해조 다당류 소재를 활용한 서방형 방출 수용성 이온 복합체 약물의 기능성 효과 연구
김 현 경†
†서원대학교 식품공학과
Functional Effects of Sustained Release Drug Delivery of Water-Soluble Ion Complex using Seaweed Polysaccharide
Hyun-Kyoung Kim
††Department of Food Science and Engineering, Seowon University, Cheongju, Korea (Received :Aug. 20, 2017, Revised : Sep. 16, 2017, Accepted : Sep. 23, 2017)
Abstract : This study investigates the functional effect of induced sustained release of a water-soluble drug without deterioration of drug efficacy and the use of specific carrier materials. A simplex-ion complex formation of the drug is produced based on the seaweed polysaccharide that carry physiological effects such as anti-inflammatory, anti-tumor, anti-viral, anti-mutagenic and immunity enhancement. The specific marine resources used in the experiment were Fucoidan extract and Glycosaminoglycan (GAGs), which is excellent in skin soothing effect and moisturising effect, respectively. Based on the use of such materials, this study has confirmed the formal structure of water-soluble ion complex drug that can be delivered in sustained release to the subject.
Furthermore, this study investigates the releasing effect of ion complex of Fuocidan, GAGs and Ca2+, Ba2+ and carries comparative analysis of the newly formed drug to Predniolone drug, which is widely used for dermatitis.
Keyword : Water-soluble drug, Seaweed Polysaccharide, Ion Complex, Drug Delivery, Dermatitis
1. 서 론
1)
최근 국민소득수준의 증가와 삶의 질 향상, 고령화 사회로의 진입에 따라 건강의 유지 및 증진이 무엇보 다 중요하다는 사회적 트렌드가 이어지면서 후코이단 및 글리코사미노글리칸 과 같은 해조 다당류 소재로부 터 의약품, 화장품 및 건강기능식품 소재로 주목받고 있다[1, 2, 3]. 대기 오염, 핵가족화, 모유 수유의 감 소, 교육 수준의 향상, 항생제 사용의 증가로 인한 항 원에 대한 노출의 증가, 주거 환경 변화, 공업 발달로
†Corresponding Author 성 명 : 김 현 경
소 속 : 서원대학교 식품공학과
주 소 : 충북 청주시 서원구 무심서로 377-3(모충동) 전 화 : 043-299-8474
E-mail : [email protected]
인한 새로운 항원 물질들의 등장 등으로 인해 최근 아 토피 피부염의 발생률이 증가하고 있어 관련 시장규모 도 꾸준히 증가하고 있다[1, 2, 3]. 따라서 고령화, 복지 사회로의 진입에 따라 각종 질병에 효과적이고 경제적인 치료가 요구되고 있어 DDS(Drug Delivery System) 기술을 이용하여 개인(환자)의 상태에 따라 필요한 양을 필요한 시기에, 필요한 곳에 투여하는 맞 춤형 투약시대가 도래할 것으로 전망하고 있다[4, 5, 6, 7].
본 연구에서는 항염증, 항종양, 항바이러스, 항돌연 변이 및 면역력 증강 등의 생리적 효능을 가지고 있는 해조 다당류 소재를 이용하여[1, 3, 4] 특정한 담체 재료의 사용 없이 수용성 약물 자체로 서방형 방출을 유도하여 매우 다양한 병변에도 효과적으로 적용이 가 능할 수 있도록 수용성 약물의 단순 이온 복합체 형성 을 통해 약효 저하 없이 서방형 방출의 가능성 여부를 알아 보고자 하였다. 따라서 본 연구 재료로 해조 다 당류 소재는 피부 진정효과가 뛰어난 미역귀 추출물인
Fucoidan과 보습효과가 뛰어난 멍게껍질추출물인 Glycosaminoglycan(GAGs)을 활용하여 수용성 약 물의 이온 복합체 형성 여부를 확인 하고, 음이온을 띠는 작용기를 가진 Fucoidan, Glycosaminoglycan 과 Ca2+, Ba2+이온에 의해 이온 결합된 Fucoidan, Glycosaminoglycan의 방출거동 효과도 알아 보았다.
