발 간 등 록 번 호

수출·입 폐기물 유해특성 시험방법 매뉴얼(IV)

2014

2 0 1 4 수 출 · 입 폐 기 물 유 해 특 성 시 험 방 법 매 뉴 얼 (IV)

NIER - GP2014 - 083

발 간 등 록 번 호

11-1480523-001954-01

9 7 8 8 9 6 5 5 8 2 4 2 7 93530

발 간 등 록 번 호

NIER-GP2014-083 11-1480523-001954-01

수출·입 폐기물 유해특성 시험방법 매뉴얼(IV)

2014

수출·입 폐기물 유해특성 시험방법 매뉴얼(IV)

수출·입 폐기물의 유해특성 시험방법 매뉴얼(IV)은 선진국 및

국제기구의 유해물질 항목 확대와 규제기준강화에 대응하고 유해

물질을 효율적으로 관리하기 위하여 EPA/UN, 한국표준규격(KS)

과 국제표준 시험방법을 토대로 작성되었으며, 폐기물 중 유해특

성시험방법이 제정되면 그에 따라야 하고 그 이전에는 본 매뉴얼

을 활용할 수 있을 것입니다.

서 문

유럽연합, 미국 등은 바젤협약의 유해특성 폐기물을 자국법의 유해폐기물로 관리하고 있으며, 폐기물의 유해특성 유무를 판정 할 수 있는 시험방법을 제정하여 운영하고 있다.

우리나라 폐기물관리법에서 유해폐기물로 분류하고 있는 유해 특성은 부식성, 감염성, 용출독성에 대해서만 관리하고 있는 실정이 다. 따라서 폐기물에 대한 유해특성 판정방법을 마련하기 위해 바젤협약의 유해특성(H-code)중 생태독성, 독성, 발암성, 자극성, 민감성, 생식독성, 변이원성, 감염성, 위해성의 시험방법(안)을 각 각 작성하였다.

그러므로, 유역환경청 및 지방환경청의 화학물질 관리업무

담당자들이 수출·입 폐기물 유해특성 시험방법 매뉴얼을 활용

하여 분석할 경우 폐기물의 생태독성, 독성, 발암성, 자극성, 민

감성, 생식독성, 변이원성, 감염성, 위해성 여부를 판정하는데 많

은 도움이 될 것이다.

목 차

1. 유해특성폐기물 판정기준 1

^가 . 국내 폐기물 유해특성 판정기준 3 ^나 . ^국내 · 외 유해특성 시험방법 비교 17

2. 유해특성 시험방법 25

가 . 자극성 시험방법 27

나 . 위험성 시험방법 35

다 . 독성 시험방법 36

라 . 발암성 시험방법 54

마 . 감염성 시험방법 58

바 . 생식독성 시험방법 59

사 . 변이원성 시험방법 77

아 . 민감성 시험방법 ( 피부과민성시험 ) 95 ^자 . ^{생태독성 시험방법} ( ^{물벼룩을 이용한}

24 시간 급성독성시험 ) 99

표 목 차

표 1. 국내 화학물질 분류표시 및 기준 4 표 2. 건강 및 환경유해성에 따른 분류의 정의 및 유해위험성

구분 6

표 3. 국내외 유해특성 시험방법 및 판정기준 비교 19 표 4. 임상증상 및 피부반응 평가표 29

표 5. 경구독성증상 평가표 39

그 림 목 차

그림1. 피부자극성 폐기물의 판정기준 흐름도 7 그림2. 눈자극성 폐기물의 판정기준 흐름도 7 그림3. 독성(고정용량법) 폐기물의 판정기준 흐름도 8 그림4. 독성(독성등급법) 폐기물의 판정기준 흐름도 8 그림5. 경피독성 폐기물의 판정기준 흐름도 9

