ISSN 1225-6552, eISSN 2287-7630 https://doi.org/10.7853/kjvs.2020.43.3.129
< Original Article >
Veterinary Service
Available online at http://kjves.org
*Corresponding author: Jae Gyu Yoo, E-mail. [email protected] ORCID https://orcid.org/0000-0002-8542-9193
돼지에서 생체 분해 금속성 전달체를 활용한 구제역 백신의 적용 연구
조아라1ㆍ오상익1ㆍ최창용1ㆍ정영훈1ㆍ도윤정1ㆍ김수희1ㆍ추현욱2ㆍ구종수2ㆍ정우진2ㆍ조성윤2ㆍ류재규1
*
농촌진흥청 국립축산과학원 가축질병방역과1, 랩앤피플2
Application of biodegradable metal based drug delivery carrier on Foot and Mouth Disease vaccination in pigs
Ara Cho
1, Sang-Ik Oh
1, Changyong Choe
1, Young-Hun Jung
1, Yoon Jung Do
1, Suhee Kim
1, Hyun Wook Choo
2, Jong Su Gu
2, Woo-Jin Chung
2, Sung Youn Cho
2, Jae Gyu Yoo
1*
1Division of Animal Diseases & Health, National Institute of Animal Science, RDA, Wanju 55365, Korea
2LABnPEOPLE Co. Ltd., Yangju 11485, Korea
(Received 30 March 2020; revised 24 June 2020; accepted 24 June 2020)
Abstract
In this study, we applied biodegradable drug delivery carries (BDDC) for food-and-mouth (FMD) vacc- ination. After FMD vaccination using BDDC, we estimated the percentage inhibition (PI) of antibody, decomposed patterns, and histopathologic features of BDDC. PI of antibody was higher than 50 at two weeks after injection and sustained positive PI until 10 weeks after injection. BBDC injection group showed significantly an increased pattern of blood monocyte at two and three weeks after injection.
According to the Micro CT, micro-cracks were observed at two weeks after injection and the morphol- ogy of BDDC was lost at four weeks after injection. For histopathological examination, acute inflam- mation with neutrophil infiltration and micro-metallic residues were observed around BDDC until four weeks after injection and inflammatory responses gradually decreased at 10 weeks. Based on our experi- ment, BDDC is considered as an alternative way to vaccine injection for veterinary applications. Our study can be used as basic data for the drug delivery system using biodegradable metals in the future.
Key words : Biodegradable metal, Vaccine injection, Animal application
서 론
구제역은 전염성이 높은 우제류의 바이러스성 질병 으로 축산업에 큰 경제적 손해를 끼치는 질병이다. 한 국에서도 2010년 발생한 이래로 지속적으로 소와 돼 지에게 발병하여 현재까지 피해를 입히고 있다. 구제 역 발생을 방지하기 위하여 국내에서는 송아지와 자 돈에 구제역 백신을 생후 8주, 12주에 각각 접종하고 이후로는 정기 접종을 하는 방법으로 구제역 백신 항
체가를 유지하고 있다. 농림축산식품부에서는 주기적 으로 농가에 대해 구제역 백신 접종 여부를 확인하고 항체가를 측정하여 미흡한 농가에 대하여 과태료를 부과하고 있다. 따라서 정기적인 구제역 백신 접종을 통하여 항체가를 충분히 확보하는 것이 중요하다.
구제역 백신은 백신 항체 형성을 높이기 위해 오일 부형제가 첨가 되어 있다(Singh 등, 2003). 오일 부형 제가 포함된 백신은 항체 형성이 다른 부형제에 비하 여 높으나, 돼지에서 접종 부의 화농 형성 및 괴사가 나타날 수 있다는 보고도 있다(Aucouturier 등 2001;
Park 등 2017). 이에 이러한 현상을 감소시키기 위해
Fig. 1. Morphology of biodegradable metal based drug delivery car- rier and schematic presentation. 1.0 mL carriers (diameter 5.8 mm, length 47 mm, thickness 0.2 mm) were used.
