[특별기획] 단백질 안정화 전략 : 분자모델링 설계

3) 퇴행성 신경질환 치료제 개발

고령화가 진행되고 삶의 질에 대한 관심이 고조 되면서 알츠하이머와 파킨슨씨병과 같은 퇴행성 신경질환의 치료가 세계적으로 핫이슈가 되고 있 다. 본 연구실에는 이들 질환의 in vitro 모델인 β- amyloid-PC-12 세포 시스템과 α-synuclein의 과 발현 시스템을 이용해서 치료제로서의 누에체액 과 30K 유전자의 가능성을 확인하고 있다.

4) 신 기능성 항산화물질의 탐색 및 개발

과거 연구에서 누에체액이 세포의 활성산소를 유발하는 기작에 의한 에이파토시스를 저해하는 효과를 토대로 누에체액 내 항산화 물질에 관심을 가지게 되었다. 활성산소는 인체 내에서 생성되어 세포의 지질, 단백질, DNA 등을 공격하여 변성과 파괴를 일으킨다. 반면, 항산화물질은 이러한 활성 산소의 생성을 억제하거나 활성을 감소시켜 주는 물질을 가리키며 비타민, 카로틴, 토코페롤 등이 대표적인 항산화물질에 속한다.

기존에 알려진 항산화물질에 비해 활성이 우수 하고 화학적 안정성 및 경제성이 뛰어난 신물질의 누에체액 내 존재 가능성을 DPPH 라디칼 소거 실험과 수퍼옥사이드 활성 측정 실험 등을 통해 확인하였으며, 이 물질의 동정과 구조 분석을 위 해 젤 투과 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 LC/MS, NMR 방법으로 분자 구조를 규명하고 항산화능과 더불어 항당뇨, 항암 효과와 같은 복 합 기능 여부에 대한 연구가 진행되고 있다.

단백질(특히 산업용 효소 및 치료용 단백질)은 부가가치가 높아 산업적, 의학적 중요성이 계속 커지고 있다. 단백질을 산업적으로 사용하는 경우, 단백질이 고가이며 안정성이 낮다는 점이 문제점 으로 지적되고 있어 실용화에 큰 장애가 되고 있 다. 산업적으로 단백질은, 세포내의 온화한 환경이 아닌, 높은 온도, 높거나 낮은 pH, 또는 유기 용매

등과 같은 극한 환경에서 사용되기 때문에 낮은 안정성을 보인다. 단백질 불안정성은 단백질의 의 학적, 산업적 유용성 저하의 주원인이므로 효과적 인 단백질 안정화 전략을 수립하여 이러한 문제점 을 극복해야 한다. 그래야만 단백질 및 효소를 이 용한 산업이 활성화되고 발전할 것이다. 본 고에 서는 다양한 단백질 안정화 전략 중 단백질 공학

：

주정찬·유영제

서울대학교 화학생물공학부 {kokume02, yjyoo}@snu.ac.kr

당쇄향상,

고농도 세포배양, 세포사멸 억제, 단백질의약품, (KPO, FSH 등) 누에체액, 30K

무혈청배지,

30k 발현, 생산성 증가,

그림 10. 누에체액과 30K 단백질을 이용한 단백질 생 산 전략.

(protein engineering) 방법에 의한 최근의 단백 질 안정화 기술에 대하여 소개하고자 한다.

단백질 안정화 방법

단백질의 안정성은 다음 [표 1]에서와 같이 극 한 미생물 스크리닝(extremophiles screening), 첨가제(additives), 고정화(immobilization), 화학 적 변형(chemical modification), 용매 개량(solvent engineering), 단백질 공학(protein engineering) 등과 같은 다양한 방법을 통해 향상되고 있다. 그 러나 이러한 방법들은 대부분 실험과 경험에 의존 하는 trial-and-error 방식으로 단백질 안정성 향

상에 한계가 있고 많은 인력과 비용이 요구된다는 단점이 있다.