또한 피부염에 가장 많이 사용되는 약물 Prednisolone 약물과도 비교 분석을 진행하였다.
2. 실험재료 및 방법 2.1 실험재료
본 실험의 재료로 사용한 해양 다당류는 수용성 약 물로 피부과 영역에서 높은 빈도로 사용되고 있는 후 코이단(fucoidan from fucus vesiculosus), 글리코 사미노글리칸(GAGs), 프레드니손(prednisolone sodium phosphate, Santa Cruz Biotechnology, USA)과 수용성 항생제의 이온결합 및 이를 통한 서방형 방출 을 위해 2가 양이온을 가지는 염화칼슘(CaCl2, Junsei, Japan), 바륨칼슘(BaCl2, Junsei, Japan), 수산화 나트륨(Na2HPO4, Sodium phosphate, Junsei, Japan)이 사용 되었다.
2.2 약물의 이온 복합체 제조
수용성 약물의 이온결합 형성을 위해, 5 wt%의 약 물 (후코이단, 글리코사미노글리칸, 프레드니손) 각각 과 CaCl2 수용액 (1, 3, 5, 7 wt%), BaCl2 수용액 (1, 3, 5, 7 wt%), Na2HPO4 수용액 (1, 3, 5, 7 wt%) 각각을 초순수에서 각각 제조하였다.
제조된 약물 수용액과 이온 수용액을 각각 1:1 (v/v)의 비율로 혼합하여 약물의 이온결합 (침전)을 유도하였다. 이온 결합된 약물을 포함하는 수용액을
1,200 rpm으로 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하 고, 이온결합에 참여하지 않은 이온(free ion)의 제거 를 위해 과량의 초순수를 이용한 세척 및 원심분리 과 정을 거치고, 최종 원심분리한 후 상층액 제거/동결건 조를 통해 이온결합된 약물을 제조하였다 (Figure 1, 2). 각각의 후코이단-이온복합체 및 GAGs-이온복합 체에서 후코이단 및 GAGs의 함유량을 확인하기 위해 당정량 분석을 진행하였다. 먼저 각각의 후코이단-이 온복합체 및 GAGs-이온복합체 1 mg을 1 mL의 초 순수에 녹인 후 그 중 166.5 μl를 채취하여 1.5 ml EP-tube에 넣었다. 그리고 25 mM의 사붕산나트륨 (Sodium tetraborate, Aldrich, USA)이 첨가된 황 산 (sulfuric acid 99.9%, Aldrich, USA) 666 μl 를 첨가하였다. 시료가 포함된 EP-tube를 100 °C에 서 10분 가열 후 상온에서 15분 식히고(cooling), 0.125%의 카바졸(Carbazol, Sigma, China) 시약 166.6 μl를 첨가하였다. 다시 100 °C에서 10분 가열 후 상온에서 15분 식히는(cooling) 과정을 통해 카바 졸 반응을 유도하였다. 반응된 시료를 UV/VIS spectrometer(흡광도 520 nm; Lambda 14, PERKIN ELMER, USA)를 이용하여 각각의 약물의 함유량을 확인하였다. 프레드니손은 이온 결합된 프레드니손 1 mg을 과량의 NaCl 수용액으로 해리시킨 후 UV/VIS spectrometer(흡광도 248 nm)를 이용하여 프레드 니손의 함유량을 확인하였다.
2.3 이온결합된 약물의 방출거동 분석
2.3.1 이온결합된 후코이단과 글리코사미노글리칸 의 약물 방출거동 분석
음이온을 띠는 작용기를 가진 후코이단, 글리코사미 노글리칸과 Ca2+, Ba2+이온에 의해 이온 결합된 후 코이단, 글리코사미노글리칸의 각각 방출거동을 비교 하였다. 약물의 방출실험은 EP tube를 이용하여 수행
Figure 1. Schematic diagrams of the ion-complexed. sustained release drug delivery system.
하였다. EP tube에 약물 1 mg을 넣고 1 mL 완충용 액을 채운 후, 37 ℃의 항온조에서 50 rpm으로 흔들 어주면서 (orbital shaking) 일정시간 (1, 2, 3, 5, 7일) 유지하였다. 이때 사용된 완충용액은 약물의 방 출에 가장 민감하게 작용하는 삼투압농도 및 이온농도 등이 인체 내 환경과 매우 유사한 phosphate buffered saline (PBS, pH ~7.4)이 사용되었다.
