[지상강좌] 의약품의 분리정제를 위한 SMB 기술의 응용에 있어서 체류시간분포의 문제

서론

의약품 및 생물화학제품의 생 산과정은 크게 upstream 단계와 downstream 단계로 나눌 수 있 다. Upstream 단계는 전체 과정 중에서 발효나 효소반응을 통하 여 해당 생물제품을 직접 발현시키는 과정에 해당되 는 부분이다. 이 과정에서 해당 생물제품 이외에 여러 부산물 및 불순물들이 얻어지게 된다. 이들을 분리해 내어 高純度의 원하는 생물제품을 얻는 과정이 downstream 단 계 에 해 당 된 다 . 일 반 적 으 로 downstream 단계에서의 분리정제 비용이 전체 공정 중에서 차지하는 비중이 매우 큰 것으로 알려져 있다.

의약품의 분리정제에 있어서 지금까지 많이 사용되 어 온 방법은 크로마토그래피(chromato-graphy)를 이용한 분리기술이다. 크로마토그래피 기술은 여러 분리 메커니즘을 이용할 수 있어 대상 물질에 따라 보 다 효율적인 분리를 할 수 있다. 또한 운용조건도 대부 분 상온(room temperature)과 대기압이기 때문에 생 물제품의 안정성에 문제점을 야기하지 않는 장점을 가지고 있다.

크로마토그래피를 이용하고 있는 산업현장에서 현 재까지 運用하고 있는 주된 방식은 batch process이 다. Batch 크로마토그래피 공정에서는 column에 고

정상(stationary phase)인 흡착제를 채워놓고 이동상 (mobile phase)을 하나의 inlet port로 주입하고 고정 상의 빈 공간들을 지나 하나의 outlet port로 배출되게 한다. 그 과정에서 mobile phase상에 있는 여러 성분 들이 흡착제와 상호작용을 통하여 진행속도에 차이를 가져오게 되어 outlet port까지 도달되는 시간이 달라 지게 된다. 이러한 원리로 원하는 성분만을 분리해낼 수 있다.

위와 같은 batch 크로마토그래피 공정은 여러 분리 메커니즘을 간단한 장치구조를 이용하여 손쉽게 실현 할 수 있다는 장점이 있는 반면에, 높은 생산성을 유 지하기 힘든 단점도 가지고 있다. 고정상 내에서 각 성 분의 band가 물질전달저항(mass-transfer resistance) 으로 인해 spreading되면서 다른 성분의 band와 쉽게 overlap될 수 있기 때문이다. 이러한 경우, 高純度를 유지하기 위해서는 수율(yield)과 생산성(productivity) 의 희생이 필요 불가결하다. 이러한 점들이 의약품의 분리정제비용을 상승시키는 요인으로 작용하게 된다.

이와 같은 batch 크로마토그래피의 단점을 극복할 수 있는 공정, 즉 高純度와 높은 생산성 및 수율을 동시 에 달성할 수 있는 대표적인 공정이 바로 [그림 1]에 보인 SMB(simulated moving bed) 공정이다.

SMB는 일반적으로 두 개의 inlet port(feed and desorbent)와 두 개의 outlet port(extract and raffinate) 문 성 용

한양대학교 화학공학과, [email protected]

에 의해 4개의 zone으로 나누어져 있는 구조를 가지 고 있다[그림 1]. 각 zone에는 흡착제로 채워진 column들이 연결되어 있다. 흡착제는 분리하고자 하 는 물질들이 서로 다른 흡착의 거동을 가지도록 선택 되기 때문에, SMB 내에서 각 물질들의 진행 속도에 차이가 발생하게 된다. 흡착제에 상대적으로 친화력 이 큰 물질(high affinity solute)은 유체(mobile phase)의 흐름방향을 따라 느린 속도로 이동하는 반 면, 친화력이 작은 물질(low affinity solute)은 빠른 속도로 이동하게 된다. 이때 네 개의 port를 유체 (mobile phase)의 흐름방향을 따라 일정한 시간간격 으로 동시에 움직인다. Port의 이동속도는 high affinity solute의 이동속도보다 크고 low affinity solute의 이동속도보다는 작도록 선택된다. High affinity solute는 port보다 뒤쳐지기(lag behind) 때 문에 항상 extract port에서 생산되고 반면에 low affinity solute는 port보다 앞서나가기(advance beyond) 때문에 항상 raffinate port에서 얻어지게 된