단백질 공학에 의한 단백질 안정화 전략 고정화, 첨가제, 화학적 변형, 용매 개량 등은 단 백질 자체가 아닌 외부 요소를 이용하여 단백질 안정성을 향상시키는 방법인 반면, 단백질 공학 (protein engineering)은 대상 단백질 자체를 유 전공학기법을 이용하여 개량함으로써 원하는 환경 에서 단백질 안정성을 증가시키는 방법이다. 단백 질 공학에 의한 단백질 안정화 전략은 크게 경험적 설계(rational design)와 방향적 진화기술(directed evolution) 두 가지 방법으로 나눌 수 있다.

경험적 설계는 x-ray crystallography나 NMR 에 의해서 밝혀진 단백질의 3차원 구조를 단백질 구조-안정성 면에서 분석하고 안정성에 중요한 영 향을 줄 것으로 예측되는 몇 개의 아미노산을 특정 부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 통해 바꾸어 줌으로써 안정성이 향상된 변이주를 얻는 방법이다.

방향적 진화기술(directed evolution)은 대상 단 백질의 유전자에 무작위 돌연변이(random mutagenesis)를 유발하여 라이브러리(library)를 만든 후 이 라이브러리 내에서 안정성이 향상된 변이주를 스크리닝한 뒤 이 변이주를 이용하여 다 시 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 단계를

스크리닝 호열성, 호산성, 고압성 미생물 스크리 닝을 통한 안정한 단백질 탐색 첨가제 폴리올(polyol), 아미노산 등의 저분자

물질 첨가를 통한 안정성 향상

고정화

고 분 자 담 체 에 단 백 질 고 정 화 , encapsulation, sol-gel법 등을 통한 안정 성 향상

화학적 변형 PEG 등의 거대분자의 단백질 수식을 통한 안정성 향상

용매 개량 water contents 조절, ionic liquid, 초임계 유체 사용

단백질 공학 rational design, directed evolution을 통한 단백질 안정성 연구

표 1. 일반적인 단백질 안정화 방법

안정화 전략 내용

경험적 설계 구조-기능간의 연관성 규명가능 단백질 구조에 대한 정보 필요

(rational design) 다른 단백질에 적용 가능 active site 등과 같은 특정 부분에 국한

(일반적 룰 제시 가능) 활성 감소에 대한 예측 어려움

경험적 설계로 예측하지 못하는 다양한 향상된 안정성, 기능에 대한 일부 해석이 방향적 진화기술

부분에 대한 안정화 가능 불가능

(directed evolution)

높은 효율성 정확하고 빠른 스크리닝 기술 필요

노동 집약적 접근 방법

표 2. 경험적 설계와 방향적 진화기술의 장단점

장점 단점

반복함으로써 최종적으로 안정성이 향상된 단백 질을 얻어내는 방법이다.

이 두 가지 방법에 의한 대표적인 안정화 사례 는 다음과 같다.

1) 경험적 설계에 의한 단백질 안정성 향상 사례：

로타머 라이브러리(rotamer library)를 이용한 초호 열 단백질 변이주 제작

Streptococcal protein Gbeta1 domain(G β1)의 안정성을 증가시키기 위해 대상 단백질의 4개 잔 기를 선정하여 주변 잔기는 고정시킨 상태에서 4 개의 잔기가 가질 수 있는 모든 변이주들의 구조를 side-chain rotamer 라이브러리를 이용하여 예측하 였다. 즉, 조합 최적화 알고리즘(combinatorial optimization algorithm)을 이용하여 야생종보다 T

값이 20℃ 이상 높고 원래 야생종의 binding affinity를 유지하는 변이주를 제작하였다.

2) 방향적 진화기술에 의한 단백질 안정성 향상 사례：

방향적 진화기술에 의한 안정한 변이주 개발과 3차 원 구조 분석을 통한 변이주의 안정성 원인 분석

Bacillus subtilis 유래의 lipase를 error-prone PCR을 이용하여 야생종(wild type)보다 열안정 성이 300배 증가하고 온도에서 활성을 유지하는 우수한 변이주를 제작하였다. 주목할 만한 것은 최종 변이주가 야생종에

서 단 3개의 아미노산 잔기만이 치환되었으며 바뀐 잔기의 3차구조 특 성을 분석함으로써 방향 적 진화기술에 있어서 rational approach의 가 능성을 보여주고 있다.