정해진 시간마다 원심분리기를 사용하여 상층액을 채 취하고 다시 새로운 완충용액을 교환해 주는 방법으로 방출된 시료를 채취하였고, 완충용액 내 용출된 약물 의 분석을 위해 UV/VIS spectrometer (Lambda 14, PERKIN ELMER, USA)을 사용하여 정량 분 석하였다.
Figure 2. Schematic diagrams of the ion-compexed Fucoidan, GAGS and Prednisolone formation.
2.3.2 이온결합된 프레드니손 약물의 방출거동 분석 양이온을 띠는 작용기를 가진 프레드니손과 Ca2+이 온에 의해 이온 결합된 프레드니손의 방출거동을 비교 하였다. 약물의 방출실험은 EP tube 를 이용하여 수 행하였다. EP tube에 약물 5 mg을 넣고 1 mL 완충 용액을 채운 후, 37 ℃의 항온조에서 50 rpm으로 흔 들어주면서 (orbital shaking) 일정시간 (1, 2, 3, 5, 7일) 유지하였다. 이때 사용된 완충용액은 약물의 방출에 가장 민감하게 작용하는 삼투압농도 및 이온농 도 등이 인체 내 환경과 매우 유사함 phosphate buffered saline (PBS, pH ~7.4)을 사용하였다.
정해진 시간마다 원심분리기를 사용하여 상층액을 채 취하고 다시 새로운 완충용액을 교환해 주는 방법으로 방출된 시료를 채취하였고, 완충용액으로 용출된 약물 의 분석을 위해 UV/VIS spectrometer (Lambda 14, PERKIN ELMER, USA)을 사용하여 정량 분 석하였다.
Figure 3. Schematic diagrams of the sustaine release of the ion-complexed drug.
2.4 이온결합된 약물의 세포독성 평가
실제 피부염에 가장 많이 사용되는 약물 프레드니손 의 세포독성을 평가하였다. 각각의 농도별 프레드니손 과 이온 결합된 프레드니손 복합체를 세포배양액 (RPMI, 10% FBS) 내에 채운 후, 37 ℃의 항온조 에서 50 rpm으로 흔들어주면서 (orbital shaking) 1일 유지하여 방출된 시료를 얻었다. 체내에 가장 많 이 존재하는 섬유아세포 (fibroblast)를 사용하였고, 10% 우태혈청 (FBS), 1% 항균제를 함유한 RPMI 배양액에서 37 ℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였으 며, 세포들이 80% 정도 confluence를 이루면 0.25% trypsin/EDTA를 이용하여 분리한 후, 2회 계대배양 하여 본 실험에 사용하였다.
이온 결합된 프레드니손 복합체의 이입효율을 분석 하기 위하여, MTS assay를 이용하여 세포독성을 관 찰하였다. 세포를 96-well plate에 1X104개의 세포 를 분주하여 24시간 동안 혈청을 포함하는 세포배양 액 (RPMI, 10% FBS)에서 배양하였다. 세포가 80% 정도 confluence된 후, 세포배양액을 제거하고 PBS로 세척한 다음 혈청을 포함하지 않은 control인 세포배양액과 혈청을 포함하지 않은 세포배양액에서 하루 동안 방출된 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10w%의 농도 의 프레드니손과 이온 결합된 프레드니손 복합체로부 터 방출된 시료 (200 μL)을 well에 다시 채워 37
℃, 5% CO2의 조건에서 하루 동안 배양하였다. 하루 뒤 well 내에서 세포배양액과 방출된 시료를 모두 제 거한 후, PBS로 세척한 다음 혈청을 포함하지 않은 세포배양액 100 μL에 MTS (Promega) 용액 20 μL 씩 넣고, 1시간 동안 37 ℃, 5% CO2에서 배양하였 다. 보라색 결정이 생성되면 microplate reader (ELISA reader, TECAN, Austria)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 이온 결합된 약물 복합체 형성여부 확인 3.1.1 이온 결합된 후코이단과 글리코사미노글리칸 형성여부 확인
