의한 것인지 확인하고자 하였다. 이를 위해 성숙 파골세포를 MK886 또는 REV5901로 24시간 처리하고 제거한 후 관찰하였 Fig. 1− The effects of 5-LO inhibitors on mOCs. mOCs were
cultured with or without the indicated concentrations of MK866 (A) or Rev5901 (B) in the presence of M-CSF (30 ng/ml) and RANKL (100 ng/ml) for 24 hrs. Cells were fixed and stained for TRAP. TRAP-positive mOCs containing more than three nuclei were counted. (C) The images in A and B were photographed. (D) BMMs were cultured with or without of MK886 (20µM) or REV5901 (20 µM) in the presence of M-CSF (30 ng/ml) for 48 h. The number of viable cells was assessed using MTT assay. Values are the mean±SD of triplicate cultures in a representative experiment. Veh, vehicle; MK, MK886; Rev, Rev5901, *:
p<0.05 vs Veh.
Fig. 2− The Effects of 5-LO inhibitors on actin ring formation.
mOCs were cultured with or without 20µM MK866 (A) or Rev5901 (B) in the presence of M-CSF (30 ng/ml) and RANKL (100 ng/ml) for 24 hrs. The cells were washed by PBS and cultured with M-CSF and RANKL for 24 hr. Cells were fixed and stained for TRAP. (C) mOCs were cultured with or without 20µM MK866 or Rev5901 in the presence of M-CSF and RANKL for 24 hrs. Cells were fixed and permeabilized, and actin ring formation was visualized by staining with rhodamine conjugation phalloidin. Values are the mean±SD of triplicate cultures in a representative experiment. Veh, vehicle; MK, MK886; Rev, Rev5901, *:
p<0.05.
LO 저해제 처리로 감소한 성숙 파골세포는 저해제를 제거하였 을 때 다시 원 상태로 회복하였다(Fig. 2A & 2B). 이는 5-LO 저 해제 처리시 성숙 파골세포가 생존해있음을 의미하며, 따라서 5- LO 저해제에 의한 성숙 파골세포의 감소는 가역적임을 알 수 있다.
성숙 파골세포는 독특한 골격구조인 actin ring을 가지며, 이 는 성숙 파골세포의 주요 기능인 골흡수에 매우 중요함이 알려 져 있다. 5-LO 저해제가 성숙 파골세포를 감소시켰으므로 actin ring의 형성에 미치는 영향을 조사하였다. Actin ring은 rhodamine 이 중합된 phalloidin으로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.
성숙 파골세포를 MK886 또는 REV5901로 24시간 처리하였을 때 성숙 파골세포내에 존재하는 actin ring의 형성이 완벽하게 억 제되었다(Fig. 2C). 이상의 결과로부터 5-LO 저해제는 actin ring 을 파괴시켜 성숙 파골세포를 감소시키는 것으로 판단되었다.
성숙 파골세포에 대한 CysLTR1 길항제의 효과
5-LO 대사 경로에 의해 형성되는 류코트리엔류를 인식하는 수 용체에는 BLT1, BLT2, CysLTR1과 CsLTR2가 있다. 5-LO 저 해제에 의해 성숙파골세포가 감소하였으므로, 이에 관여하는 수 용체를 찾고자 시판하는 BLT1, BLT2, CysLTR1 길항제를 사용 하여 성숙 파골세포에 미치는 영향을 조사하였다. BLT1과 BLT2 길항제는 아무런 효과를 보이지 않는 반면, CysLTR1 길항제는 성숙 파골세포를 유의하게 감소시켰다(Fig. 3A). 이는 5-LO 저 해제에 의해 유발된 성숙 파골세포의 감소는 CysLTR1이 억제 된 결과이며 BLT1과 BLT2는 관여하지 않음을 의미하는 결과이 다. 5-LO 저해제와 동일하게, CysLTR1 길항제를 처리 후 제거 하였을 때 성숙 파골세포는 원 상태로 회복되었으며(Fig. 3B), 이 결과로부터 CysLTR1 길항제 역시 성숙 파골세포를 가역적으로 감소시킴을 알 수 있다.
CysLTR1이 성숙 파골세포에서 중요한 기능을 가지는 것으로 나타났으므로, 파골 전구세포(BMM)와 성숙 파골세포(mOC)에 서 CysLTR1의 mRNA 발현을 real time-PCR 방법으로 분석하 였다. 전구세포가 성숙 파골세포로 분화함에 따라 CysLTR1의 mRNA 발현이 약 2배 정도 증가하였다(Fig. 3C). 또한 전구세포 에 비해 성숙 파골세포에서 류코트리엔의 생성이 유의하게 증가 하는 것으로 나타나(Fig. 3D), 5-LO 대사 경로에 의해 생성된 류 코트리엔이 CysLTR1을 매개하여 성숙 파골세포를 조절하는 것 으로 판단되었다.
결 론
5-LO 저해제는 성숙파골세포를 농도 의존적으로 감소시켰다.
5-LO 저해제에 의한 성숙 파골세포의 감소는 가역적 반응으로,
Fig. 3− The Effects of CysLTR1 antagonist on mOCs. (A) mOCs were cultured with or without U-75302 (20µM, BLT1 antagonist), LY255283 (20µM, BLT2 antagonist), or montelukast (30µM, CysLTR1 antagonist) in the presence of M-CSF and RANKL for 24 hrs. Cells were fixed and stained for TRAP. (B) mOCs were cultured with or without montelukast (30µM) in the presence of M-CSF and RANKL for 24 hrs. The cells were washed by PBS and cultured with M-CSF and RANKL for 24 hr. (C) Total RNA was isolated from the cells and cDNA templates were prepared. mRNA expression was determined by real time- PCR using specific primers designed for CysLTR1. (D) Cells were cultured in the absence or presence of M-CSF and RANKL for 3 h. Cell supernatants were then subjected to determine the amount of cysteinyl leukotrienes using a ELISA kit according to the manufacturer's instructions.
Values are the mean±SD of triplicate cultures in a representative experiment. veh, vehicle; Mon, montelukast,
*: p<0.05.
actin ring 형성의 억제에 기인하는 것으로 밝혀졌다. 5-LO 대사 경로에 의해 생성된 류코트리엔의 수용체 중 CysLTR1 길항제 가 성숙 파골세포에 대해 동일한 효과를 보였다. 성숙 파골세포 에서 CysLTR1의 mRNA 발현이 전구세포에 비해 약 2배 정도 증가하였으며, 류코트리엔의 생성도 증가하였다. 이상의 결과는 5-LO 대사 경로에 의해 생성된 류코트리엔이 CysLTR1을 매개 하여 성숙 파골세포를 조절함을 의미한다. 성숙 파골세포에 있 어서 5-LO 및 CysLTR1의 역할은 본 연구에서 처음으로 규명되 었다. 최근 5-LO 대사물인 LTB4의 차단제가 조골세포 활성을 증가시킨다고 보고된바 있다.17)따라서 5-LO 대사 경로는 조골 및 성숙 파골세포에 양방향으로 작용하는 것으로 생각되며, 향 후 이를 이용한 골대사 장애 치료제 등의 개발도 가능할 것이다.
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