위의 사례연구에서 볼 수 있듯이 경험적 설계와 방향적 진화기술을 이용한 각각의 단백질 안정화 전략은 매우 성공적이며 고무적이다. 하지만 이들 두 가지 방법 모두 장단점을 지니고 있으며 최근 에는 이러한 서로의 단점을 보완하고 장점을 극대 화하기 위해 두 가지 방법을 조합하는 노력이 이 루어지고 있다. 이러한 성공 사례에도 불구하고 대부분의 경우, 여전히 단백질 공학을 이용한 안 정화 전략은 경험과 행운에 의존해야 하는 어려움 이 남아 있다.

새로운 접근 : 분자 모델링 설계를 통한 단백질 안정화

경험적 설계가 단백질의 3차원 구조-안정성에 대한 이해를 바탕으로 하지만 변화시킬 잔기에 대 한 선정은 아직까지 경험적이고 대상 단백질에 대 한 기존 실험 결과에 많은 부분을 의존하고 있다.

따라서 새로운 단백질을 대상으로 하는 경우 많은 경험과 데이터가 축척되어야 하는 어려움이 있다.

또한 방향적 진화기술도 상당히 유용한 방법이지 만 실험 결과가 행운에 의존하며 유용한 라이브러 리 생성, 빠르고 정확한 스크리닝 기술개발 등의 문제점이 여전히 존재한다. 단백질 공학을 이용한 단백질 안정화 전략이 가지는 이러한 한계를 극복 할 수 있는 방법으로, [그림 2]에서와 같이 분자 모델링을 이용하여 안정한 단백질을 설계하는 새

단백질 3차원 구조를 고려한, 구조-안정성 관계 규명,

Rational design Directed evolution Molecular modeling design

random mutagenesis 기법을, 이용한 안정한 변이주 생성,

분자 모델링을 이용한 단백질, 안정화 인자 분석·예측,

그림 1. 단백질 공학을 이용한 단백질 안정화 연구 추세.

로운 방법이 연구되고 있다.

분자 모델링을 이용한 단백질의 설계는 단백질 안정성에 영향을 미치는 중요한 구조적 인자를 분 석하는 것에서부터 출발한다. 단백질의 접혀진 구 조는 소수성 결합(hydrophobic interaction), 정전 기적 인력(electrostatic interaction), 구조 엔트로 피(conformational entropy), 반데르발스 인력 (van der Waals interaction) 등과 같은 다양한 힘들에 의해서 유지된다. 이러한 힘들은 각각 단 백질의 3차원 구조를 안정화하거나 불안정화하는 역할을 하지만 서로 상쇄되어 단백질은 최종적으 로 불과 5~20kcal/mole의 접힘 에너지( ∆G

) 에 의해 안정한 구조를 유지한다. 따라서 분자 모 델링을 이용하여 야생종보다 안정성이 향상된 변 이주를 설계할 경우, 안정성에 영향을 주는 인자 들을 분석하여 야생종보다 더 낮은 접힘 에너지 ( ∆∆G

= ∆G

- ∆G

<0)를 가지는 변이 주를 찾아야 한다. 즉, 접힌 상태(folded state)에 서 야생종보다 안정하거나 펼쳐진 상태(unfolded state)에서 야생종보다 더 불안정하거나 또는 두 가지 모두를 만족시킬 경우, 변이주는 야생종보다 안정성이 향상된 단백질이다. 이와 같이 분자 모 델링을 이용하여 단백질 안정성에 영향을 미치는 구조 인자를 분석하고 특정 인자를 향상시킴으로 써 단순 실험에 의한 시행착오를 극복할 수 있다.

사례연구

본 고에서는 분자 모델링에 의한 다양한 안정화 전략 중, 단백질 안정성과 관련된 구조적 인자를 분석하는 방법과 특정 인자의 향상을 통한 실제적 인 단백질 안정화 사례를 소개하고자 한다.

1) 구조기반의 패턴 분석을 통한 열안정성 전략 수립

단백질 안정성과 관련된 인자를 분석하기 위하 여 호열성 단백질(thermophilic protein)과 일반 단백질(mesophilic protein)의 구조인자를 비교분 석하는 비교연구(comparative study)를 수행하 여 호열성 단백질이 일반 단백질에 비해 특징적으 로 가지는 구조인자를 분석하였다.

