第22卷 第2號 2014年 2月 20日
白鮮皮地膚子複合方의 항아토피피부염 효능에 관한 실험적 연구
심부용1 ․ 지중구2 ․ 이원융3 ․ 김수정3 ․ 김효영3 ․ 이지영3 ․ 김동희1*25)
Experimental Research of Baecksunpijibujabokhap-banng(BJBB) on Atopic Dermatitis Treatment
Sim Boo-Yong1 · Ji Joong-Gu2 · Lee Won-Yung3 · Kim Su-Jung3 Kim Hyo-Young3 · Lee Ji-Young3 · Kim Dong-Hee1*
1Dept. of Pathology, College of Korean Medicine, Daejeon University
2Dept. of Oriental health care, Joongbu University
3College of Korean Medicine, Daejeon University
In order to investigate the efficacy of BJBB on atopic dermatitis, various immune related factors were studied.
The results and conclusions are as follows. Atopic dermatitis symptoms were improved in BJBB treated group and significant decrease in dermatitis index were observed in 13 weeks. ALT, AST and BUN, Cr levels were all with in the normal ranges in BJBB treated group, indicating no induced toxicity. BJBB treated group showed significant decrease in CD4+, CD11b+/Gr-1+ immune cell ratio in dorsal skin by 33% and 62%
respectively. BJBB treated group showed significant decrease in the expression of IL-4, IL-5, IL-13 and histamine by 83%, 62%, 53% and 61% respectively. Also the group showed decrease in the transcription of IL-4, IL-5 and IL-13 mRNA in spleen by 41%, 52% and 50% respectively. BJBB treated group showed decrease in the expression of IgE by 57% respectively. The results above indicated that treatment of BJBB improved atopic dermatitis symptoms by immune modulation activity a clinical evidence. thus, BJBB has a potential use as a composition of medicinal plants for treatment against inflammation related disease.
Key words : Baecksunpijibujabokhap-banng(BJBB), atopic dermatitis, immune cell, cytokinin, mRNA
I. 緖 論
아토피피부염(Atopic dermatitis, AD)은 심한 소 양감, 홍반, 부종과 부스럼을 특징으로 하는 만성 습진성 피부질환이다1,2). 대부분 유․소아기에 시작하 여 성인에 이르기까지 재발과 악화를 반복하고, 환
* 교신저자 : 김동희, 대전시 동구 대학로62, 대전대학교 한의과대학.
E-mail : [email protected]
투고일 : 2013년12월19일 수정일 : 2014년 2월6일 게재일 : 2014년 2월 6일
경 및 식생활과 연관성이 있어 근본적인 치료에는 아직 한계가 있다3). 더욱이 환경 인자는 갈수록 악 화 일로에 있어 향 후 AD 유병률은 더욱 높아질 것 으로 예상되며, 실제 지난 몇 년 동안 AD 유병률은 지속적인 증가 추세로 보고되었다4,5).
국민건강보험공단의 2010년도 통계에 따르면 전체 인구의 1%가 AD를 가지고 있는 것으로 나 타났으며6), 천식과 동반될 가능성이 높고7), 성인 기까지 지속될 가능성이 있어 영‧유아기에 이에 대한 적절한 치료가 요구되고 있다.
AD에 대한 정확한 병리 기전은 아직까지 완전 히 규명되지 않았으나, 면역학적 조절장애를 주 기전으로 설명하는 연구들이 많다. 면역학적 기 전을 살펴보면, 항원에 의해 Th1 과 Th2 cytokines 사이의 균형이 깨지게 되고, 이로 인 하여 과잉 생산된 Th2 cytokine 인 IL-4, 5, 6, 13이 B cell을 자극하여 면역글로블린 E(IgE)의 증가를 초래한다8,9). 결국 AD의 가장 큰 특징 중 하나는 정상인에 비해 serum내에 IgE 레벨이 높 은 것인데, 이 때문에 IgE는 아토피피부염의 표 식자 역할을 한다고 알려져 있다10-13). 또한 Wollenberg14)는 AD 환자의 골수를 이식받은 사 람에게 AD가 옮겨질 수 있다는 것은 원인이 피 부 자체보다는 골수에서 발생하는 면역세포의 이 상과 같은 면역학적 기전과 관련성이 있다는 점 을 제시한 바가 있다.
현재 사용되고 있는 치료제들은 지속적인 연구 를 통하여 과거에 비하여 부작용을 최소화시키 며 상대적으로 보다 유의성 있는 약물들이 사용 되고 있으나 여전히 다용되는 부신피질호르몬제, 항히스타민제, 인터페론감마, 사이모펜틴 등은 일부 환자들에게서 치료 반응이 적거나 과민반응 혹은 신장 및 간장 독성 등의 부작용이 상존함으 로써 이에 대한 보완적 연구가 요구되고 있다15). 이러한 치료의 한계 및 부작용으로 인하여 특히 천연물에서의 치료제 연구는 국제적으로 많은 투 자가 이루어지고 있다.