Figure 4에서 보듯이, 후코이단과 글리코사미노글 리칸 수용액과 CaCl2 및 BaCl2 수용액의 혼합에 의 해 수용액이 뿌였게 되는 현상을 관찰함으로서 이온결 합에 의해 침전이 형성됨을 간접적으로 확인할 수 있 었다. Na2HPO4 혼합액과 후코이단 및 글리코사미노 글리칸 수용액은 약한 갈색을 띠는 투명한 상태로 어 떠한 침전물도 관찰할 수 없었으며, CaCl2 수용액은 글리코사미노글리칸에서만 침전물 형성이 되었고, 첨 가된 BaCl2 수용액에서는 침전물이 두 가지 모두 형 성됨을 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 첨가된 Ca2+이온 및 Ba2+이온이 후코이단과 글리코사미노 글리칸 각각 분자들간의 이온결합을 유도하고 이를 통 해 각각 이온결합된 후코이단과 글리코사미노글리칸의 용해도 감소로 설명되어 질수 있다. Figure 6에서 보 듯이, 이온농도별 결합된 약물의 수득률과 실제 이온 결합에 참여한 약물의 수득률을 통하여 후코이단-BaCl2
3 wt%, GAGs-BaCl2 3 wt%, GAGs-CaCl2 5 wt%로 이온농도를 선정하였다.
Figure 4. Confirmation of precipitation in the ionic solution of fucoidan and glycosaminoglycan.
3.1.2 이온 결합된 프레드니손 형성 여부 확인 Figure 5에서 보듯이, 프레드니손 수용액과 CaCl2
수용액의 혼합에 의해 침전이 형성됨을 간접적으로 확 인할 수 있었다. 이러한 현상은 phosphate 작용기가 pH~7.4에서 이온화되고 첨가된 CaCl2의 Ca2+이온 이 프레드니손 분자들간의 이온결합을 유도하고 이를 통해 프레드니손의 용해도 감소로 설명할 수 있다.
Figure 6에서 보듯이, 이온농도별 결합된 약물의 수득 률과 실제 이온결합에 참여한 약물의 수득률을 통하여 프레드니손-CaCl21 wt%로 이온농도를 결정하였다.
Figure 5. Confirmation of ion complexed prednisolone formation.
3.2 이온 결합된 약물의 서방형 약물 방출거동 확인 순수한 후코이단, 글리코사미노글리칸, 프레드니손 과 각각 이온 결합된 후코이단, 글리코사미노글리칸, 프레드니손으로부터 PBS 내에 방출된 약물의 방출거 동을 UV/VIS spectrometer을 이용하여 방출거동을 비교하였다. Figure 7에서 보듯이, 순수한 약물은 매 우 빠른 시간 내 (<24 시간)에 대부분의 약물이 방출 되는 거동을 보였으나, 본 연구에서 수행한 이온 결합 된 약물은 7일 동안 서서히 서방형 방출됨을 관찰할 수 있었다. 또한 Figure 7에서 보듯이, 순수한 프레 드니손은 매우 빠른 시간 내 (<24 시간)에 대부분의 약물이 방출되는 거동을 보였으나, 이온결합된 프레드 니손은 매우 빠른 시간 내(<24시간)에 대부분의 약물 대부분의 약물이 방출되는 거동을 보였으나, 이온결합 된 프레드니손은 14일 동안 서서히 서방형 방출됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 이온에 의해 이온 결합된 약물 (물에 불용성인 침전, 빠른 시간 내에 약 물 방출이 되지 않음)이 PBS에서, 이온의 상호 교환 현상이 서서히 진행되며, 이때 해리된 약물이 서서히 방출되기 때문인 것으로 보여지는 것으로 판단된다.
Figure 6. Changes of the ion complexed formation by ion concentration ; (A) ion (Ba ++) complexed fucoidan (B) ion (Ba ++) complexed glycosaminoglycan (C) ion (Ca ++) complexed Glycosaminoglycan.
Figure 8. Changes of the ion Complexed formation by Ion Concentration ; (A) ion complexed fucoidan (B) ion complexed glycosaminoglycan (C) ion complexed Prednisolne.
