[지상강좌] 전기적 방식의 압타머(aptamer) 센서

서론

현대 의학 및 생물학의 눈부신 발전으로, 인간의 유전자에 대한 정보가 알려지고 이에 따라, 질 병과 관계 있는 DNA, RNA, 단백질 및 유기 저분자 등의 존 재가 속속 드러나고 있다. 이와 같은 지식은 인류의 건강 및 영속에 큰 영향을 미칠 수 있는데, 암과 같은 중증질환인 경우에도 조기에 발 견하면 치료 가능성과 생존율을 크게 높일 수 있을 뿐 아니라, 사회적으로는 이에 관련된 막대한 의료비 용의 절감이 가능하기 때문이다. 질병을 조기에 진단 하기 위해서는 질병의 초기 단계에서 발생하는 극미 량의 단백질, DNA, 또는 유기 저분자 등을 환자의 혈액 또는 체액으로부터 민감하게 검출할 수 있는 기술이 필요해진다. 최근 나노기술을 이용하여 이와 같은 질병 특이 인자들을 고감도로 검출할 수 있는

센서를 개발하려는 연구가 많이 진행되고 있다.

센서의 정의를 측정하고자 하는 물리량, 또는 화 학량을 선택적으로 포착하여 출력하는 장치라고 할 때, 이 정보를 측정 가능한 신호로 변환해주는 장치 인 트랜스듀서의 종류에 따라 다양한 방식의 센서가 존재한다. 트랜스듀서는 신호 변환 방식에 따라 크 게 광학적 방식, 전기적 방식, 질량 검출, 또는 열 검 출방식 등으로 나뉠 수 있다. 본 글에서는 그 중에 서도 휴대용 진단센서 및 현장진단장치에 이용될 수 있는 전기적 방식의 나노센서에 중점을 두어 최근까 지의 연구동향을 알아보도록 하겠다.

분자 인식물질로서의 압타머

[그림 1]은 바이오센서의 모식도를 보여준다. 그 림에서 보는 것과 같이, 바이오센서는 시료를 트랜 스듀서 표면에 전달하는 시료 전달부와, 센서에 있 어 가장 중요한 요소 중의 하나인 선택성을 부여해 이 정 오

한국화학연구원 융합바이오기술연구센터, [email protected]

그림 1. 바이오센서의 모식도.

전기적 방식의 압타머(aptamer) 센서

줄 수 있는 분자인식물질이 고정화된 트랜스듀서, 그 밖의 신호처리 및 출력 유닛으로 구성되어 있다.

최근까지는, 단백질을 검출하는 바이오센서에서 선 택성을 부여하기 위해 대부분의 경우 항원-항체 반 응이 이용되었다. 항원-항체 반응은 선택성이 매우 우수한 편이지만 센서로 적용될 경우, 단백질 기반 인 항체의 안정성 문제로 센서의 유통기한이나 보관 조건 등에 제약을 받을 수 있다. 1980년대에는 바이 러스나 세포의 특정 단백질에 결합하고 제어할 수 있는 기능적인 핵산의 존재가 최초로 보고되었다.

1990년은 이들 기능성 핵산에 있어 “약진의 해”라고 할 수 있다. 우선, 바이러스의 특정 단백질에 결합하여 활성을 저해하는 기능성 RNA 분자(TAR aptamer) 가 발견되었고, Tuerk와 Gold에 의해 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라고 명명된 이들 기능성 핵산분자의 선발과정이 확립되었다. 이들 기능성 핵산들은 라틴 어의 ‘Aptus(fit)’를 따서 압타머라고 명명되게 된 다. 압타머를 찾아내는 SELEX 공정에 대해 좀 더 자세히 살펴보기로 하자. SELEX 공정은 무작위 서 열을 가진, 방대한 핵산의 라이브러리에서 선택과 증폭의 과정을 반복하는 선발