한의학계에서도 기존의 한의서에서 AD와 유사 한 병증 중심의 약물과 처방을 중심으로 실험에 서 객관적 효능을 검증하고자 많은 연구가 이루 어져 왔으며 임상 역시 특화된 병원을 중심으로 한의학적 치료를 통하여 유의성 있는 치료 효과 를 보고함으로써 AD의 기초 및 임상에서 근본적 인 치료를 위한 많은 노력이 이루어져 왔다.
본 연구 역시 현재 임상에서 활용도가 높은 白 鮮皮地膚子複合方의 AD 개선 효과를 실험적으 로 입증하여 임상에서의 활용성을 제고함과 동시 에 향 후 보다 효과적인 한의학적 치료제 개발을 위한 기초적 자료를 제공하고자 하였다.
실험은 AD를 유발한 NC/Nga 생쥐 병태 모델을
이용하여 임상적 최종 결과인 피부염지수와 면역세 포 내 염증성 인자, 혈청 등에서 유관 면역 인자 및 비장에서의 유전자 발현량 등을 검색함으로써 본 처방의 항아토피효과를 평가하고자 하였다.
Ⅱ. 實 驗
1. 재료 1) 동물 및 사료
실험동물인 수컷 4주령의 NC/Nga Mice(16∼
22g)는 ㈜오리엔트바이오에서 공급 받아 실험 당일까지 고형사료(㈜퓨리나)와 물을 충분히 공 급하고 온도 22 ± 2℃, 습도 55 ± 15%, 12시간 -12시간(light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 본 실험은 대전 대 동물실험윤리 위원회의 승인(동물사용 윤리위 원회 승인번호 – DJUARB 2013-028)을 받아 동물 윤리 준칙에 의거하여 실험하였다.
2) 약재
본 실험에 사용한 백선피지부자복합방
(Baecksunpijibujabokhap-bang 이하 BJBB로 표 기)의 구성 약재들은 ㈜옴니허브에서 구입하였고, 대전대학교 지역혁신센터 난치성 면역질환의 동서 생명의학 연구센터(TBRC)에서 정선 후 사용하였 고, 그 내용과 분량(1첩)은 다음과 같다(Table 1).
Table 1. The prescription of BJBB Herbal
medicine name
Pharmacognostic name Weight (g) 白 鮮 皮 Dictamni Radicis Cortex 16 地 膚 子 Kochiae Fructus 16 夜 交 藤 Polygonum multiflorum
Thunb 16
豨 薟 草 Siegesbeckia glabrescens 12 蒼 耳 子 Xanthii Fructus 12 枳 實 Ponciri Fructus 12 艾 葉 Artemisiae Argyi Herba 8 桃 仁 Persicae Semen 8 山 査 Crataegi Fructus 8 甘 草 Glycyrrhizae Radix et
Rhizoma 8
Total
amount 116
3) 시약
사용된 시약은 isopropanol (Sigma Co., U.S.A.), ether (Sigma Co., U.S.A.), dulbecco's modified eagle's medium (DMEM : Gibco BRL Co., U.S.A.), fetal bovine serum(FBS : Invitrogen Co., U.S.A.), mouse cytokine milliplex map immunoassay kit (Millipore Co., U.S.A.), IL-4 kit(eBioscience CO., USA), IL-5 kit(eBioscience CO., USA), IL-13 kit(eBioscience CO., USA), Mouse IgE ELISA kit (eBioscience CO., USA), Mouse IgG ELISA kit (eBioscience CO., USA), total RNA prep kit (Intronbio., Korea), collagenase(Sigma Co., U.S.A), 2,4-dinitrochlorobenzene (Sigma Co., U.S.A.), ethanol (Merck Co., Germany), RBC lysis solution (Sigma Co., U.S.A.), anti-CD4-FITC (BD-Pharmingen CO., USA), anti-CD11-FITC (BD-Pharmingen CO., USA), anti-Gr-1-PE (BD- Pharmingen CO., USA), histamine ELISA kit (Biosource CO., U.S.A) 등을 사용하였다.
4) 기기
사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (Büchi B-480 Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540 Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo Co., Japan), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimadzu Co., Japan), centrifuge (Sigma Co., U.S.A.), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), thermocycler system (MWG Biotech Co., Germany), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), homogenizer (OMNI Co., U.S.A.), plate shaker (Lab-Line Co., U.S.A.), ELISA reader (Molecular Devices Co., U.S.A.), Flow cytometry system (BD Biosciences immunocytometry systems., U.S.A.), PCR machine (Thermal Dynamic., U.S.A) 등을 사용 하였다.