백신의 투여 방법이나 부형제를 변경하는 방법들이 연구되었다(Pandya 등, 2012). 구제역 백신을 돼지의 피내로 접종할 경우 근육 접종 시 사용량의 10%로도 항체 형성에 필요한 충분한 면역반응을 일으킬 수 있 다고 보고하였다(Eblé 등, 2009). 다만 이를 위해서는 피내 접종 전용 장치가 필요하며, 접종 용량이 적어 접종자의 숙련도가 떨어질 경우 접종이 제대로 수행 되지 않을 수 있다는 단점이 있다. 또한 인체 대상으 로 마이크로니들을 통하여 피부 투과성 약물 또는 백 신 전달에 대한 연구가 이루어지고 있다(van der Maaden 등, 2012).
현재 구제역 백신은 자돈에게 2회 접종하게 되는데 이는 농가 현장의 노동력을 많이 요구하고 번거로워 서 횟수를 줄이는 연구도 필요한 실정이다. 현재 백신 제조사의 권고사항을 따라 자돈에서 2회 접종 하는 백신으로 먼저 국가 방역상 반드시 접종해야 하는 의 무 접종으로 구제역과 돼지열병 백신이 있으며, 농장 에서 다발하는 돼지유행성설사병, 돼지전염성위장염, 돼지유행성폐렴, 흉막폐렴의 경우에도 충분한 면역을 형성할 수 있게 2회 접종이 추천된다. 농가에서 이와 같은 백신들을 적시에 접종하려면 지속적인 관리와 많은 노동력이 필요하다.
생체 소재란 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 정의에 따르면 “인체의 조직 및 장기의 기 능을 치료, 개선 및 대체하는 목적으로 단기간 및 장 기간 사용되는 모든 천연물질과 합성물질 및 이 물질 들의 조합”이다. 이 중에서도 생체 분해 소재는 생체 내에서 일정 기간 동안 목적을 수행 후 생체 거부반응 이나 독성 없이 분해되는 생체 적합성 물질로서 약물 전달 시스템에도 사용되고 있다. 약물의 부작용을 최 소화하고 효능 및 효과를 극대화시키기 위하여 다양 한 생체 분해성 소재(고분자, 금속, 세라믹 등)를 이용 한 약물 전달 방법들이 개발되었다(Bose 등, 2019). 마 그네슘은 인체에 다량 존재하며 체내에서 분해가 일 어나고, 필요 이상의 양은 신장을 통해 체외로 배출되 는 특징으로 인하여 생체 분해성 금속으로 연구가 이 루어졌다(Li 등, 2018). 마그네슘 기반 생체 분해성 금 속에 대한 연구는 2001년, 독일에서 마그네슘의 생체 분해 특성에 착안한 기초 연구가 시작된 이래(Heublein 등, 2003), 생체 분해성 혈관 스탠트 개발(Mario 등, 2004), 골절 고정용 임플란트 등 의료용 제품을 개발 하는 연구들이 진행되었다(Gu 등, 2009; Lim 등, 2017a;
Lim 등, 2017b; Schaller 등, 2017; Rahim 등, 2018;
Wiwanto 등, 2018).
본 연구에서는 생체 분해 금속을 활용한 약물 전달 체를 돼지의 구제역 백신 접종에 적용함으로써 약물 전달체를 이용한 구제역 백신 접종 시 항체 형성을 확 인하고 약물 전달체의 분해 양상과 이에 따른 생체 반 응을 조사하고자 하였다.
재료 및 방법
공시 재료
본 연구에 사용된 약물 전달체(Drug carrier)는 생체 분해성 마그네슘 합금(Mg-Ca-Zn alloy)이다. 선행 연 구를 토대로 생체 분해 속도를 고려하여 마그네슘을 주 재료로 한 3원계 합금(Mg-Ca-Zn alloy)으로 이루어 진 캡슐 형태의 약물 전달체를 제작하여 실험에 사용 하였다. 합금 제작 및 주조는 선행 논문에서 언급한 방법과 동일하게 진행하였다(Lee 등, 2016). 생체 내에 서 10주 내에 모두 분해가 일어나도록 칼슘(Ca)과 아 연(Zn)의 비율을 높게 조정하였는데 이는 금속간화합 물(Intermetallic compound)의 생성을 증가시켜, 이에 의한 상(Phase) 간의 전위차(galvanic potential)을 크게 하여 분해 속도를 높이는 원리를 이용하였다.