과정이다. [그림 2]는 SELEX 공정의 모식도를 보여준다. 우 선 원하는 압타머를 찾아내기 위해 초기 라이브러리에는 대략 10

개의 다른 서열을 가진 핵 산들이 이용된다. 이들 무작위 핵산 라이브러리를 표적 분자와 반응시킨 후, 타겟분자와 결합 하는 핵산서열은 여과법 또는 affinity chromatography를 이 용하여 분리하고, DNA의 경우 에는 PCR을, RNA인 경우에 는 RT-PCR을 이용하여 증폭

시킨다. 이렇게 만들어진 두 번째 핵산군은 표적 분 자에 대해서 좀 더 높은 친화력을 보이게 된다. 위 와 같은 선택 및 증폭 과정이 계속해서 되풀이 되면 서 표적분자에 대해 높은 반응성을 보이는 핵산이 지수적으로 증가하게 된다. 일반적으로 8회에서 15 회의 사이클을 거친 후, 표적 분자에 높은 친화력을 갖는 압타머의 서열이 드러나게 된다. 일단 서열이 알려지면, 압타머는 화학적인 합성법을 통해 쉽게 대량으로 생산될 수 있다. 압타머는 DNA 기반, RNA 기반의 압타머가 모두 가능한데, 일반적으로 OH기를 가져서 좀 더 높은 자유도를 갖는 RNA 기 반의 압타머를 찾아내기가 용이한 반면, 주변 환경 에 상대적으로 취약한(RNAase에 의해 쉽게 파괴된 다) RNA 기반의 압타머의 안정성이 DNA에 비해 떨어지는 경향성을 보인다. 재미있는 점은, 주어진 표적 분자에 대해 DNA 기반의 압타머와 RNA 기 반의 압타머를 모두 만들 수 있지만 이들의 서열은 매우 다르고, 3차원 구조 또한 크게 다르다. 예를 들 어, ATP에 결합하는 RNA 압타머를 DNA로 만들 거나 그 반대의 경우, 압타머는 ATP를 전혀 인식 하지 못한다.

그림 2. SELEX 공정의 모식도.

높은 특이성을 가지고 있다. 항원-항체 반응의 경우, 항원은 항체의 ‘포켓’에 들어맞는 크기와 특성을 가 지도록 되어 있어(열쇠-자물쇠 원리로 설명하기도 함) 크기나 특성이 유사한 동종 단백질은 항체를 이 용하여 구분하기가 쉽지 않다. 그러나 압타머의 경 우에는 단지 메틸기 하나만 다른 카페인과 티오필린 을 구분할 수 있을 만큼 그 특이성이 우수하다.

여기에, 앞에서 잠시 언급한 바와 같이 일단 서열 이 알려진 압타머는 화학적으로 대량 합성이 가능하 므로 경제성이 우수하고 균일한 활성을 가질 수 있 으며, 생체에서 배양을 통해 얻어지는 항체와 달리 합성으로 생산되므로 독성물질에 대한 압타머도 비 교적 쉽게 만들어 낼 수 있다. 뿐만 아니라, 변형 과 정에서 활성을 잃을 가능성이 있는 항체의 기능화와 는 달리, 압타머는 쉽게 기능화가 가능하여 고정화 및 각종 표지물질의 부착이 더욱 간단하다. 압타머의 가장 큰 장점 중에 하나로 무엇보다도 그 안정성을 꼽을 수 있을 것이다. 단백질 기반으로, 저온보관을 요하며 유통기한이 짧을 수 밖에 없는 항체들과는 달리 핵산 기반의 압타머는 상대적으로 매우 안정하 고 온도변화나 주변의 이온농도에 따라 가역적으로 변환이 가능한 3차원 구조를 갖기 때문에 재사용 가 능한 센서를 만들 수 있다. 물론, 특히 RNA 기반의 압타머의 경우 nuclease에 의해 쉽게 파괴될 수 있 지만, 최근에는 거울상체(Spiegelmer)를 이용하거나

이와 같이 우수한 표적 친화성을 보이는 압타머는 치료제, 분리정제 및 센서 등에 널리 이용될 수 있 다. 압타머의 표적은 단백질이나 펩타이드 뿐 아니 라, 세포 표면, 유기 저분자 등 거의 제한이 없다고 보아도 무방하다. 압타머가 최초로 센서에 이용된 것은 1996년으로, 형광 표지된 압타머를 이용하여 human-neutrophil elastase를 광학적으로 검출하였 다. 그 이후로 다양한 트랜스듀서에 압타머를 결합 시켜 안정적이고 감도가 뛰어난 센서를 개발하였다.