2. 방법 1) 시료 추출
BJBB 2첩에 80% 주정(C2H5OH) 1200 ㎖을 넣고 3시간 동안 환류 추출 후 여과액을 얻어 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하였 다. 농축된 용액을 freeze dryer로 동결 건조하 여 분말 20.5 g을 얻었으며, 얻어진 분말은 초저 온 냉동고(-80℃)에서 보관하면서 실험에 따라 필요한 농도로 증류수에 희석하여 사용하였다.
2) AST / ALT / Creatinine / BUN 측정 혈청 내에서 AST, ALT, Creatinine, BUN 측 정 활성도를 측정하기 위해 실험 종료 후 심장 천자법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분간 상온에서 굳힌 뒤 3,000 rpm에서 15분 간 원심분리 후 혈청을 분리하여, 서울의과학연 구소에 분석 의뢰 하였다. AST, ALT 활성도는 JSCC UV method의 원리를 이용하였으며, Creatinine의 함량은 Creatinine Jaffe Method 의 원리, BUN의 함량은 Kinetic UV assay for urea/urea nitrogen의 원리를 이용하여 생화학 자동분석기로 측정하였다.
3) 피부염 유도 및 시료 처리
7주령이 된 NC/Nga 생쥐의 등 부위를 제모한 후 24시간 방치하였다. 1% DNCB 용액 (아세톤 : 올리브 오일 = 3:1) 200 ㎕를 등 부위에 2주간 도포하고, 그 이후부터는 1주일에 3번씩 0.1%
DNCB용액 150 ㎕를 4주간 등 부위에 도포하였 다. 실험은 4개의 군으로 나누었으며 매일 1회, 오후 2시에 정상군, 대조군에는 증류수를, 양성 대조군인 dexamethasone(이하, Dexa) 투여군 과 BJBB 투여군은 각각 200 ㎕ (200 ㎎/㎏) 씩 투여하였다. 실험이 진행되는 동안 자유 식이를 하였다.
4) 관능 평가
7주령이 된 NC/Nga 생쥐를 2주간 DNCB 용 액처리 후 9주령, 11주령, 13주령 때에 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평
가법으로 관능 평가를 실시하였다. 평가 항목은 홍반 (Erythema), 가려움과 건조 피부 (Pruritus
& Dry skin), 부종과 혈종 (Edema &
Hematoma), 짓무름 (Excoriation), 태선화 (Lichenification) 등으로 5가지이다. 각각의 항 목은 없음 (0), 약함 (1), 중증도 (2), 심함 (3)으 로 채점하였다.
5) 면역세포 분리
실험 종료 후 DNCB로 유발된 NC/Nga 생쥐에 서 일정량의 배부 피부 조직을 잘게 조각내어 자 른 후 collagenase 1 ㎎/㎖ (in 2% FBS + RPMI 1640)을 넣고 37℃ shaker (140 rpm, 20min) 배양기에서 배양하여 상청액을 회수하는 방법으로 4회 반복하였다. 이들 세포들에 RBC lysis solution (Contains 8.3 g/L ammonium chloride in 0.01 M Tris-HCl buffer)을 실온에 서 5분동안 처리하여 적혈구를 용해시키고, 다시 D-PBS로 2회 세척한 후 cell strainer를 통과시 킨 세포를 유세포 분석에 사용하였다.
6) 형광 유세포 분석
분리한 세포를 5×105 cells/㎖ 농도로 조정한 후 4℃에서 면역형광염색을 실시하였다. 각각에 anti-CD4-FITC, anti-CD11b-FITC, anti-Gr -1-PE를 넣고 30분간 얼음에서 반응시킨 3회 이상 인산완충 생리식염수로 수세하고 flow cytometry로 분석하였다.
7) 혈청 내 사이토카인 및 IgE 생성량 측정 실험 종료 후 ether로 마취한 상태에서 심장 천자법을 이용하여 채혈한 다음 6,500 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. IL-4, IL-5, IL-13, histamine농도 및 IgE 생성량의 측 정은 ELISA kit를 이용하여 ELISA reader 450
㎚에서 흡광도를 측정하였다.