다. 그 결과 원료물질(feed mixture)은 항상 두 물질 들의 overlapping region에 주입되고 동시에 raffinate 와 extract는 항상 separated region에서 얻어지게 된 다. 따라서, 두 물질들을 완전히 분리하지 않고도 高純 度의 제품을 얻을 수 있게 된다. SMB의 시스템 내에 서 두 물질들을 완전히 분리할 필요가 없기 때문에, 보다 많은 양의 원료물질을 주입할 수 있게 되고 흡착 제의 효용을 극대화시킨다. 또한 소요되는 용매 (desorbent)의 양도 절감시킨다. 이러한 이유로 SMB 공정은 기존의 공정에 비하여 생산성을 증가시키며 조업비용을 현격히 감소시킬 수 있게 된다.

SMB 공정은 1960년대 초반 UOP(universal oil products, USA)에 의해, 석유화학제품의 정제를 위 하여 처음으로 도입된 공정이다. 그 이후로도 꾸준히 산업체에서 응용되었으며, 대표적인 사례로는 HFCS (high fructose corn syrup) 생산에서의 SMB 활용이 다. 최근 들어 SMB 기술은 정밀화학, 생물화학 및 의 약품 등의 고부가가치 제품에 분리정제공정으로 사용 되는 등, 그 응용범위가 날로 확대되는 추세에 있다.

SMB는 연속분리 공정으로서, 기존의 분리 공정들 에 비하여 높은 생산성과 작은 용매소요량을 가지고 있다. 특히 高純度를 요구하는 제품일수록 SMB의 경 제성은 더욱 커지는 것으로 보고되고 있다. 이러한 장 점으로 인해 미국과 유럽 등의 선진국들에서는 이미 SMB 기술을 산업체에 광범위하게 응용해오고 있으 며, 더 나아가 상당한 규모의 연구비를 각 대학 및 연 구소에 투자하고 있는 상황이다.

대표적인 고부가가치 제품이면서 高純度를 요구하 는 제품이 의약품이라고 할 수 있다. 최근 들어 chiral 의약품 중간원료나 항생제, 인슐린 등의 분리정제에 SMB기술이 응용되고 있다. 의약품정제로의 응용에 있어 SMB 기술이 중요하지만 지금까지는 간과되어왔 던 점들이 몇 가지 있다. 단백질분자의 체류시간분포 문제, 각 생산품의 integrity 확립, process robustness, 그림 1. Schematic diagram of a four-zone SMB (A) Step N,

(B) Step N+1(●Low-affinity component; ▲ High-affinity component).

(A)

(B)

periodic regeneration 등이다. 이러한 점들을 제기하 고 그에 대한 해결책을 찾는 것이 본 고의 목적이다.

이해를 위하여, 인슐린의 분리정제를 위한 SMB를 한 가지 예로 들면서 설명을 해나가도록 하겠다.

본론

① 인슐린 생산과정에서의 downstream process 인슐린(BHI, biosynthetic human insulin)의 전체 적인 생산과정을 [그림 2]에 나타내었다.

그림에서 보는 바와 같이 인슐린 생산을 위한 downstream 과정은 여러 단계의 batch chromato- graphic process로 이루어져 있다. 그 중에서 전체 분 리정제 비용에 가장 영향을 많이 미치는 단계는 batch size-exclusion chromatography (SEC) 단계이다. 그 이유는 batch SEC로부터 얻어진 인슐린이 최종 제품 의 質을 결정하기 때문이다. 이 단계에서는 HPI (proinsulin), HMWP(high molecular weight protein), ZnCl

로부터 인슐린(BHI)을 분리하고 있다[그림 3].

SEC에서는 분자크기가 작을수록 이동속도가 느리기 때문에, 크기가 작은 분자는 위에서 언급한 high affinity solute와 같은 맥락에서 이해하고 반면에 크 기가 큰 분자는 low affinity solute로 이해하면 된다.