Quartz crystal microbalance(QCM), surface plasmon resonance(SPR), evanescent-wave induced fluore- scence 등의 광학적 방식의 센서뿐만 아니라, microcantilever, 전기화학센서 및 탄소 나노튜브를 이용한 전계효과 트랜지스터 센서 등도 보고된 바 있다.

앞에서 언급한 바와 같이, 이 글에서는 전기화학 센서 또는 나노구조 전계효과 트랜지스터에서 압타 머 센서의 장점에 대해 알아보도록 하겠다.

전기적 방식의 압타머 센서 1) 전기화학 압타머 센서

전기화학센서는 표적물질 또는 표적물질에 의해 발생된 물질로부터 전극으로의 전자 수송에 의해 신 호가 발생하므로 표적물질의 농도에 비례하는 전기 적 신호를 얻게 된다[그림 3]. 단순한 항원-항체 반

그림 3. (A) 샌드위치 어세이를 이용한 센서의 모식도, (B) 압타머를 이용한 signal-on 센서.

(A) (B)

전기적 방식의 압타머(aptamer) 센서

응을 이용하기 보다는 전기화학적으로 표지된 2차 항체를 써서(일반적으로 ferrocene 또는 methylene blue 등이 사용된다), 샌드위치 어세이를 이용하여 전기화학적으로 신호를 검출하게 된다. 그러나, 이와 같은 표지법은 실시간 검출이 어렵고, 표지 과정을 필요로 하는 단점이 있다. 항원-항체 기반의 샌드위 치 어세이를 사용하는 대신, 표지된 압타머를 사용 하면 이와 같은 단점을 극복할 수 있다. Xiao 등은 methylene blue(이하 MB로 칭함)로 표지된 트롬 빈 압타머를 전극에 고정화하여, 압타머가 트롬빈과 결합할 때, 전극 표면에 위치하던 MB가 위로 들어 올려지면서 전기화학적인 신호가 줄어듬을 관찰하였 다. 이들은 이와 같은 개념을 더욱 발전시켜, 이번에 는 압타머가 표적물질과 반응했을 때 신호의 증가가 관측될 수 있는 “signal on architecture”를 개발하였 다. 기존의 시스템과는 달리, 이번에는 전극에 고정 화된, MB 표지된 트롬빈 압타머의 아래 쪽이 이중 겹 DNA(double-stranded DNA, 이하 dsDNA)로 구성되도록 설계한다. 이렇게 되면, dsDNA는 단일 겹 DNA(single-stranded DNA, 이하 ssDNA)에 비해 훨씬 긴 persistence length를 갖기 때문에, 쉽 게 구부려 질 수 없고, 따라서 전기화학적 신호를 줄 수 있는 MB는 전극표면에서 멀어져 있다.

Persistence length란 폴리머의 경직도를 나타내는 기준으로서 폴리머의 방향이 바뀌지 않는 최대 길이 를 의미하고, dsDNA의 경우 50nm, 약 150bp에 해 당하는 반면, ssDNA의 경우 겨우 1.5~3nm에 지나 지 않는다. 이렇게 구성된 센서가 타겟 트롬빈과 반 응하면, 트롬빈 압타머가 트롬빈과 결합하면서 MB 가 결합된 DNA 가닥은 전극 표면으로 내려와 전기 적인 신호를 주게 된다. 기존에 단순히 MB가 고정 화된 트롬빈 압타머만을 이용했을 경우 260nM 트 롬빈에서 40%의 신호변화를 관측한 반면, 위와 같 은 “signal-on” 구조에서는 300% 이상의 신호 변화 가 관측되었다. 센서의 검출 한계는 약 3nM로서 이

는 표지방식의 센서에 맞는 우수한 성능을 보여준다.