8) 비장 조직에서 유전자 발현 측정 (1) RNA 추출
실험 종료 후 비장 조직에서의 유전자발현을
측정하기 위해 RT-PCR을 시행하였다. 분리 한 비장 조직을 동결시킨 뒤 homogenizer로 조직 을 파쇄하여 easy blue 1 ㎖을 넣고 혼합한 후 chloroform (CHCl3) 200 ㎕를 첨가한 후 15초 간 다시 혼합하였다. 이를 4℃ 원심분리기를 이 용하여, 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 약 400
㎕의 상청액을 회수하여 binding buffer 400 ㎕ 와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 column에 용액 을 주입하였다. 이를 다시 4℃ 원심분리기로 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 washing buffer를 넣어주고 또 다시 원심 분리 한 후 washing buffer를 다시 넣어 수세한 후 elution buffer 50 ㎕을 넣고 1분간 암소하여 RNA를 추 출하였다.
(2) cDNA 합성
역전사 (reverse transcription) 반응은 RT premix kit의 mixture (reaction buffer, dNTPs mixture, RNase inhibitor, stabilizer, oligo dT15 primer)를 사용하여 total RNA 1 ㎍이 되 게 diethyl pyrocarbonate (DEPC) 처리된 증류 수에 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하여 첨가하였 다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심 침강하여 45℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성하였다. 이를 다시 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction (PCR)에 사용하였다.
(3) 비장 조직에서의 유전자 발현 측정 RT-PCR은 DNA polymerase 1U/tube에 250 mM dNTPs mix, RT buffer (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 30 mM KCl, 1.5 mM MHCl2)를 포함한 mixture에 각 샘플과 primer를 넣고 PCR을 시 행하였으며, 사용된 primer와 cycles 조건 등은 아래와 같다 (Table 2). 1% agarose gel에 전기 영동 후 유전자 발현의 여부를 UV로 촬영하여 각 그룹별로 band를 확인하고 RNA 발현을 측정 하였다.
Table 2. The Sequences of Primers Primer F/R Sequences
IL-4 F ATA TCC ACG GAT GCG ACAAA R TGA ATC CAG GCA TCG AAAAG
IL-5 F GGG GGT ACT GTG GAA ATGCT R TGC ACA GTT TTG TGG GGTTT
IL-13 F CAC ATC AGA CTT TGC TGGGG R CTC ACG GTC TTG CTG
CAG TT
Primer Cycle Annealing(℃)
IL-4 35 52
IL-5 35 53
IL-13 40 59
3. 통계처리
실험 결과는 실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test를 사용하여 통계처 리 하였으며 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001 수준 에서 유의성을 검정하였다.
Ⅲ. 實驗結果
1. 간 기능에 미치는 영향
간 기능 측정의 지표 성분인 AST(Aspartate aminotransferase)는 정상군이 74.1±6.4 (U/L), 대조군이 162.7±13.9 (U/L), Dexa 투여군이 72.9±16.1 (U/L), BJBB 투여군이 80.3±2.7 (U/L)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (** : P <0.01) 감소를 나타내었다.
ALT(Alanine aminotransferase)는 정상군이 39.7±4.1 (U/L), 대조군이 75.4±1.6 (U/L), Dexa 투여군이 39.0±3.7 (U/L), BJBB 투여군 이 44.6±2.1 (U/L)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (** : P <0.01) 감소를 나타내었다 (Fig. 1).
Fig. 1. Effect of BJBB extract on the AST and ALT of serum in DNCB-induced dermatitis models of NC/Nga mice(Significance of results,
** : P <0.01).
2. 신 기능에 미치는 영향
신 기능 측정의 지표 성분인 creatinine 농도를 측정한 결과, 정상군은 0.30±0.05 (㎎/㎗), 대조 군은 0.36±0.07 (㎎/㎗), Dexa 투여군은 0.33±0.07 (㎎/㎗), BJBB 투여군은 0.32±0.06 (㎎/㎗)으로 나타났다. BUN(Blood urea nitrogen) 농도는 정상군이 17.6±1.1 (㎎/㎗), 대조군이 24.7±1.3 (㎎/㎗), Dexa 투여군이 18.1±2.1 (㎎/㎗), BJBB 투여군이 18.7±2.0 (㎎
/㎗)로 나타났다 (Fig. 2).
Fig. 2. Effect of BJBB extract on the creatinine and BUN of serum in DNCB-induced dermatitis models of NC/Nga mice.