그림6. 흡입독성 판정기준 흐름도 9

그림7. 발암성 폐기물의 판정기준 흐름도 10 그림8. 물벼룩류 생식능 판정기준 흐름도 11 그림9. 생식능 및 차세대영향 판정기준 흐름도 11 그림10. 생식 및 발생독성 스크리닝 판정기준 흐름도 12 그림11. 2세대생식독성 판정기준 흐름도 12 그림12. 복귀돌연변이 판정기준 흐름도 13 그림13. 포유류 배양세포를 이용하는 염색체이상 판정기준

흐름도 13

그림14. 골수세포 소핵시험방법을 이용한 판정기준 흐름도 14

그림15. 생체외 포유류세포 유전자 돌연변이 판정기준 흐름도 14

그림16. 피부과민성 폐기물의 판정기준 흐름도 15

그림17. 생태독성 폐기물의 판정기준 흐름도 16

그림18. 피부자극성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차 30 그림19. 눈자극성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차 34 그림20. 경구독성(고정용량법) 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차 40 그림21. 독성(독성등급법) 시험분석방법 및 판정절차 44 그림22. 경피독성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차 49 그림23. 흡입독성 시험분석방법 및 판정절차 53 그림24. 발암성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차 57 그림25. 물벼룩류 생식능 시험분석방법 및 판정절차 63 그림26. 생식능 및 차세대영향 시험분석방법 및 판정절차 67 그림27. 생식 및 발생독성 스크리닝 시험분석방법 및 판정절차 72 그림28. 2세대 생식독성 시험분석방법 및 판정절차 76 그림29. 복귀돌연변이 시험분석방법 및 판정절차 80 그림30. 포유류 배양세포를 이용하는 염색체이상 시험분석방법

및 판정절차 84

그림31. 골수세포 소핵시험방법을 이용한 시험분석방법 및

판정절차 89

그림32. 생체외 포유류세포 유전자 돌연변이 시험분석방법 및

판정절차 94

그림33. 피부과민성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차 98 그림34. 물벼룩을 이용한 24시간 급성독성 시험분석방법 및

판정절차 102

- 1 -

1. 유해특성폐기물 판정기준

가. 국내 폐기물 유해특성 판정기준

나. 국내․외 유해특성 시험방법 비교

- 3 -

1. 유해특성폐기물 판정기준

가. 국내 폐기물 유해특성 판정기준

국내 환경부, 고용노동부, 안전행정부에서는 화학물질의 유해·위험 성에 대한 규정을 일부 제정하고 있으며 환경부의 유해화학물질관리법에 서는 화학물질에 대하여 환경유해성분야와 독성시험분야로 분류하고 있 다. 또한, 환경부의 폐기물관리법에 의해 폐기물의 유해특성을 부식성, 감 염성, 용출독성을 관리하고, 유해화학물질관리법에 의해 생태독성을 관리 하고 있으며 그 외의 유해특성에 대해서는 고용노동부의 규정에 의해 관 리되고 있다. 이러한 유해특성을 확인하고 검사하기 위해서 화학물질에 대 한 유해·위험성 시험 전문연구기관(GLP; Good Laboratory Practice, 우수 실험실운영기준)을 두고 있으나 이 유해·위험성 시험은 산업화학물질에 대 한 시험방법으로 급성경구 및 급성경피 또는 급성흡입독성시험 등의 건강 영향 평가시험을 중점으로 하고 있다. 또한, 이러한 유해·위험성 시험은 전문연구기관에 국한되어 실시되고 있으며, 화학물질과 폐기물에서의 유 해특성은 비슷하면서도 약간 거리가 있어 폐기물 유해특성 관리와 시험방 법에 대해서 실질적인 검토가 필요한 실정이다.