위의 예에서는, “signal-on” 센서를 개발하기 위해 정지상태에서 MB를 전극으로부터 떼어놓을 수 있 는 “holding” dsDNA가 사용되었지만, 압타머가 가 진 독특한 3차원 구조로 말미암아, 이와 같은 조작 이 필요 없이, signal-on 센서를 만들 수 있다는 연 구결과가 동일 그룹에 의해 발표되었다. Baker 등은 MB 표지된 압타머를 이용하여 체액 등에서 코카인 을 성공적으로 검출하였다. 이 실험에 사용된 압타 머는 Stojanovic에 의해 고안된 것으로, 표적인 코카 인이 없을 경우에는 3개의 가지 중 하나만 dsDNA 형태를 갖는다. 이 때, 타겟 물질이 결합하게 되면 3 방향 접합 구조를 갖는 것으로 생각되고, 따라서 표 지된 MB가 전극 가까이 내려오면서 신호를 주게 된다. 이와 같은 방법을 사용해서 혈액이나 체액에 서 직접 500M의 코카인을 검출할 수 있음을 증명하 였다. 코카인과 압타머의 결합은 가역적이어서, 센서 는 간단하게 버퍼 용액으로 씻어내어 재사용이 가능 하였다.

코카인과 같은 유기 저분자뿐만 아니라, 단백질을 타겟으로 하는 경우에도 압타머 센서의 재사용은 가 능하다. Lai 등은 혈청에서 직접 신생혈관에 작용하 므로 종양표지자로 이용되기도 하는 PDGF (platelet-derived growth factor)를 압타머를 이용 하여 검출하였다. 코카인 압타머의 경우와 마찬가지 로 PDGF와 압타머가 결합하면서 MB와 전극사이 의 거리가 줄어들어 전기적인 신호가 증가하게 된다.

이 경우에, 센서를 약 4분 가량 10% sodium dodecyl sulfate(SDS)에 처리하여 재사용이 가능함을 보였다.

이 장에서는 기능화된 압타머를 이용한 전기화학

센서의 몇 가지 예를 보였다. 이와 같이 기능화된

압타머 센서는 센서의 감도를 크게 개선시킬 수 있

을 뿐만 아니라, 앞에서도 강조한 바와 같이 재사용

이 가능한 장점도 보유하고 있다.

2001년에 최초로 하버드대학의 C. Lieber 그룹에 의해 실리콘 나노와이어 등의 나노구조체 트랜지스 터를 이용한 고감도 센서가 시연된 이후, 많은 연구 그룹들에 의해 탄소 나노튜브 또는 나노와이어 기반 의 바이오센서들이 개발되었다. 이들은 나노튜브 또 는 나노와이어 소자를 이용하여 단일 바이러스, 단 백질, 유기 저분자에 이르기까지 다양한 표적 물질 들을 고감도로 검출할 수 있음을 보였다.

전계효과 트랜지스터(field effect transistor, 이하 FET) 센서는 분자인식물질과 타겟 물질의 결합에 서 발생하는 표면 전위의 변화를 측정한다. [그림 4]는 그 중에서도 탄소 나노튜브 기반 FET(이하 CNT-FET로 칭함)의 작동원리를 보여준다. FET 센서는 타겟 분자가 센서 표면에 고정화된 인식분자 와 결합했을 때 가지고 있는 전하를 “느끼게” 된다.

이와 같은 효과는 보통 “electrostatic gating effect”

또는 “chemical gating effect”라고 불리는데, 이것 은 표적분자가 별도의 게이트 전극과 같은 작용을 하기 때문이다. 탄소 나노튜브는 공기 중에서 일반 적으로 p형 반도체로 작동한다. 따라서 양의 게이트 전압을 걸어주게 되면 전기전도도의 감소가 일어나 고, 반대로 음의 게이트 전압을 걸어주게 되면 전기 전도도의 증가가 나타나게 된다. 그러므로, 양전하를 가진 분자가 탄소 나노튜브와 결합할 경우 전기 전 도도의 감소가, 반대로 음의 전하를 가진 표적 분자 가 탄소 나노튜브와 결합할 경우 전기 전도도의 증

가가 관측되는 것이다.