3. NC/Nga 생쥐의 피부염 지수에 미치는 영향 7주령의 NC/Nga 생쥐를 제모한 후 DNCB를 2주간 투여하여 피부염을 유발시키면서 실험군 인 BJBB를 5주간 경구투여 하였다. Fig. 3 는 9 주, 11주, 13주의 피부염 유발 정도와 개선 정도 를 나타내주는 사진으로, 대조군에서 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 증상이 확인되었다. 반 면 BJBB 투여군에서는 이들의 증상이 대조군에 비하여 현저하게 떨어졌음을 확인할 수 있었으며 (Fig. 3), 이 같은 결과는 피부염 지수에 반영되 어 나타났다. 피부염 지수는 아토피피부염을 유발 한 후 9주차부터 13주차까지 2주 간격으로 사진 촬 영을 한 후에 피부염의 심화 정도를 관능적 방법에 의하여 측정한 결과로, 대조군은 9주차에서 12.2±0.3, 11주차에서 11.1±0.4, 13주차에서 9.9±0.3의 결과가 나타났다. 반면 Dexa 투여군은 9주차에서 11.8±0.1, 11주차에서 6.7±0.4, 13주 차에서 4.9±0.3의 결과를 나타났으며, BJBB 투여 군은 9주차에서 12.3±0.2, 11주차에서 9.1±0.2, 13주차에서 7.0±0.4로 나타나 대조군에 비하여 모 두 유의성 있는 (*** : P <0.001) 감소를 보였다 (Fig. 4).
Control Dexa BJBB
9 w
11 w
13 w
Fig. 3. Comparison of skin manifestation in NC/Nga mice between control and experimental group.
Fig. 4. Effects of BJBB on clinical skin features and severity in DNCB-induced NC/Nga mice. (Significance of results, *** : P <0.001).
4. 背部 피부(Dorsal Skin) 내 면역세포 변화 에 미치는 영향
1) CD4+ 세포에 미치는 영향
BJBB 투여 종료 후에 背部 피부 내 면역세포 를 측정한 결과, 정상군은 3.7±2.1 (×105cells/
㎕), 대조군은 22.2±1.2 (×105cells/㎕), Dexa 투여군은 14.7±1.0 (×105cells/㎕), BJBB 투여 군은 14.7±0.6 (×105cells/㎕)로 나타나, 대조군
에 비하여 두 실험군 모두 유의성 있는 (*** : P
<0.001) 감소를 나타내었다 (Fig. 5).
Fig. 5. Effect of BJBB on CD4+ cell count of skin in DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice(Significance of results, *** : P <0.001).
2) CD11b+/Gr-1+ 세포에 미치는 영향 BJBB 투여 종료 후에 背部 피부 내 면역세포 를 측정한 결과, 정상군은 2.7±0.3 (×105cells/
㎕), 대조군은 35.4±4.9 (×105cells/㎕), Dexa 투여군은 10.6±1.7 (×105cells/㎕), BJBB 투여 군은 13.4±1.6 (×105cells/㎕)로 나타나, 대조군 에 비하여 두 실험군 모두 유의성 있는 (*** : P
<0.001) 감소를 나타내었다 (Fig. 6).
Fig. 6. Effect of BJBB on CD11b+/Gr-1+
cell count of skin in DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice(Significance of results, *** : P <0.001).
5. 혈청 내 사이토카인 생성량에 미치는 영향 1) IL-4 생성량
BJBB 투여 종료 후에 혈청 내 사이토카인을 측정한 결과, 정상군은 3.2±0.9 (MFI), 대조군은 25.4±2.4 (MFI), Dexa 투여군은 4.1±1.1 (MFI), BJBB 투여군은 4.3±1.3 (MFI)로 나타 나, 대조군에 비해 모두 유의성 있는 (** : P
<0.01) 감소를 나타내었다 (Fig. 7).
Fig. 7. Effect of BJBB on the level of IL-4 in the serum of DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice(Significance of results,
* : P <0.01).
2) IL-5 생성량
BJBB 투여 종료 후에 혈청 내 사이토카인을 측정한 결과, 정상군은 8.2±1.0 (MFI), 대조군은 14.7±0.9 (MFI), Dexa 투여군은 7.2±0.7 (MFI), BJBB 투여군은 5.5±1.1 (MFI)로 나타났 다 (Fig. 8).
Fig. 8. Effect of BJBB on the level of IL-5 in the serum of DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice.
3) IL-13 생성량
BJBB 투여 종료 후에 혈청 내 사이토카인을 측정한 결과, 정상군은 30.1±4.3 (MFI), 대조군 은 82.3±9.7 (MFI), Dexa 투여군은 39.2±3.7 (MFI), BJBB 투여군은 38.5±3.4 (MFI)로 나타 나, 모두 대조군에 비해 유의성 있는 (** : P
<0.01) 감소를 나타내었다 (Fig. 9).
Fig. 9. Effect of BJBB on the level of IL-13 in the serum of DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice(Significance of results, ** : P <0.01).