접종 실험에서 사용한 약물 전달체는 1.0 mL 용량 의 지름 5.8 mm, 길이 47 mm, 벽 두께 0.2 mm의 원통 형으로 제작하였다(Fig. 1). 모든 전달체는 실험 전 초 음파세척기를 이용하여 에탄올로 세척하였으며 이후 감마선 소독(25∼30 kGy)으로 멸균하였다.
구제역 백신은 실험 당시 국내에서 돼지에게 사용 중이었던 O 혈청형 불활화 정제백신(O 3039+O Manisa, 코미팜)을 사용하였다.
Fig. 2. Schematic figure of experimental design. IM; intramuscular vaccination with FMD vaccine at 8 and 12 week-old, n=4; SC+Carrier;
Subcutaneous vaccination and two biodegradable drug delivery carriers with FMD vaccine at 8 week-old, n=14∼22. Blood samples were collected at every week in all groups to evaluate SP antibody titers and necropsy was performed at 2, 4, 6, 8 and 10 weeks after surgery.
공시축 및 백신 접종
동물 실험은 국립축산과학원의 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 승인 후 동물실험 가이드라인을 준수하여 진행하였다(No. NIAS 2018-1321). 8주령 돼지 26두를 이용하여 총 10주간 실험을 진행하였다. 실험 1주 전 돼지의 건강상태와 혈액학적 수치를 확인하였으며, 모든 돼지는 무작위적으로 두개의 실험군으로 구분하 였다(Fig. 2).
그중 4마리의 돼지는 현재 국내 구제역 백신 접종 방법인 4주령과 8주령에 근육 접종(2 mL)을 각각 실 시하였으며(근육 접종군) 22두의 돼지는 우측 이근부 에 각 2개의 약물 전달체(각 1 mL 용량)를 삽입하고 동시에 2 mL의 구제역 백신을 피하에 접종하였다(약 물 전달체 접종군). 약물 전달체는 전용 접종 장치를 사용하여 삽입하였으며 접종 전 삽입 부위 소독 후 실 시하였다.
시료 채취
구제역 백신 항체(Structural protein, SP) 검사를 위 해 접종 전(0주)부터 접종 10주 후까지 1주 간격으로 모든 돼지의 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액으로 일 부는 혈구 분석(IDEXX Procyte DMTM, USA)을 실시 하고 나머지는 원심분리기(Beckman Coulter, USA)를 이용하여 5°C, 3,000 rpm에서 5분간 원심분리를 실시 한 후 혈청을 분리하여 검사 시까지 −20°C에 보관하 였다.
영상의학적 및 조직병리학적 변화를 확인하기 위해 약물 전달체 접종 후 2주부터 10주까지 2주 간격으로 약물 전달체 접종군 돼지 2두를 안락사 후 접종 부 조 직 샘플을 채취하여 전달체의 분해 양상과 분해 속도 를 조사하고 접종 부위의 조직병리학적 평가를 수행
하였다.
백신 항체 검사
매 회 구제역 항체 검사(SP)를 실시하여 측정한 개 체별 항체가(Percentage inhibition, PI)를 분석하여, 백 신 접종 방법 간의 SP 항체 검사를 PrioCHECK FMDV Type O Antibody ELISA kit (Prionics AG, Schlieren- Zurich, Switzerland)를 사용하여 제조사에서 공지한 실 험방법에 따라 실시하였다. ELISA 결과 판정은 지정 된 계산식에 따라 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하 여 PI 수치를 얻어 50 이상일 경우 양성으로, 50 미만 일 경우 음성으로 판정하였다.