FET를 센서에 응용하려는 아이디어는 이미 1978 년에 Shenk 등에 의해 제안되었다. 그러나 FET가 항원-항체 반응에 기인한 표면 분극 현상을 검출할 수 있을 것이라는 예상은 보기 좋게 빗나갔는데, 이 것은 용액 속에 항상 존재하는 작은 이온들에 의한 차폐 효과 때문이다. [그림 5]에 보이는 바와 같이 전하를 띠고 있는 표면이 용액 속에 위치하게 되면 표면의 전하는 용액 속에 분포된 반대전하에 의해 상쇄되게 된다. 이와 같은 정전위의 변화가 일어나 는 영역을 전기 이중층(electrical double layer)이라 고 부르며, 전기 이중층의 길이는 드바이 길이 (Debye screening length), 즉 이동하는 하전 입자 들이 정전장을 차폐할 수 있는 거리로 나타낸다. 전 해질 속에서 드바이 길이는 아래와 같이 정의될 수 있다.

(1)

여기서 Bjerrum length l

는

=0.7nm(in standard pressure

and temperature) (2) 그림 4. 탄소 나노튜브 전계효과 트랜지스터 센서의 센싱

원리.

그림 5. 전기 이중층에서의 전하분포.

전기적 방식의 압타머(aptamer) 센서

로, k

는 볼쯔만 상수, k는, 1/4 πε

, ρ

는 이온 농도, 그리고 z

값은 다양한 이온의 원자가를 나타낸다.

따라서, 드바이 길이는 이온 농도의 제곱근에 반 비례한다. 순수한 물의 경우 드바이 길이는 약 1마 이크로미터이고 1M의 소금물에서는 겨우 0.3nm에 불과하다. 센서의 입장에서 본다면, 드바이 길이 바 깥 쪽에서 일어나는 어떤 반응도 FET 방식의 센서 를 써서는 검출될 수 없다. 따라서, FET 방식 센서 의 최대의 단점은, 높은 이온 농도에서는 작동할 수 없는 센서의 근본적인 문제점 때문에 혈액이나 체액 과 같은 생리용액에서(생리용액의 이온농도는 약 150mM로 이 때 드바이 길이는 약 1nm) 바로 사 용될 수 없고, 시료의 희석이나 정제가 필요하게 된 다는 것이다. 최근 발표된 나노센서의 연구 결과들 을 보아도 모두 반응이 초순수를 사용하거나, µM 이하의 아주 낮은 농도의 버퍼에서 측정이 이루어짐 을 볼 수 있다. 최근까지는 이들 FET 센서에서도 항원-항체 반응이 주로 이용되어 왔

다. 그러나, 일반적으로 항체의 크기 는 약 10~15nm에 달하므로, 항원- 항체 반응을 FET 센서로 측정할 수 있기 위해서는 항체의 크기보다 큰 드바이 길이를 갖는 용액 속에서만 측정이 가능하였다. 따라서, 항체에 비해 상대적으로 크기가 작은 인식 물질을 사용하게 되면 보다 넓은 이 온 농도 영역에서 FET 센서의 작동 이 가능하게 된다. 이와 같은 맥락에 서 볼 때, 압타머는 특히 FET 방식 센서에 최적의 분자인식 물질이다.

[그림 6]은 압타머와 항체의 크기 비교를 보여준다. 일반적으로 압타머 는 10~60bp 정도인 짧은 핵산 가닥 이므로 타겟 분자와 압타머의 결합 이 일어나는 지역은 센서 표면에서

2~3nm 내외로, 항원-항체 반응에 비해 비교적 높 은 농도의 이온성 용액에서의 검출도 가능하게 한다.

압타머를 분자인식물질로 이용한 탄소 나노튜브 센서는 한국화학연구원에서 2005년에 최초로 시연하 였다[그림 7]. 모델 시스템으로는 가장 많이 알려진 트롬빈 및 트롬빈 압타머가 사용되었다. 기판에 직

그림 6. 항체와 압타머의 크기 비교.