따라서 인슐린 분리를 위한 batch SEC에서는 분자크 기가 제일 큰 HPI와 HMWP가 거의 비슷한 시간으 로 column을 빠져나가고, 분자크기가 제일 작은

ZnCl

가 맨 나중에 빠져나간다. 반면 인슐린(BHI)은 앞에서 언급한 두 분자들의 중간 정도의 분자크기를 갖고 있기 때문에, HPI/ HMWP와 ZnCl

의 elution time 사이에 column을 빠져나간다.

② 인슐린의 분리정제를 위한 size-exclusion SMB 위에서 언급한 batch SEC는 생산성과 수율이 낮아 서 인슐린 생산비용 절감에 큰 걸림돌이 되어왔다. 이 문제점을 해결하기 위해 기존의 batch SEC를 SMB process로 전환하는 연구가 최근에 시도되었다. 이 연 구에서는 두 개의 SMB (tandem SMB)를 사용하여 인슐린을 연속적으로 분리하였다. [그림 4]에서 보는 바와 같이 첫 번째 SMB(Ring I SMB)에서는 인슐 린을 HMWP로부터 분리하고 ZnCl

는 전체 SMB 영역 내에서 퍼지도록 하였다. Ring I의 extract port 에서 얻어진 인슐린과 ZnCl

는 다시 두 번째 SMB인 Ring II SMB로 주입되어 각각 분리되었다. Ring I에 서는 인슐린이 slow-moving solute(extract product) 에 해당되는 반면에 Ring II에서는 인슐린이 fast- moving solute(raffinate product)에 해당된다. 운전

Recombinant E. coli.

Trp proinsulin

Proinsulin

Crude insulin

Purified BHI

Homogenization

Cleavage, oxidative sulfitolysis, folding

Enzymatic transformation Ion-exchange Reversed-Phase HPLC Size exclusion chromatography (SEC)

그림 2. Biosynthetic human insulin(BHI) process.

Proinsulin / HMWP Insulin (BHI, product) Zinc Chloride

그림 3. Diagram of the batch SEC process for recovery of

BHI.

조건(operating condition)에 해당되는 각 zone의 flow rate와 switching time은 standing wave design 으로부터 얻어진 값들을 사용하였다.

③ 인슐린의 분리정제를 위한 SMB에서의 체류시간 분포

인슐린과 같은 단백질 분자들은 고정상(stationary phase)과 접촉되어 있는 시간이 길어질수록 aggregation이나 denaturation이 일어나기 쉬워진다.

이러한 이유로 인슐린의 고정상에서의 RT(residence time, 체류시간)와 RTD(residence time distribution, 체류시간분포)에 대한 연구가 필요하다고 할 수 있다.

Batch chromatography는 하나의 product port가 고정된 위치에 있고 全 영역이 동일한 flow rate로 되 어 있어 RTD의 해석이 매우 용이하다. 이에 반해 SMB에서는 두 개의 product port(raffinate와

extract)가 주기적으로 움직이며, flow rate도 각 zone 마다 다르고 또한 SMB 내에 recycle이 존재한다[그 림 1]. 이러한 SMB의 구조적 특성 때문에 SMB에서 의 RTD 해석은 batch process와 달리 매우 어렵다.

그래서 본 고에서는 local equilibrium analysis(LEA) 와 detailed rate-model analysis(VERSE)를 사용하 여 이 문제를 체계적으로 접근하고자 한다.

SMB에서의 RTD의 가장 큰 특징 중의 하나는 RTD가 feed port로 주입되는 solute의 injection time 에 크게 의존한다는 사실이다. [그림 5]에서 보는 바 와 같이 한 step period내에서 서로 다른 시간에 주입 된 solute의 RTD 형태와 그것의 mean residence time 이 확연히 다름을 알 수 있다.