바젤협약 유해특성(H-code)에서 제시하고 있는 생태독성, 독성, 발암 성, 자극성, 민감성, 생식독성, 변이원성, 감염성, 위해성 등에 대한 객관적 인 시험방법과 평가절차 및 판정기준이 국내 폐기물에 대해서 대부분 존 재하지 않기 때문에 폐기물에 대한 유해특성을 시험하여 수량적으로 규정 할 방법이 없기 때문에, 국내 폐기물의 유해특성에 의한 위해성 분석이 취약할 수밖에 없으며 이러한 자료에 의해 폐기물의 유해성을 판정하는 것은 국제적인 신뢰성을 확보하기가 어렵고 이 결과는 바젤협약에서 관리 하는 폐기물의 국가간 이동에 심각한 문제를 초래할 수 있다. 따라서 바 젤협약, OECD, UN 등 국제협약에서 규정한 유해특성 시험방법 중에서 국내 실정에 맞게 적용할 수 있는 유해특성 시험방법과 판정기준 설정을 모색하고 이것을 위해서 국내의 규정 중 국립환경과학원고시 화학물질유 해성시험방법과 고용노동부고시 제2013-37호 화학물질의 분류·표시 및 물 질안전보건자료에 관한 기준의 유해성·위험성 분류 및 건강유해성에 나타 난 판정기준을 검토하였다.

- 4 -

국내 유해화학물질관리법 제14조, 동법시행규칙 제5조 제4항, 제10조 및 제11조의 규정에 의하여 화학물질유해성 시험 연구기관의 지정, 관리 기준, 운영 및 사후평가와 화학물질유해성시험방법에 관한 사항을 규정하 고 있다. 화학물질의 특성에 따라 유해특성은 크게는 물리적 위험성, 건강 및 환경유해성으로 나누고 각각에 대해서 환경부와 고용노동부 고시 화학 물질 분류표시 및 기준인 <표 1>과 같이 세부적으로 나누어진다.

<표 1>에 의하면, 물리적 위험성에 따른 분류로써 16종의 유해성을 가 지는 화학물질로 분류하며 건강 및 환경유해성에 따른 분류로써 급성독 성, 피부부식성/자극성, 심한 눈 손상/눈 자극성, 호흡기 및 피부 과민성, 생식세포변이원성, 발암성, 생식독성, 표적장기 전신독성(1회 노출 및 반 복노출), 흡인유해성, 수생환경 유해성 등 10종의 유해성을 가지는 화학물 질로 분류한다.

표 1. 국내 화학물질 분류표시 및 기준

구 분 내 용

물리적 위험성에 따른 분류(16분류)

화약류·폭발성물질, 인화성가스, 인화성에어로졸, 산화성 가스, 고압가스, 인화성액체, 인화성고체, 자기반응성물질, 자연 발화성액체, 발화성고체, 자기발열성물질, 물 반응성 물질, 산화성액체, 산화성고체, 유기과산화물, 금속부식성물질

건강 및 환경유해성에 따른 분류(10분류)

급성독성, 피부부식성/자극성, 심한 눈 손상/눈자극성, 호흡기 및 피부 과민성, 생식세포변이원성, 발암성, 생식독성, 표적장기 전신독성(1회 노출 및 반복노출) 흡인유해성, 수생환경 유해성

국내에서는 국립환경연구원고시 ‘화학물질유해성시험연구기관의 지정 등에 관한 규정’, 고용노동부고시 ‘유해인자의 유해·위험성 평가 등에 관한 규정’에 의하여 유해특성에 대한 시험방법과 판단 및 평가 기준이 OECD 시험방법 지침서(Test Guidelines)를 참고하여 고시되어 있다.

- 5 -

그리고 고용노동부고시 ‘화학물질의 분류·표시 및 물질안전보건자료에 관한 기준’, 국립환경연구원고시 ‘화학물질 유해성 심사에 관한 규정’을 통하여 유해특성 물질의 분류가 이루어지고 있다. 이는 화학물질유해성시험방법 에서 규정하고 있는 건강유해물질의 지정범위를 엄격히 확정하여 물질이 본질적으로 갖고 있는 유해특성을 시험방법에 의해 정확히 판정하는데 목적을 두고 있다. 이와 같이 정확한 물품의 유해특성을 판정함으로써 유해물질을 저장·취급 및 운반할 경우 사업자가 물품의 유해특성에 따라 적절한 안전 대책을 강구하도록 하여 유해물질에 의한 사고를 사전에 예방할 수 있도록 유해물질의 성상에 따른 가장 적합한 대응책을 수립할 수 있을 것이다.