6. Histamine 생성량에 미치는 영향
BJBB 투여 종료 후에 혈청 내 histamine을 측 정한 결과, 정상군은 30.7±5.2 (ng/㎖), 대조군 은 88.9±4.9 (ng/㎖), Dexa 투여군은 34.1±4.3 (ng/㎖), BJBB 투여군은 37.8±3.1 (ng/㎖)로 나 타났으며, 대조군에 비하여 유의성 있는 (*** : P
<0.001) 감소를 보였다 (Fig. 10).
Fig. 10. Effect of BJBB on the level of
histamine in the serum of DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice(Significance of results, *** : P <0.001).
7. 비장조직에서의 유전자 발현에 미치는 영향 1) IL-4 유전자 발현
BJBB 투여 종료 후에 비장 조직에서의 IL-4의 유전자 발현을 측정한 결과, 대조군을 100.0
±6.1%로 나타내었을 때 정상군은 44.5±5.1%, Dexa 투여군은 67.4±3.8%, BJBB 투여군은 59.2±4.0%로 나타나, 대조군에 비해 감소를 나 타내었다 (Fig. 11).
Fig. 11. The level of IL-4 mRNA in spleen from DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice.
2) IL-5 유전자 발현
BJBB 투여 종료 후에 비장 조직에서의 IL-5의 유전자 발현을 측정한 결과, 대조군을 100.0±5.7%로 나타내었을 때 정상군은 61.8
±4.3%, Dexa 투여군은 54.2±4.9%, BJBB 투여 군은 48.1±6.6%로 나타나, 대조군에 비해 감소 를 나타내었다 (Fig. 12).
Fig. 12. The level of IL-5 mRNA in spleen from DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice.
3) IL-13 유전자 발현
BJBB 투여 종료 후에 비장 조직에서의 IL-13의 유전자 발현을 측정한 결과, 대조군을 100.0
±14.8%로 나타내었을 때 정상군은 42.9±12.1%, Dexa 투여군은 53.8±10.7%, BJBB 투여군은 50.1±11.4%로 나타나, 대조군에 비해 감소를 나타 내었다 (Fig. 13).
Fig. 13. The level of IL-13 mRNA in spleen from DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice.
8. 혈청 내 IgE 생성량에 미치는 영향
BJBB 투여 종료 후에 혈청 내 IgE를 측정한 결과, 최종 13주차에서 정상군은 41.1±1.8 (ng/
㎖), 대조군은 222.7±6.3 (ng/㎖), Dexa 투여군 은 81.4±2.4 (ng/㎖), BJBB 투여군은 95.6±2.1 (ng/㎖)로 나타나, 실험군 모두에서 대조군에 비
해 유의성 있는 (*** : P <0.001) 감소를 나타내 었다 (Fig. 14).
Fig. 14. Effect of BJBB on the level of IgE in the serum of DNCB-induced atopic dermatitis model of NC/Nga mice(Significance of results,
*** : P <0.001).
Ⅳ. 考 察
아토피 (atopy), 혹은 아토피피부염 (atopic dermatitis, AD)은 주로 영·유아기에 발병하여 만성적으로 재발되는 특징이 있으며, 소양증, 태 선화, 모공 각화증, 비 특이적인 습진 병변 등을 나타내는 피부 증상의 종합적인 질병군이라고 할 수 있다. 호흡기 알레르기의 병력이나 가족력과 연관성이 높으며, 최근 전 세계적으로 AD의 유 병률 증가16)로 인하여 사회적 관심이 증가하면서 치료제 개발에 많은 노력이 있어왔다.
세계적으로 AD의 유병율은 2-10%이며, 특히 7세 이하 어린이의 약 20%(미국 17.2%, 유럽 15.6%, 일본 24%)는 심각한 AD을 보유하고 있 다17).미국의 경우 과거 30년 동안 30%이상이 증 가하여 전 인구의 5-12%가 이 질병을 앓고 있고 유럽의 경우 4% 유병률로 2,100만명의 환자가, 일본의 경우 10%의 높은 유병률로 1,250만명의 환자가, 우리나라의 경우 최근 증가되는 추세로 10-15%의 유병률로 200-300만명의 환자가 있 는 것으로 보고되었다18).이와 같이 도시화된 선 진국, 산업화가 진행되는 대부분의 나라에서 증 가 추세를 보이고 있다19,20).
AD의 가장 큰 문제점은 원인이 다양하기 때문 에 치료가 쉽지 않고, 면역체계와 연관된 질병이 라 완치가 어렵다는 점과 일정 수준 완화 되었다 고 하더라도 재발이 쉬운 점, 그리고 환자들이 대 부분 영유아라는 점에서 문제시 되고 있다. 치료 는 주로 보습, 국소 스테로이드제, 국소 calcineurin 억제제, 항히스타민제, 피부 감염 조 절을 위한 보조 치료 및 광선치료나 면역반응 조 절제 등의 선택적 치료가 이루어지고 있으나 이 들 치료는 고열, 피부 위축 등의 다양한 부작용으 로 인하여 장기 사용이 어려운 실정이다15,23).