영상의학 및 조직병리학적 검사
2주 간격으로 약물 전달체 접종군의 돼지 2두를 안 락사하고 접종부를 채취하여 미세 컴퓨터 단층 촬영 (Micro CT)을 실시하였다(130 kV, 60 µA, Skyscan 1173, Kartuizersweg). 촬영된 약물 전달체 이미지는 2D 또는 3D로 재구성하여 결과를 분석하였다. 영상 촬영 후 접종부를 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다. 24 시간 이상 고정 후 일반적인 조직 처리 과정을 거쳐 파라핀에 포매하고 4∼5 µm두께로 조직 절편을 제작 하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 하였다. 조직 절편은 슬라이드 스캐너(Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH LTD, Hungary)를 이용하여 분석하였다.
통계학적 분석법
백신 항체 검사를 통해 수집한 그룹별 PI 지수와 영 상의학검사에서 확인한 주차별 약물 전달체의 분해 속도에 대한 통계적 처리는 RStudio (RStudio Version
Fig. 3. Gross image at the loca- tion of biodegradable drug deliv- ery carrier injection. Injection after 0 hour (A), 24 hours (B), 1 week (C) and 2 weeks (D). Arrows point to injection site.
2.3.5033, USA)의 two-tailed t-test 및 one-way analysis of variance(ANOVA), Duncan’s Multiple Range Test를 이용하여 처리구간의 유의성을 검정하였다(P＜0.05).
결 과
생체 분해 캡슐의 접종 후 육안 검사 및 혈액학적 수치 분석
분해성 마그네슘 합금의 분해 속도를 확인하기 위 하여 총 22두의 돼지에 각 2개의 구제역 백신이 포함 된 생체 분해 약물 전달체를 접종하였다. 공시축은 모 두 건강축으로 선발하였으며 실험 기간 동안 정상적 인 활동 양상을 나타냈다.
접종 직후 접종부를 확인하였을 때 출혈은 미량이 었으며 24시간 후 캡슐이 이탈되지 않고 접종부위에 혈병(Clot)이 형성되었고 발적 및 열감 등의 염증반응 은 관찰되지 않았다(Fig. 3A, B). 약물 전달체의 접종 부를 육안적으로 관찰하였을 때 1주차부터 기종 (Emphysema)이 관찰되었다(Fig. 3C, D). 육안 검사를 통해 기종은 6주 이후부터 크기가 감소함을 확인하였 다.
총 실험 기간 동안 실험 전(0주), 실험 초기(1∼3
주), 실험 후기(10주)의 혈액학적 수치를 확인하였다 (Table 1). 실험 전(0주)과 실험 초기(1∼3주)의 결과를 확인하였을 때 혈액 내 총 백혈구(WBC) 수치는 그룹 간 차이가 없었으나 단핵구(MONO) 수치는 약물 전달 체 접종군에서 접종 2주 1.53 K/µL, 3주 1.58 K/µL로 나타났다. 이는 참고범위(0.3∼1.25 K/µL)보다 높은 수치로 근육접종군에 비해 유의적(P＜0.05)으로 증가 하였다. 호염기구(BASO) 수치가 약물 전달체 접종 3 주차에 0.01 K/µL로 근육접종군(0.02 K/µL)과 비교하 여 유의적(P＜0.05)으로 낮았으나 정상 참고범위(0.0∼
0.2 K/µL)임을 확인하였다. 실험 후기(10주)에는 두 그 룹간의 차이가 없었다.
생체 분해 캡슐을 이용한 구제역 백신 접종 후 백신 항체(SP) 검사
구제역 백신 접종 방법에 따른 항체가를 비교하기 위하여 기존 구제역 접종법을 따른 근육접종군(생후 8주, 12주 접종)과 약물 전달체 접종군(생후 8주 피하 접종 및 약물 전달체 접종)의 혈청 내 구제역 O 혈청 형 항체 검사를 진행하였다(Fig. 4). 근육접종군의 경 우 항체가는 접종 1주차 평균 65의 수치를 나타내다 5주차에 평균 89로 가장 높은 수치를 나타내었으며 이후 평균적으로 81의 항체가를 유지하였다. 약물 전
달체 접종군은 접종 1주차 평균 63의 수치를 유지하 고 이후 평균 60의 항체가를 지속적으로 유지하였다.