본 연구에서는 수출·입 폐기물의 유해특성 중 생태독성 물질, 독성 물 질, 발암성 물질, 자극성 물질, 민감성 물질, 생식독성 물질, 변이원성 물 질, 감염성 물질, 위해성 물질을 중점으로 검토하는 것이 목적이다. 국내 에서는 <표 2>에 나타낸 바와 같이 고용노동부고시 건강 및 환경유해성 에 따른 분류의 정의 및 유해위험성 구분을 통하여 급성독성, 피부부식성 및 자극성, 심한 눈 손상 및 자극성, 호흡기 및 피부 과민성, 생식세포 변 이원성, 발암성, 생식독성, 표적장기 전신독성, 흡인유해성, 수생생태독성 으로 분류하고 있다. 본 연구에서는 생태독성, 독성 등 9가지 유해특성에 대해서 고용노동부, 환경부, 안전행정부의 규정과 동시에 바젤, OECD, UN 등 국제적 기준을 검토하고자 하였다. 고용노동부의 유해특성은 OECD 시험방법과 평가기준을 기본으로 하여 나타내고 있어 OECD 시험 방법과 거의 유사하므로 이 방법을 바젤, UN, 그리고 EU 시험방법과 판 정기준을 비교 검토하며 연구를 수행하고자 하였다.

- 6 -

표2. 건강 및 환경유해성에 따른 분류의 정의 및 유해위험성 구분

구 분 정 의

급성독성

입 또는 피부를 통해 1회 또는 24시간 이내에 수회로 나누어 물질을 투여하거나 4시간동안 흡입노출 시켰을 때 나타나는 유해 영향을 의미

피부부식성 및 자극성

피부 부식성이란 피부에 비가역적인 손상을 의미하며, 피부 자극성이란 시험물질을 피부에 4시간 동안 적용시켰을 때 나타나는 회복 가능한 피부 손상을 일으키는 것을 의미

심한 눈 손상 및 자극성

심한 눈 손상이란 눈 전방 표면에 대상 물질을 노출시켰을 때 눈 조직 손상 또는 시력 저하 등이 나타나 21일 이내에 완전히 회복되지 않은 경우를 의미

눈자극성이란 눈 전방 표면에 대상 물질을 노출시켰을 때 눈에 어떠한 변화가 발생하여 21일 이내에 완전히 회복되는 경우를 의미

호흡기 및 피부 과민성

호흡기 과민성이란 호흡을 통해 노출되어 기도에 과민 반응을 유발하는 경우를 의미

피부 과민성이란 피부접촉을 통해 알레르기 반응을 유발하는 경우를 의미

생식세포 변이원성

생식세포 변이원성이란 자손에게 유전될 수 있는 사람의 생식세포에 돌연변이를 일으킬 수 있는 화학물질과의 관계 발암성 발암성 물질이란 암을 일으키거나 그 발생을 증가시키는

화학물질 또는 혼합물질을 의미

생식독성 성숙된 암수동물의 생식기능 및 수정 능력에 대한 유해영향뿐 아니라 새끼에 대한 발생독성을 포함

표적장기 전신독성

1회 노출: 1회 노출에 의해 일어나는 특이적인 비치사적 특정 표적장기/전신독성을 일으키는 물질

반복 노출: 반복 노출에 의해 일어나는 특정 표적장기/전신독성을 일으키는 물질

흡인유해성

흡인이란 직접적으로 구강이나 비강을 통하거나 또는

간접적으로 구토로 인해 액체나 고체 화학물질이 기관 및 더 깊은 호흡기관의 유입을 의미함.

수생생태독성

급성독성: 화학물질에 단기적 노출에 의해 생물에 유해한 해당 물질의 고유 성질을 의미함

만성독성: 수생생물의 생활주기에 상응하는 노출 동안, 수생생물에 악영향을 미치는 물질의 잠재적인, 또는 실질적인 성질을 의미함

- 7 - (1) 자극성(OECD H4) 폐기물의 판정기준

자극성 폐기물의 판정기준은 OECD를 기초로 선정하였으며, 피부자극 성과 눈자극성 시험방법으로 구분되고 그림1과 그림2에 나타낸 바와 같다.