단백질 안정성에 영향을 주는 구조인자를 찾기 위해 호열성 단백질(thermophilic protein)과 일 반 단백질(mesophilic protein)의 20쌍, 총 40개의 단백질의 구조인자를 통계적 방법을 이용하여 비 교분석할 수 있다. 지금까지의 비교분석은 단순히 아미노산 잔기의 일차원 서열이나 2차구조 등을 비교분석한 것이었으며 이러한 방법은 아미노산 의 주변 상황을 고려하지 못하는 단점이 있어 새 로운 단백질 설계에 한계를 갖고 있다. 따라서 단 백질 3차원 구조를 기반으로 하여 아미노산 잔기 와 주변 잔기와의 관계를 반영하는 구조인덱스 (structure index)를 도입함으로써 좀더 체계적이

야생 단백질, (wild type)

활성(Activity), 예측,

실험으로 검증,

안정한, 단백질, (stable, protein) 안정화 요인,

변이주와 야생주 비교분석,

안정화 요인 분석, 변이주 구조 예측, 열역학적 분석, 변이주, 제작 및 평가,

Hydrophobic interaction Electrostatic interaction VDW interaction Secondary structure...

Homology modelling Molecular mechanics Molecular dynamics ...

그림 2. 분자모델링에 의한 단백질 안정화 전략.

고 실제적으로 구조인자를 분석하였다. 이러한 비 교 연구를 통해 아미노산의 선호도, salt bridges 결합, flexibility, 2차구조 그리고 충전정도 (packing)와 같은 인자들의 구조적 패턴이 단백 질 안정성과 관련되어 있음을 밝혔다. 이러한 구 조적 분석을 통해서 salt bridge의 도입, 충전정도 향상 등의 효과를 열역학적으로 분석하여 실제적 인 경험적 설계를 수행할 수 있음을 제시하였다.

2) 분자 모델링 설계를 이용한 lipase A의 열안정 성 향상

lipase A는 산업적으로 유용하지만 열안정성이 낮은 효소이다. 분자 모델링을 통해 lipase A의 구 조인자를 분석하여 열안정성을 향상시킬 수 있다.

단백질 열안정성에 영향을 미치는 다양한 구조인 자 중에서 충전정도를 증가시키는 전략(packing enhancement)으로 lipase A의 열안정성을 증가 시킬 수 있다. lipase A의 잔기의 충전정도를 분석 하여 특정 잔기를 선정하고 분자 모델링을 이용하 여 변이주 예측 및 변이주 안정성을 분석한 뒤 선 정된 변이주를 실험을 통해 검증하여 안정한 단백 질을 설계할 수 있다. lipase A의 내부충전정도를 분석한 결과, 단백질 내부에 충전이 향상될 가능 성이 있는 잔기를 발견하였다. 비교적 단백질 내 부에 존재함에도 불구하고 크기가 작고 충전정도 가 낮은 잔기를 선정하여 크기가 크고 충전정도를 높일 수 있는 아미노산으로 치환한다. lipase A 분

석 결과, 내부에 있으면서도 충전도가 낮은 알라 닌(alanine) 4개(38번, 75번, 105번, 146번)와 글 라이신(glycine) 2개(80번, 172번) 총 6개의 잔기 를 대상 잔기로 선정하였다.

이들 잔기를 분자 모델링을 통해 각각 발린과 알라닌으로 치환한 후 충전정도가 변이주들이 야 생종보다 증가함을 확인하였고 변이주들의 solvation energy가 더 낮아 열역학적으로도 안정 함을 확인하였다. 이러한 분자 모델링을 통한 예 측을 실제적 실험을 통해 확인한 결과, 3개의 변이 주(G80A, A105V, G172V)가 야생종보다 열안 정성이 높게 나타났다. 분석되어진 결과를 토대로, 한 개의 잔기가 치환된 변이주뿐만 아니라 높은 안정성을 보이는 변이주의 잔기를 동시에 치환해 줌으로써 보다 높은 단백질 열안정성을 기대할 수 있다. 이상과 같은 분자 모델링을 이용한 단백질 안정화 전략은 lipase A 뿐만 아니라 다른 단백질 에도 적용 가능하다.