그림 7. 압타머가 고정화된 탄소 나노튜브 트랜지스터 센서.

(A)

(B) (C)

표면, 즉 센서 표면에 인식물질인 트롬빈을 고정화 하기 위하여 CDI-Tween20을 링커 물질로 사용하 였다. 트롬빈 압타머가 고정화된 CNT-FET에 트롬 빈을 반응시키면 즉시 전기 전도도의 감소가 관측된 다. 이것은 핵산 기반인 압타머의 인산기가 가진 음 전하를 트롬빈이 상쇄하므로 생기는 효과로 생각될 수 있다. 또한 트롬빈 압타머로 기능화된 CNT- FET 센서는 트롬빈의 동종 단백질인 엘라스타제에 는 거의 반응을 보이지 않아 선택성도 우수함을 볼 수 있었다. 거기에, 안정성 및 가역성이 뛰어난 압타 머의 장점을 살려, 센서의 재사용도 가능함을 보였 다. 사용된 센서는 6M의 guanidine hydrochloride 용액에 담가 결합된 트롬빈을 제거하였다. 이와 같 이 트롬빈이 제거된 센서는 초기 상태로 완전히 회 복되어 재사용이 가능하였으며 5회 이상 측정하여도 센서의 성능에 이상이 없음을 확인하였다. 센서의 검출한계는 약 10nM로 관측되었다.

CNT-FET 센서에 있어 압타머가 갖는 또 하나 의 장점인 크기의 문제는 2007년 Maehashi 등에 의 해 증명되었다. 그들은 IgE 압타머와 IgE 항체를 각 각 고정화한 CNT-FET를 제작하여 10mM phosphate buffered saline(PBS)에 용해된 타겟 IgE에 대한 반응을 관찰하였다. IgE 항체가 고정화 된 CNT-FET 센서의 경우에는 140nM의 타겟 농 도에도 별다른 반응이 관측되지 않은 반면, 압타머 가 고정화된 CNT-FET는 250pM의 타겟 농도에서 도 전기 전도도의 변화가 관측되었다. 10mM의 PBS 용액에서 드바이 길이가 약 3nm임을 고려할 때, 길이가 약 10nm인 항체와 항원의 반응은 당연 히 CNT-FET를 써서 관측될 수 없지만, 보다 짧은

결론

지금까지, 주로 전기화학센서나 FET 센서 등의 전기적 방식의 센서를 중심으로 압타머를 분자인식 물질로 이용한 센서의 장점에 대해 알아보았다. 압 타머를 분자인식물질로 이용함으로서 전기화학센서 의 경우 비표지, 실시간 센서를 개발할 수 있었고, 센서의 감도를 크게 향상시킬 수 있음이 증명되었다.

또한 위에서 여러 번 언급한 바와 같이 센서는 압타 머 구조의 가역성을 이용하여 재사용이 가능하였다.

나노크기의 FET 센서에 있어서 압타머의 장점은 더욱 두드러진다. 압타머가 갖는 고유의 뛰어난 선 택성에 기인한 센서의 선택성 향상 및 재현성 이외 에도, 항체에 비해 월등하게 작은 크기를 가지므로 항체에 비해 보다 높은 감도를 기대할 수 있다.

급속한 노령화시대의 도래로 말미암아, 질병의 발 생이나 각종 질병에 관련된 인자들을 빠르고 편리하 며 정확하게 검출할 수 있는 센서에 대한 수요가 크 게 증가하고 있다. 앞으로는 다양한 압타머를 분자 인식물질로 이용한 진단센서 등이 시장에서 두드러 진 활약을 보일 것으로 기대된다.

저자약력 이 정 오

1989 이화여자대학교 물리교육학과 학사 1991 포항공과대학교 물리학과 석사 2001 전북대학교 물리학과 박사

2003 Department of Nanoscience Delft University in the Netherland, PostDoc

현재 한국화학연구원 융합바이오기술연구센터 선임연구원