Ring I SMB에서 한 step period동안의 인슐린의 RTD를 [그림 6]에 보였다. 선(line)으로 표시된 부분 은 mass-transfer effects를 고려하지 않은 ideal 상태 에서의 결과(LEA)이고 기호(symbol)로 표시된 부 분은 mass-transfer effects를 포함한 결과(VERSE) 이다. 일찍 주입된 인슐린이 나중에 주입된 인슐린보 다 더 오랫동안 SMB내에서 머무르는 것을 볼 수 있 다. 그리고 이러한 경향은 mass-transfer effects가 고 려될 때 더 심해진다. 반면 Ring II SMB에서는 늦게 주입될수록 인슐린의 residence time이 커지는 것을 볼 수 있다. 이와 같은 결과는 각 product port와 feed port간의 상대적 위치와 port의 주기적인 이동에 기인 한다.

분리하고자 하는 두 물질간의 selectivity(선택도) 도 SMB내에서의 solute residence time에 영향을 미 친다. Selectivity는 zone II와 zone III에서의 net solute linear velocity에 직접적인 영향을 주며, 이것 이 다시 solute residence time에 영향을 주게 된다.

Feed port로부터 raffinate port를 향하여 이동하는 fast-moving solute인 경우, zone III에서의 net solute linear velocity(u

)와 selectivity와 관계는 아래와

FIRST SMB

SECOND SMB

ELUENT EXTRACT ( ) FEED ( )

ELUENT EXTRACT ( )

FEED ( ) RAFFINATE ( )

RAFFINATE ( ) Proinsulin/HMWP Insulin

Zinc Chloride

그림 4. Diagram of the tandem SMB process for recovery

of insulin.

같이 표시될 수 있다.

u

=(Selectivity-1)×(port movement velocity) (1) 식(1)에서 보듯이, selectivity가 낮을수록 u

가 감 소한다. u

가 감소할수록, fast-moving solute가 product port까지 이동하는 데에 걸리는 시간이 길어 지게 된다. 이러한 이유로 selectivity가 낮아질수록, fast-moving solute의 residence time은 증가하게 되

는 것이다.

Feed port로부터 extract port을 향하여 이동하는 slow-moving solute의 residence time은, zone II 에 서의 net linear solute velocity(u

)에 큰 영향을 받는다.

| ^u

| =(1---)×(port movement velocity) 1 (2) Selectivity

그림 6. Analysis of the residence time of insulin in the tandem SMB (A) Ring I SMB, (B) Ring II SMB( t

from VERSE,

∆ t

from VERSE, □ t

from VERSE, t

from LEA, t

from LEA).

(A) (B)

그림 5. RTD for a pulse in the extract port of SMB with mass-transfer effects (A) Injection of a pulse during the first half of the switching period, (B) Injection of a pulse during the second half of the switching period.

(A)

(B)

Fast-moving solute의 경우와 마찬가지로, selectivity 가 낮아질수록 slow-moving solute의 residence time 은 증가하게 된다.

④ SMB에서의 solute residence time을 줄이기 위한 방법

위에서 인슐린의 residence time이 injection time에 크게 영향을 받는다는 것을 살펴보았다. 따라서 가장 먼저 생각해볼 수 있는 방법은, 원료물질(feed mixture)을 한 step period의 모든 시간에 걸쳐 주입 하는 total feeding 방식을 피하고, 일부의 시간에 한 해서만 feed를 주입하는 partial feeding 방식을 취하 는 것이다. Ring I SMB에서의 인슐린은 각 step period의 前半部에 주입될 때에 긴 residence time을 갖기 때문에[그림 6(A)], feed를 각 step period의 後 半部에 주입하면 인슐린의 residence time을 줄일 수 있게 된다. 이와는 반대로, Ring II SMB에서의 인슐 린은 각 step period의 後半部에 주입될 때에 긴 residence time을 갖기 때문에[그림 6(B)], feed를 각 step period의 前半部에 주입하면 인슐린의 residence time을 현격히 감소시킬 수 있게 된다. [그림 7]에서, partial feeding 방식과 total feeding 방식에 따른 인 슐린 effluent history를 보였다. 그림과 같이, partial

feeding을 취할 때에, 인슐린이 product port로 훨씬 더 일찍 빠져 나오는 것을 확인할 수 있다.