약물 전달체 접종군의 평균 항체가는 근육접종군보다 낮지만 두 그룹 모두 평균적으로 백신 항체가 양성 (양성=항체가 50 이상)임을 확인하였다.
생체 분해 약물 전달체의 분해 양상 및 체내 분해 속도 관찰
구제역 백신이 포함된 생체 분해 약물 전달체가 접 종 후 체내에서 분해되는 양상을 확인하기 위해 MicroCT를 이용, 접종 후 2주 간격으로 접종축 2두(약 물 전달체 4점)에 접종한 전달체를 관찰하였다. 이후 3D 이미지를 구성하여 체내 남아있는 전달체의 잔존 량을 계산하고 이에 따른 분해 속도를 확인하였다 (Fig. 5). 접종 2주차에는 전달체의 원형은 유지되었으 나, 분해로 인하여 형성된 미세 균열을 확인하였다 (Fig. 5A). 4주부터는 전달체의 원형이 소실되고 이후 작은 파편으로 나뉘어져 분해되는 것을 확인하였다.
Fig. 5B에서 전달체의 잔존량을 접종 전과비교하여 비 율로 확인하였을 때 2주차는 84.18%가 잔존하였으며 4주차에는 32.05%로 유의적으로 크게 감소하였다. 10 주차에는 잔존량이 4.60%로 관찰되어 전달체의 95%
이상이 10주 내 분해되는 것을 확인하였다. 분해 속도 는 2주차보다 4주차에 유의적으로 증가하고 이후로는 감소하였다.
생체 분해 약물 전달체의 접종 후 주차별 병리조직학적 평가
생체 분해 약물 전달체로 인한 조직의 염증반응 등 을 평가하기 위해 접종 후 2주 간격으로 병리조직학 적검사를 진행하였다(Fig. 6). 검사 결과, 10주차까지 전 주차에서 전달체가 분해되며 발생하는 가스로 인 하여 조직 내에 공포(vacuolation)가 관찰되었다. 전달 체 주위에는 분해로 인한 기종과 섬유아세포(fibroblast) 와 결합조직이 관찰되었다. 또한 분해 중인 미세 마그 네슘 잔존물도 조직 내에서 확인하였다. 접종 4주차까 지 접종부의 호중구(neutrophil) 및 대식세포(macrophage) 의 침윤이 뚜렷하게 관찰되었으며 이를 토대로 급성 염증반응이 진행되는 것을 확인하였다. 이후 10주에 이르기까지 염증반응은 점차적으로 감소하였다.
Ta bl e 1. C ha nge of h em at o log ica l v al u es ac cor di ng to the ex per im en tal pe ri ods Gr o u p W eek aft er in je ct io n
No . of an im al s
Par am et er s RBC (M /µ L) HCT (% ) Hb (g /d L ) R ETI C (K /µ L) WB C (K /µ L) NE U (K /µ L) LY M (K /µ L) MON O (K /µ L) EO S (K /µ L) BAS O (K /µ L) PL T (K /µ L) IM 0 4 5. 96±0. 1 6
a36 .23 ± 1.6 7
a10. 65±0. 4 0
a1 49. 95±15. 23
ab27 .35 ± 4. 02
a7. 84±2. 2 7
a17 .52 ± 1. 74
a1. 7 9± 0 .40
a0 .19 ± 0. 054
a0 .01 ± 0.0 06
a488 .00 ± 37 .41
a1 4 6. 29±0. 5 7
a39 .30 ± 2.9 7
a10. 98±0. 7 0
a23 0. 7 5± 5 7. 2 5
a19 .08 ± 2. 15
a6. 74±1. 4 0
a11. 11 ± 1. 39
b1. 00±0. 1 2
b0 .23 ± 0. 013
a0 .01 ± 0.0 05
a551 .25 ± 94 .91
a2 4 6. 47±0. 1 5
a39 .80 ± 0.4 1
a11. 40±0. 11
a11 2.5 3± 1 8.2 0
b20 .07 ± 3. 06
a7. 37±1. 7 4
a11. 6 2± 1 .41
ab0. 82±0. 1 9
b0 .25 ± 0. 023
a0 .02 ± 0.0 05
a351 .25 ± 10 7. 7
ab3 4 6. 44±0. 2 0
a37 .03 ± 1.4 3
a11 .13 ± 0. 34
a97 .41 ± 34 .54
b24 .80 ± 2. 98
a8. 57±0. 8 0
a12 .24 ± 1. 23
ab0. 97±0. 1 6
b0 .27 ± 0. 017
a0 .02 ± 0.0 04
a514 .50 ± 77 .59
a1 0 4 6. 83±0. 2 7
a41 .35 ± 0.9 7