Figure 7. Changes of the ion complexed prednisone formation by ion concentration..
3.3 이온 결합된 프레드니손 세포 독성 평가 이온 결합된 프레드니손의 적절한 농도를 알아내기 위해 이온 결합된 프레드니손 농도 (0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10 mg/mL)에 따른 세포독성을 평가해 본 결과, 프레드니손의 경우 농도가 증가할수록 세포독성으로 인해 50%의 세포 생존율을 나타내지만, 이온 결합된 독시사이클린의 경우 농도가 증가하여도 75% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (Figure 9). 초기 빠른 방출로 인하여 많은 양이 녹 아나가는 프레드니손의 경우는 약물의 농도가 높아질 수록 세포 생존율이 낮아지고, 서방형 방출이 가능한 이온 결합된 프레드니손의 경우 동일한 농도임에도 불 구하고 세포 생존율이 높은 것을 확인하였다.
Figure 9. Cell viability of free prednisolone and ion-complexed prednisolone using fibroblast cell by
concentration.
4. 결 론
피부염을 적절히 치료하기 위해서는 건조한 피부의 수화 (hydration), 피부염 치료를 위한 부신피질호르 몬제, 소양증이나 이로 인한 수면장애를 치료하기 위 한 적절한 약물의 선정, 피부증상을 악화시키거나 유 발하는 자극물질이나 알레르겐의 회피, 감염체, 정서 적 자극요인을 찾아 피해주는 다각적이고 체계적인 치 료방침을 세워야하며, 또한 환자에 따라 악화요인이 다르고 발진의 정도를 포함한 피부반응 양상이 다르기 때문에 개별화한 치료를 하여야 한다. 이러한 치료의 단점은 약물의 빠른 초기 방출에서 기인되는, 병변의 치료를 위해 약물이 포함된 연고를 자주 바르는 번거 로움 및 이에 따른 환자의 의료비 비용부담이 높아지 는 문제점을 가지고 있다[8, 9]. 이에 본 연구에서는 수용성 약물의 서방형 방출을 위한 연구를 진행하였으 며, 특정 수용성 약물 (physiological condition에서
음전하를 띠는 작용기를 함유한 항생제)이 2가 양이온 인 Ca2+에 의해 침전 및 1가 양이온인 과량의 Na+ 이온에 의해 다시 해리됨을 발견하였다. 또한 본 연구 에서 후코이단 및 글리코사미노글리칸 수용액을 여러 가지 전하를 띠는 화합물 수용액과 간단한 혼합을 통 해 침전 형성 여부를 확인하였고. 그 결과 후코이단 수용액이 BaCl2 수용액과 만나 침전물을 형성하고, 글리코사미노글리칸 수용액이 CaCl2 또는 BaCl2 수 용액과 만나 침전물이 형성함을 확인할 수 있었다.
본 연구를 통해 수용성 약물의 서방형 방출이 가능 한 새로운 약물 전달 시스템으로 국소 환부에 적용 시, 약물의 이온 컴플렉스에 의해 수용성 약물임에도 불구하고 초기(24시간 이내)에 빠르게 방출되지 않고, 서방형 방출 거동 (일주일 이상)을 보여 국소 환부에 약물의 효과적인 전달은 물론 분말 상태로 직접적으로 환부에 적용시킬 수 있는 효과를 가진 약물전달시스템 을 개발하고자 하였다. 해조 다당류인 후코이단 및 글 리코사미노글리칸 소재를 이용하여 특정한 담체 재료 의 사용없이 수용성 약물 자체의 서방형 방출을 유도 하여 매우 다양한 병변에 효과적으로 적용이 가능한 수용성 약물의 단순 이온 컴플렉스를 통해 약효 저하 없이 서방형 방출 효과를 확인 할 수 있었다. 궁극적 으로 본 연구 결과물 기술은 다양한 분야에 적용할 수 있는 해조 다당류 소재를 응용하는 기술로서 IT, BT, ET, NT 각 분야 및 융합된 기술분야에 적용 가능한 원천기술로서 약물전달시스템 등에 적용하는 응용기술 및 활용도가 높은 기술로 판단된다.
참고문헌
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