SMB에서의 solute residence time을 줄이는 또 한 가지 방법은 zone II와 zone III에서의 flow rate를 변화 시켜 solute wave를 standing wave가 아닌 pinched wave 형태로 유지시키는 방법이다. Standing wave 로 유지시킬 때에는 단위시간당 원료물질처리량을 극 대화시킬 수 있다는 장점이 있지만, 각 solute wave가 port와 거의 비슷한 속도로 움직이기 때문에, solute들 이 product port까지 이동하는데 걸리는 시간이 매우 길어진다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 zone II의 flow rate를 standing wave flow rate 보다 높게 하거나, 혹은 zone III의 flow rate를 standing wave flow rate보다 낮게 유지시킨다. 이러 한 경우, zone II와 zone III에 위치한 solute wave가 feed port쪽으로 근접해 위치하게 되고, 이러한 solute wave들을 pinched wave라고 한다.

[그림 8(A)]에 pinched wave design에 기초한 Ring II SMB에서의 인슐린 residence time을 보였다.

Standing wave design에 기초한 [그림 6(B)]에 비 해 인슐린 residence time이 많이 감소함을 확인할 수 있다. [그림 8(A)]에서는 pinched wave design에 기 초한 Ring II SMB에서의 인슐린의 effluent history

그림 7. Effect of partial feeding on the residence time of insulin (A) Effluent history of insulin(extract product) in Ring I, (B) Effluent history of insulin(raffinate product) in Ring II.

(A) (B)

를 standing wave design에 기초한 결과와 비교하였 다. 역시 pinched wave design에 기초한 SMB에서의 인슐린이 product port를 훨씬 더 일찍 빠져 나오는 것을 확인할 수 있다.

결론

최근에 SMB기술이 기존의 석유화학제품의 분리에 서 생물제품 및 의약품과 같은 고부가가치 제품의 분 리정제로까지 응용되고 있다. 이러한 과정에서 고려 되어야 할 사항들 중의 한가지는 SMB내에서의 solute residence time이다. Residence time이 커질수 록 분리하고자 하는 물질들의 안정성이 크게 저해될 수 있기 때문이다. 대표적인 경우가 인슐린과 같은 의 약품의 분리정제이다. 인슐린은 packed bed내에 오래 체류할수록 변성화될 가능성이 커진다.

SMB를 이용한 인슐린의 분리정제에 있어서, solute residence time이 injection time에 크게 의존한 다는 사실이 확인되었다. Extract port로 빠져나가는 solute는 feed port로 일찍 주입될수록 residence time 이 길어진다. 반면에, raffinate port로 빠져나가는 solute는 feed port로 늦게 주입될수록 residence time 이 길어진다. 이러한 사실로부터, 일반적인 feeding 방

식인 total feeding보다는, 각 step period내의 일부분 에서만 feed를 주입하는 partial feeding 방식이, solute residence time을 최소화하는데 매우 효과적임 을 알 수 있었다. 또한 standing wave design보다는 pinched wave design에 바탕을 둔 SMB 운전조건이 residence time을 작게 한다는 것도 확인할 수 있었다.

이와 같은 방법들은 비단 인슐린의 분리정제인 경우 뿐만 아니라 다른 단백질분자나 생물화학제품의 분리 정제에도 적용될 수 있다.

분리하고자 하는 물질의 개별적 특성이 SMB기술 의 응용을 어렵게 할 수 있지만, 체계적인 접근방법과 연구를 통해서 어려운 점들을 충분히 극복할 수 있다 는 것을 본 고에서 다루웠다. 따라서 고부가가치 제품 의 분리정제에 있어 SMB기술의 현장 도입은 긴밀한 산학협력에 바탕을 둔 연구가 필수적이라는 제안을 마지막으로 이 글을 마무리하고자 한다.

그림 8. Effect of pinched wave design(or non-standing wave design) on the residence time of insulin in Ring II SMB (A) Residence time of insulin based on the pinched wave design, (B) Effluent history of insulin(raffinate product).

(A) (B)

저자약력

1997 한양대학교 화학공학과 학사 1999 KAIST 화학공학과 석사

2002 미국 Purdue대학교 화학공학과 박사

현재 한양대학교 화학공학과 교수