이러한 대증치료라는 한계성과 부작용에 대한 보완적인 연구로 최근 생약에 대한 논의가 활발 하게 이루어지고 있다. 특히 유기체적 이론에 의 한 한의학적 치료가 임상에서 유의성있는 결과가 도출되고, 기존 치료제의 내성으로 인한 치료의 한계성과 부작용을 극복할 수 있는 대안으로 인 식됨에 따라 이에 대한 의료 수요가 증가하고 있 다.
이와 같은 임상적 결과와 더불어 한약 및 한방 처방에서 보다 유의적인 치료 약물을 개발하기 위한 다양한 실험적 연구가 이루어지고 있으며, 이러한 실험적 연구 결과는 근거의학을 위한 기 초적 자료로써 활용되고 있다.
본 실험에서는 AD 병태 모델인 NC/Nga 생쥐 동 물 모델을 통하여 현재 임상에서 활용되고 있는 白 鮮皮地膚子複合方(BJBB)의 객관적 효능을 실험적 으로 규명함으로써 EBM(Evidence-based medicine) 구축에 일조하고자 하였다.
먼저 항상 사회적으로 문제시 되고 있는 안전 성 확인을 위해 실험 종료 후 NC/Nga 생쥐의 혈 액으로 ALT, AST, BUN, Cr 수치를 확인한 결 과 정상군 범위에서 큰 차이를 나타내지 않았다 (Fig. 1, 2). 이 같은 결과만으로 안전성을 확보 하기는 어렵지만 이미 복용 후 평가된 최종 결과 인 만큼 간독성과 신독성 측면에서는 어느 정도 안전한 것으로 인정되었다.
소양감은 AD의 가장 핵심적 증상으로 급⋅만 성기 모두에서 나타나며 긁는 행위로 인해 찰상, 이차감염(농가진, 단순포진) 등과 같은 이차적인
피부증상 악화를 초래할 수 있기 때문에 AD 치 료에 있어서 중요시되는 항목이다. 본 연구에서 는 BJBB가 아토피피부염이 유발된 NC/Nga 생 쥐에 대한 효과를 알아보기 위해 관능 평가를 실 시한 결과, Fig. 3에서 보는 바와 같이 현저한 피 부개선 효과를 보였고 대조군에 비해 유의적으로 감소(*** : P <0.001)한 것으로 나타났다 (Fig.
4). 이같은 결과는 BJBB가 소양감뿐만 아니라 긁는 행위로 인한 이차적인 피부증상 악화를 완 화할 수 있음을 시사하고 있고, 본 결과가 효능 평가의 최종 결과인 만큼 본 시료가 AD에 유의 적임을 알 수 있다.
AD의 병리학적 기전을 살펴보면, CD4+ T 세 포는 helper T cell로서 분비되는 사이토카인의 종류에 따라 Th1 cell과 Th2 cell로 분화하게 된 다. Th1 cell은 IFN-γ, IL-12와 같은 사이토카 인을 분비하여 감염된 대식세포의 활성화를 도우 며 Th2 cell은 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13 등과 같은 사이토카인을 생산하여 세포의 항체 생산을 보조한다. Th1과 Th2는 상호 견제와 균 형을 통해 면역반응을 조절하게 되는데 AD는 과 도한 Th2 cell의 발현으로 유발되는 것이다24).
AD가 유발된 NC/Nga 생쥐에서 背部 피부 내 면역 세포 수를 측정한 결과, 활성화된 T 세포를 나타내는 CD4+ T 세포와 성숙한 과립구의 특이 세포 표면 단백질인 CD11b+/Gr-1+의 세포 수 는 BJBB가 대조군에 비해 각각 33%, 62%로 유 의성 있는 감소(*** : P <0.001)를 나타내었다 (Fig. 5, 6). 결과적으로 BJBB가 CD4+와 CD11b+/Gr-1+ 세포를 감소시킴으로써 활성화 된 T 세포를 진정시키고 피부 내 과립구의 침윤 을 억제함으로써 병리적 진행을 차단하는 효능이 있음을 제시해 주고 있다24.25).