a11 .70 ± 0. 27
a1 05. 88±20. 82
b19 .83 ± 2. 37
a6. 71±0. 8 5
a12 .04 ± 2. 04
ab0. 84±0. 1 7
b0 .23 ± 0. 037
a0 .01 ± 0.0 03
a207 .00 ± 59 .93
bSC+ D ru g d eliv ery ca rr ie r
0 2 2 6. 50±0. 11
b* 39. 71±0. 7 5
b11. 1 0± 0 .20
b1 52. 44±14. 87
b28 .60 ± 1. 72
a9. 2 2± 0 .98
abc17. 09±1. 11
a1. 9 8± 0 .15
a0 .30 ± 0. 043
a0 .01 ± 0.0 02
a504 .85 ± 35 .25
a1 2 2 6 .63 ± 0. 15
b39. 20±0. 8 5
b11. 1 0± 0 .25
b20 3. 4 0± 1 9. 0 7
a21 .85 ± 1.3 8
b7. 36±0. 5 5
bc12 .56 ± 0.8 7
b1. 46±0. 1 4
b0 .45 ± 0. 080
a0 .01 ± 0.0 01
a550 .41 ± 39 .94
a2 2 2 6 .82 ± 0. 13
b39. 86±0. 9 1
b11. 4 9± 0 .24
b1 09. 68±8. 6 8
c24 .67 ± 1. 28
ab9. 65±0. 5 3
ab13 .09 ± 0.9 0
b1. 53±0. 1 3
b* 0 .39 ± 0. 080
a0 .01 ± 0.0 02
a522 .95 ± 40 .30
a3 2 0 6 .94 ± 0. 15
b39. 01±0. 9 1
b11. 5 6± 0 .24
b1 07. 09±7. 8 0
c26. 11± 1 .48
ab10 .98 ± 0. 97
a13 .14 ± 0.8 7
b1. 58±0. 0 9
b* 0 .45 ± 0. 044
a0 .01 ± 0.0 02
a** 548 .85 ± 37 .00
a1 0 1 4 7. 46±0. 1 9
a42 .71 ± 1.1 9
a12. 51±0. 3 2
a94 .16 ± 8.5 4
c22 .63 ± 1.2 8
b6. 98±0. 8 2
c14 .25 ± 0.6 6
b1. 0 3± 0 .06
c0 .37 ± 0. 053
a0 .01 ± 0.0 02
a323 .86 ± 32 .38
bD at a ar e pr es en ted a s m ean ±S E M pe r gr ou p. D iff er ence s be tw een t w o g ro ups w er e com par ed u si ng a t w o- ta il ed t -t es t ( *P ＜ 0 .05 , ** P＜ 0. 0 1 vs I M gr oup ). D iff er enc es b et w ee n w eeks af ter i nj ect ion i n eac h gr ou p w er e com pa re d us ing one -w ay a nal ys is of v ar ian ce ( A N O V A ) w hi le i n di v idu al co m p ar is ons w er e obt ai n ed u si ng a D un can ’s M u lti p le R an g e T est (D if fe re n t le tte rs in d ic ate sig n ific an t di ff er enc es , P ＜ 0. 0 5) .
Fig. 5. 3D micro-CT image of whole outline of the 1 mL bio- degradable drug delivery carrier (A) and graph of residual carrier vol- ume and degradation rate (B). Data are presented as mean±SEM per group. Differences between multiple groups (weeks after injection) were compared using one-way analysis of variance (ANOVA) while individual comparisons were obtained using a Duncan’s Multiple Range Test (Different letters indicate significant differences, P＜0.05).