3) 분자 모델링을 통한 xylanase의 최적 pH 변화 연구

단백질 열안정성 뿐만 아니라 단백질의 최적 pH 변화도 분자 모델링을 통해 예측할 수 있다.

Bacillus 유래의 xylanase는 pulp bleaching에 매 우 유용하게 쓰이는 효소이다. 그러나 야생종이 50℃와 pH5.5에서 최적 반응을 보이는 반면, pulp bleaching 공정은 70℃ 이상의 고온과 pH10 이상

구조변화 예측.

Wild type 0 1.6

A38V -0.7433 107.5

A75V -0.8076 47.5

A105V -0.8869 26.5

A146V -0.8736 48.5

G80A -0.5368 113.75

G172A -0.5553 102.5

표 3. 열역학적 분석 : ∆∆ G

<0

Mutant

∆∆

의 높은 알칼리 조건에서 반응이 이루어진다. 따 라서 xylanase를 산업적으로 유용한 효소로 사용 하기 위해서는 효소의 열안정성 뿐만 아니라 높은 알칼리 방향으로 효소 최적 pH 변화도 필요하다.

분자 모델링을 이용한 단백질의 최적 pH 변화 예 측 과정은 [그림 4]와 같다. Bacillus circulans xylanase(BCX)를 모델단백질로 선정하고, Family 11/G에 속하고 최적 pH가 BCX와 같거 나 BCX보다 높은 6개의 xylanase와 모델단백질의 3차구조를 구조 얼라인먼트(structural alignment) 를 통하여 비교하였다. 구조 얼라인먼트와 Dayhoff’s odds matrix를 이용하여 효소의 활성 에 중요한 역할을 하지 않지만 pH 변화에 중요한 것으로 여겨지는 비보전잔기(non-conserved residue) 10개를 선정하였다. 이렇게 선택된 잔기 를 다른 19개의 아미노산으로 치환함으로써 발생 하는 정전기 포텐셜(electrostatic potential) 변화 를 계산하여 pKa의 변화값을 구할 수 있다. 효소 의 최적 pH의 변화는 촉매역할을 하는 아미노산 들(catalytic residues)의 pKa 변화를 계산함으로

얻을 수 있다. 이렇게 계산되어진 모델단백질의 pH 변화가 높은 방향 즉, ∆pH가 양인 변이주를 선정하여 실험을 통해서 실제 최적 pH 변화 유무 를 확인하면 최적 pH가 변화된 새로운 단백질을 얻는다[표 4].

위와 같이 분자 모델링을 이용하여 대상 단백질 의 촉매 역할을 하는 잔기의 pKa 변화를 분석함 으로써 많은 시행착오를 줄여 대상 단백질의 pH 를 높은 방향 또는 낮은 방향으로 원하는 방향으 로 바꿀 수 있다.

향후 단백질 안정화 전략

방향적 진화기술과 경험적 설계는 지금까지의 단백질 안정성 향상 방법 중 가장 유용한 수단이 다. 방향적 진화기술은 과거 십여 년 전부터 유용 한 단백질 안정화 전략으로 각광 받아 왔고 다른 어떤 단백질 안정화 전략보다 상당히 높은 효율성 을 보이고 있다. 그러나 대상 단백질의 성격에 따 라 정밀하고 신속한 스크리닝 시스템을 다르게 구 축해야 하고 향상된 안정성에 대한 해석이 어려운 문제점이 있으며 수립된 전략이 다른 단백질에 적 용하기 어려운 단점이 있다. 경험적 설계의 경우, 아직까지 예측된 결과와 실험 데이터 간의 불일치 가 많고 안정성이 향상된 반면 활성이 저하되는 문제점이 있다.