AD 환자의 혈청 내 IgE는 비정상적으로 높아 지는데, 이는 Th1과 Th2 사이토카인의 균형이 항원에 의해서 깨지게 되고, 그로 인해 비정상적 으로 과잉 생산된 Th2 사이토카인인 IL-4는 IgE 의 분화를 유도하고 유착분자들을 활성화시키며, IL-5는 호산구의 증식과 활성화를 유도하고, IL-13은 IgE 생산을 자극하는 것으로 보고되어
있다. 본 연구에서 혈청 내 IL-4, IL-5, IL-13 생성량은 BJBB가 대조군에 비해 83%, 62%, 53%로 모두 감소하였으며, IL-4와 IL-13 생성 량에서 유의성 있는(** : P <0.01) 감소를 나타 내어(Fig. 7, 8, 9) 면역조절능을 통한 항아토피, 항염증 효과가 인정되었다.
면역글로불린에 유해물질이 들어오면 과민반응 을 일으켜 histamine이라는 단백질이 생성되고, 이 histamine은 혈관을 확장시키고 독소와 수분 을 피부로 배출하여 AD 환자들은 histamine의 수치가 높아지게 되는데, BJBB 투여군은 대조 군에 비해 61%의 유의성 있는(*** : P <0.001) 감소를 나타냄으로써 (Fig. 10) 항히스타민 효능 이 확인되었다.
AD의 면역학적 요인에 관한 연구가 활발히 진 행되면서 급성기와 만성기에 관여하는 면역기전 에 차이가 있음이 밝혀지고 있다26,27). 급성기 병 변에서는 많은 수의 IL-4, IL-13 mRNA 표현세 포가 존재하지만, 만성기 병변에서는 IL-5, GM-CSF, IFN-ɤ, IL-12 mRNA 표현세포는 상 당히 증가한다. 본 연구에서는 이차 면역기관으 로 혈액 내 항원에 대한 면역반응을 시작하는 비 장의 조직을 통한 mRNA 유전자 발현을 측정한 결과, BJBB 투여군이 IL-4, IL-5, IL-13 mRNA 유전자 발현에서 각각 41%, 52%, 50%의 감소 를 나타냄으로써 (Fig. 11, 12, 13), 급만성기 병 변에서 나타나는 병리적 인자에 효과적임을 확인 할 수 있었으며, 혈청 내 사이토카인 결과와도 부 합되었다.
혈청 내 IgE 생성량 결과 역시 57%의 유의성 있는(*** : P <0.001) 감소가 나타남으로써(Fig.
14). 본 시료가 과잉 생산된 cytokine의 조절을 통하여 아토피피부염의 표식자인 IgE 생성량을 감소시켰음을 확인할 수 있었으며, 동물실험에서 임상지수 변화와 더불어 외부 조직형태학적 변화 등에서의 유의적인 결과가 도출됨으로써 항아토 피 효능을 실험적으로 확인할 수 있었다.
Ⅴ. 結 論
임상에서 활용도가 높은 白鮮皮地膚子複合方 의 AD 개선 효과를 실험적으로 입증하고자 NC/Nga 생쥐 병태 모델을 이용하여 임상적 최 종 결과인 피부염 지수와 염증 및 면역 관련 인 자들의 변화를 측정하였다. 먼저 복용이 끝난 NC/Nga 생쥐의 혈액 내 ALT, AST, BUN, Cr 수치에서는 모두 정상군 범위로 나타나 간장 및 신장 독성을 유발하지 않았다. CD4+, CD11b+/Gr-1+ 면역 세포 비율 역시 각각 33%, 62%로 유의성 있게 감소되었다.
혈청 내 IL-4, IL-5, IL-13 생성량은 각각 83%, 62%, 53%,로 유의성 있게 감소되었고, 비 장 조직에서의 IL-4, IL-5, IL-13 유전자 발현 역시 각각 41%, 52%, 50%로 감소되어 상호 부 합된 결과가 도출되었다.
AD 실험에서 가장 기본적인 염증 개선지표로 사용되고 있는 histamine 발현은 61%로 유의성 있게 감소되었으며, 면역매개 물질이자 기본 평 가지표인 IgE 생성량 역시 57%로 유의성 있게 감소시킴으로써 항염증 효능과 더불어 면역조절 작용을 통한 항아토피피부염 효능이 실험적으로 규명되었다. 보다 구체적인 치료 기전은 향 후 보 다 심도있는 연구를 통하여 보완되어야 할 것으 로 보이나 이 같은 전임상 단계의 결과는 임상 활용 제고와 더불어 향 후 보다 유의성 있는 치 료제 개발을 위한 기초적 자료로써 활용될 수 있 을 것으로 사료된다.
감사의 글
본 연구는 산업통상자원부 지정 대전대학교 난 치성 면역질환의 동서생명 의학연구 지역혁신센 터의 지원에 의한 것임.
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