Fig. 4. The percentage of inhibi- tion (PI) of experimental groups after vaccine injection. IM; intra- muscular vaccination with syringe at 8 and 12 week-old, n=4; SC+
Carrier; Subcutaneous vaccination with syringe and biodegradable drug delivery carrier at 8 week-old, n=
14∼22. Data are presented as mean±
SEM per group. Differences between two groups were compared using a two-tailed t-test (*P＜0.05, **P＜
0.01 vs IM group).
고 찰
임상의학에서 생체 분해성 약물 전달체는 구강 투 여법에 비해 안전하고 효과적인 약물 전달법으로 현 재 많은 연구가 이루어지고 있다(Bose 등, 2019). 그중 에서도 마그네슘은 생체 안전성이 확인되어 의료용 임플란트로 이용되는 등 생체 분해 금속으로서 다양 한 연구가 진행 중이다(Rahim 등, 2018; Wiwanto 등,
2018). 본 연구에서는 돼지에서 생체 분해 금속을 이 용한 약물 전달 가능성을 보고자 분해성 마그네슘 약 물 전달체를 이용하여 구제역 백신을 접종하고 이에 따른 구제역 백신 항체 형성을 확인하였다. 또한 접종 한 약물 전달체의 체내 분해 양상과 조직 염증 반응을 관찰하였다.
육안 검사 시 관찰된 기종은 마그네슘 합금의 분해 시 발생하는 수소 기체에 의해 나타나는 것으로 여겨 진다(Lee 등, 2016). 마그네슘 합금의 분해 속도가 빠 를수록 생성되는 기체의 양이 증가하게 되며. 6주 이 후로 기종의 크기가 감소한 것은 분해 속도도 감소하 였고 전달체의 분해 양상으로 보아 전달체가 거의 분 해되어 기체 발생이 더 이상 없기 때문으로 추정된다.
혈구 분석 결과 총 백혈구(WBC) 수치는 그룹간 차 이가 없었으나 단핵구 수치는 약물 전달체접종군에서 접종 2, 3주에 유의적으로 증가하였고 정상 범위보다 높았다(Table 1). 단핵구는 혈액에서 순환하다 조직으 로 이동하여 대식세포로 분화하는 세포로 대식세포는 조직 내에서 식세포작용(phagocytosis)을 한다. 단핵구 가 약물 전달체접종군에서 증가한 것은 약물 전달체 분해로 형성된 미세 마그네슘 잔존물을 이물질로 인 식하여 식세포작용이 일어난 결과로 생각된다. 자돈 을 대상으로 한 차 등의 연구에서 구제역 백신 비접종 군에 비해 구제역 백신접종군(근육 접종)에서 접종 1 주부터 7주에 이르기까지 유의적으로 백혈구 수치가 증가가 보고되었다(Cha 등, 2017). 이와 다르게 본 연 구에서는 근육 접종 시에 유의적인 백혈구 수치 상승 을 확인할 수는 없었다. 이는 Faustini 등(2000)의 연구 에서 밝혀진 것처럼 스트레스, 영양, 온도 등 사육환 경의 차이가 백혈구 수치에 영향을 준 것으로 생각된 다.
구제역 백신 접종 후 항체가 결과에서 근육접종군
Fig. 6. The histopathological image at the location of biodegradable drug delivery carrier injection (H&E stain). Black arrows point to vacuola- tion, black arrowheads point to magnesium-based micro-metallic residues, yellow arrows point to neutrophils and yellow arrowheads points to macrophage. One portion in each ×5 magnification (square frame) is magnified to ×200. Scale bar=2000 µm (×5), 100 µm (×200).
이 5, 6주 차에 약물 전달체 접종군보다 항체가가 유 의적으로 높은 이유는 4주차에 진행된 2차 백신 접종 의 영향으로 사료된다. 이 외 기간에는 그룹별 백신 항체가 차이가 없었으며 두 그룹 모두 평균 항체가 양 성이었다. 이를 볼 때 약물 전달체를 이용한 백신 접 종법을 통해서 구제역 백신 항체를 형성할 수 있음을 확인하였다. MicroCT 결과와 비교하였을 때 약물 전 달체를 이용한 구제역 백신 접종 2주 후부터 미세 균 열을 통해 백신이 지속적으로 체내에 주입되어 항체 가 형성되는 것으로 생각된다.