이러한 단점을 극복하기 위해 최근 들어 분자 모델링 설계를 이용한 다양한 안정화 전략이 제시 되고 있다. 컴퓨터 기술의 비약적인 발전, 분자 모 델링 소프트웨어의 정확성 향상 그리고 새로운 단

S84V 0.4337 +0.5 95%

A115S 1.1563 0 95%

A115I 0.6249 +0.5 45%

A115T 0.2209 +0.5 83%

A115Y 0.4507 +0.5 53%

A115W 0.6578 +0.5 53%

표 4. 분자 모델링과 실험에 의한 최적 pH 변화 비교

Mutant ∆pH ∆pH Relative optimum optimum activity

(cal.) (exp.)

No

Yes

모델단백질, 구조 alignment pKa 변화 예측, 변이주제작, 최적 pH, 변화된 변이주, 그림 4. 분자 모델링에 의한 단백질의 최적 pH 변화 예측.

생물체들은 성장과정 중 세포 성장의 부산물로 부터 유래하거나 외부 환경으로부터 유래한 다양 한 형태의 스트레스에 끊임없이 노출되므로 이에 대응하기 위한 다양한 적응 기작 또한 발달되어 왔다. 스트레스 환경에서 세포들의 적응 반응은, 일시적인 세포주기(cell cycle)의 정지, 단백질과 RNA 등 세포 구성 물질의 합성 감소, 새로운 유 전자의 발현 조절을 통한 세포 대사 조절 등의 다 양한 형태로 나타난다. 외래 단백질의 인위적인 과량 생산 또한 세포에 스트레스를 유발하는 인자 로 작용할 수 있는데, 이때 스트레스에 의해 유도 된 생체 반응은 단백질 생산성에 영향을 미칠 수 있다. 단백질 과량 생산 시 유발되는 스트레스는 크게 두 가지로 구분할 수 있는데, 첫 번째는 과량 생성된 외부 단백질이 세포 대사를 방해함으로써 발생할 수 있는 생리적 스트레스이고, 두 번째는 대량 생산을 위한 세포 배양 조건으로부터 유발 되는 온도, pH, 삼투압 등의 외부적 환경 스트레 스이다. 스트레스 상황에서의 세포내 적응 기작에 대해서는 유전자 발현 및 분자 수준에서 많은 연구 가 되어왔지만, 스트레스 반응의 이해와 적용을 통 해 단백질 생산성을 증가시키기 위한 연구는 아직

미약한 수준이다. 따라서 이 글에서는 효모의 모델 시스템으로 많은 연구가 진행된 Sacchromyces cerevisiae를 중심으로 단백질 과량 생산 시 유발 될 수 있는 스트레스 반응을 살펴 봄으로써 단백 질 생산성과의 연관성을 생각해보는 기회로 삼고 자 한다.

스트레스와 molecular chaperones 1) Molecular chaperone의 기능

단백질 생산성과 관련하여 중요한 문제 중 하나 는 생성된 단백질의 활성상태로 folding인데, 이때 중요한 역할을 하는 것이 molecular chaperone이 다. 단백질의 안정성과 기능을 결정짓는 단백질의 3차 구조 형성, 즉 native 상태로의 folding에는 아 미노산 잔기들 간의 비공유 결합이 주요한 역할을 하는데, polypeptide chain중 hydrophobic한 부분 은 주로 단백질의 내부에 감춰진 형태로 3차 구조 가 형성된다. 이 hydrophobic한 부분들은 서로 결 합하려는 경향을 가지고 있어서 ribosome으로부 터 polypeptide chain이 새로이 생성되는 과정에 서 hydrophobic한 부분사이의 비 특이적인 결합 을 막지 않으면 단백질의 misfolding이나 백질의 3차구조 규명 등으로 단백질 안정성에 대

한 많은 양의 데이터가 축척되고 있다. 단백질체 학(proteomics)과 생물정보학(bioinformatics) 기 술의 발전에 의해, 분자 모델링 설계는 정확성이 증가되고 있는 추세이며 수립된 전략이 대상 단백 질 뿐만 아니라 새로운 단백질에도 적용이 가능하

다는 장점을 가지고 있다. 따라서 분자 모델링 설 계를 통한 단백질 안정화 전략을 이용하여 궁극적 으로 실험에 의한 시행 착오를 최소화하며 단백질 의 구조-안정성 관계를 규명하여 일반적 안정화 전략을 수립할 수 있을 것이다.

한 지 숙

서울대학교 화학생물공학부, [email protected]