그림1. 피부자극성 폐기물의 판정기준 흐름도

그림2. 눈자극성 폐기물의 판정기준 흐름도

- 8 - (2) 위험성(H5) 폐기물의 판정기준

위험성 폐기물의 판정기준은 독성 시험방법과 동일하게 진행되며 독성 등급에 따라 위험성과 독성으로 구분된다.

(3) 독성(Basel H5) 폐기물의 판정기준

독성 폐기물의 판정기준은 Basel을 기초로 선정하였으며, 독성(고정용 량법), 독성(독성등급법), 경피독성, 흡입독성 시험방법으로 구분되고 그림 3, 그림4, 그림 5, 그림6에 나타낸 바와 같다.

그림3. 독성(고정용량법) 폐기물의 판정기준 흐름도

그림4. 독성(독성등급법) 폐기물의 판정기준 흐름도

- 9 - 그림5. 경피독성 폐기물의 판정기준

흐름도

그림6. 흡입독성 판정기준 흐름도

- 10 - (4) 발암성(OECD H7) 폐기물의 판정기준

발암성 폐기물의 판정기준은 OECD를 기초로 선정하였으며, 시험방법 은 그림7에 나타낸 바와 같다.

그림7. 발암성 폐기물의 판정기준 흐름도

- 11 - (5) 감염성(H9) 폐기물의 판정기준

감염성 폐기물의 판정기준은 시험방법이 아닌 배출원 및 배출경로에 따른 분류로써 그 유해특성을 판정한다.

(6) 생식독성(OECD H10) 폐기물의 판정기준

생식독성 폐기물의 판정기준은 OECD를 기초로 선정하였으며 물벼룩류 생식능, 생식능 및 차세대영향, 생식 및 발생독성 스크리닝, 2세대 생식독 성 시험방법으로 구분되고 그림8부터 그림11에 나타낸 바와 같다.

그림8. 물벼룩류 생식능 판정기준 흐름도

그림9. 생식능 및 차세대영향 판정기준 흐름도

- 12 - 그림10. 생식 및 발생독성 스크리닝

판정기준 흐름도

그림11. 2세대생식독성 판정기준 흐름도

- 13 - (7) 변이원성(OECD H11) 폐기물의 판정기준

변이원성 폐기물의 판정기준은 OECD를 기초로 선정하였으며 복귀돌 연변이, 포유류 배양세포를 이용하는 염색체이상, 골수세포 소핵, 생체외 포유류세포 유전자 돌연변이 시험방법으로 구분되고 그럼12에서 그림15에 나타낸 바와 같다.

그림12. 복귀돌연변이 판정기준 흐름도

그림13. 포유류 배양세포를 이용하는 염색체이상 판정기준 흐름도

- 14 - 그림14. 골수세포 소핵시험방법을

이용한 판정기준 흐름도

그림15. 생체외 포유류세포 유전자 돌연변이 판정기준 흐름도

- 15 -

(8) 민감성(OECD H13) 폐기물의 판정기준(피부과민성시험)

민감성 폐기물의 판정기준은 OECD를 기초로 선정하였으며 피부과민 성 시험방법으로 구분되고 그림16에 나타낸 바와 같다.

그림16. 피부과민성 폐기물의 판정기준 흐름도

- 16 -

(9) 생태독성(Basel H12) 폐기물의 판정기준(물벼룩을 이용한 24시간 급성 독성시험)

생태독성 폐기물의 판정기준은 Basel H12를 기초로 선정하였으며 물벼 룩을 이용한 24시간 급성독성 시험방법으로 구분되고 그림17에 나타낸 바 와 같다.