4주차에 약물 전달체의 분해속도가 높아지는 것은 2주차부터 미세 균열 등을 통해 체액이 내부로 유입 되어 내부와 외부에서 동시에 분해가 진행되기 때문 으로 추정된다(Fig. 5B). 접종 10주차(생후 18주)의 잔 존량(4.60%)과 돼지의 출하시기(생후 22주)를 고려하 면 출하 시 잔존 전달체에 의한 문제는 적을 것으로 추정된다. 예비 실험에서 마그네슘 합금 조성 비율과 분해 속도와의 관련성을 확인한 결과 합금 비율에 따 라 분해 속도에 차이를 보였다. 생체와 유사한 조건으 로 체외 실험 시 전달체 전체가 분해되는 데에는 약 8 주가 필요할 것으로 추정하였으나 생체 실험 시에는 10주차에도 완전 분해가 일어나지 않았다(Fig. 5A). 또 한 같은 소재의 전달체라도 분해 속도에는 약간의 차 이를 보였다. 생체 분해성 소재 연구에서 혈류량에 따 른 분해 속도의 차이를 볼 때 개체별 특성과 삽입 위 치 주변의 혈관 분포도에 따라 오차가 나타나는 것으
로 여겨진다(Cho 등, 2012).
본 연구에서 생체 분해 약물 전달체를 가축에게 적 용하였을 때 마그네슘 합금이 분해되면서 생기는 가 스로 인한 기종을 확인하였다. 이는 빠른 분해 속도로 인해 많은 양의 기체가 발생하면서 나타나는 것으로 접종 조직이 지속적으로 자극되고, 이로 인한 염증 반 응과 더불어 조직의 손상이 나타나게 된다. 또한 접종 시 전달체가 표면으로 드러나면 분해되지 않고 혈류 량이 적은 지방 조직 내에 삽입되는 경우 분해 속도가 느려지게 된다. 따라서 가축 적용을 위해서 발생 기체 를 줄이고 접종 장치 등을 이용하여 동일 위치에 전달 체가 삽입되게 하여 분해 속도의 차이를 줄이는 추가 적인 연구가 필요하다.
결 론
본 연구는 동물의 백신 접종 시 생체 분해성 금속 을 이용한 첫번째 연구이다. 마그네슘 소재가 생체에 서 안정적으로 분해되는 것을 볼 때 가축에서 지속성 약물 접종을 위해 마그네슘 약물 전달체 적용이 가능 함을 확인하였다. 이는 향후 생체 분해 금속을 이용한 약물 전달체 연구의 기초 자료로 사용할 수 있을 것이 다.
감사의 글
본 연구는 농촌진흥청 연구사업(세부과제명: 생체 분 해 캡슐을 적용한 가축 대상약물 접종법의 개발 및 생 체 안전성 평가, 세부과제번호: PJ01296101) 지원으로 이루어졌습니다.
CONFLICT OF INTEREST
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
ORCID
Ara Cho, https://orcid.org/0000-0001-5309-7721 Sang-Ik Oh, https://orcid.org/0000-0003-0877-9170 Changyong Choe, https://orcid.org/0000-0003-4222-3360 Young-Hun Jung, https://orcid.org/0000-0002-8094-0304 Yoon Jung Do, https://orcid.org/0000-0003-3207-3514 Suhee Kim, https://orcid.org/0000-0002-9315-0360 Hyun Wook Choo, https://orcid.org/0000-0001-6630-1613 Jong Su Gu, https://orcid.org/0000-0001-6827-898X Woo-Jin Chung, https://orcid.org/0000-0003-1252-8470 Sung Youn Cho, https://orcid.org/0000-0003-1310-1807 Jae Gyu Yoo, https://orcid.org/0000-0002-8542-9193
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