그림17. 생태독성 폐기물의 판정기준 흐름도

- 17 -

나. 국내·외 유해특성 시험방법 비교

국내의 화학물질 유해특성을 판단하기 위한 규정은 국립환경과학원고시 화학물질유해성시험방법과 고용노동부고시 화학물질의 분류·표시 및 물질 안전보건자료에 관한 기준의 유해성·위험성 분류 및 건강유해성에 나타난 판정기준이 있다. 자극성, 위해성, 독성, 발암성, 감염성, 생식독성, 변이원 성, 민감성, 생태독성에 대한 판정기준은 OECD 유해특성 시험방법을 기 준으로 Basel 협약, EU, UN 및 국내에서 규정하여 실시하고 있다.

자극성의 판정은 OECD 시험법을 기준으로 우리나라는 피부와 눈에 임상증상(피부반응, 안구병변)을 일으키는 정도를 각각의 평가표에 따라 평가하여 자극성을 판정하였고, EU는 폐기물의 용출액 특성과 pH, 시험 동물의 피부 생물벽체 파괴 등을 통하여 판정하였으며, UN은 물질의 표피 부식을 통하여 판정하였다.

독성 시험방법은 우리나라, UN에서 노출경로에 따른 시험방법을 규정 하고 있고 EU는 발광 세균을 이용하여 시험물질의 독성을 판정하고 있으 며, Basel 협약은 물질과 유기성잔류오염물에 따른 독성 분류기준을 제시 하고 있다.

발암성의 판정은 우리나라, Basel 협약, EU, UN에서 모두 OECD 시험 법을 참고하여 시험동물의 전생애에 화학물질을 투여하여 종양 발생으로 판정하는 방법을 규정하고 있으며, Basel에서는 독성 등급에 따른 발암성 판정기준도 제시하고 있다.

폐기물의 감염성 판정은 우리나라, OECD, Basel 협약, EU, UN에서 각자의 법률에 규정된 배출원 및 배출특성에 따른 판정규정을 제시하고 있으며, 감염성을 판정하기 위한 별도의 시험방법은 제시되어 있지 않다.

시험동물의 생식능에 대한 영향을 알아보는 생식능 시험법은 우리나라 의 경우 OECD를 참고하여 물벼룩, 포유류 등을 이용한 시험법을 규정하 고 있으며, EU와 UN은 각각 히드라, 배아세포, 포유류를 이용한 시험법 으로 규정하고 있다.

변이원성의 판정은 우리나라와 EU에서 OECD를 참고한 세포의 돌연

- 18 -

변이성을 이용한 시험법으로 규정하고 있으며, UN의 변이원성 시험방법 은 설치류를 이용한 우성 시험방법이 규정되어 있다.

민감성의 시험방법은 기니아 피그(guinea pig)를 피부과민성 시험방법 이 우리나라, OECD, UN에서 규정되어 있고, EU 유해특성 방법은 국소 임파절 시험법을 규정하고 있지만 동물시험에 의존하고 있으므로 자세한 시험법에 대한 서술은 기재되어있지 않다.

생태독성의 판정은 우리나라의 경우 물벼룩을 이용한 24시간 급성독성 시험을 채택하여 규정하고 있으며, Basel, OECD, EU, UN은 물벼룩을 포 함한 수생생물을 이용한 수생독성시험법을 규정하고 있다.

폐기물에 대한 예비 시험방법은 시험물질의 적용성, 분석의 정확성을 고려하여 독성, 생태독성은 Basel 협약에 의한 유해특성 시험방법, 자극 성, 발암성, 생식독성, 민감성, 변이원성은 OECD의 유해특성 시험방법으 로 설정하는 것이 바람직한 것으로 판정된다. 또한, 위해성은 EU의 독성 평가 등급기준에 따른 판정기준, 감염성은 Basel 협약에 따른 판정기준으 로 설정하는 것이 바람직한 것으로 판정된다.

- 19 -

표3. 국내외 유해특성 시험방법 및 판정기준 비교 구분국내/OECDEUUNBasel 자극성/ 부식성 (H4)

시험항목① 급성 피부 자극성 ② 급성 눈 자극성

① CEN(Committee European de Normalisation) 용출시험 ② 자극성과 부식성의 pH 측정 ③ NR 방출 시험 ④ EC 시험법 B40(피부 부식) ⑤ 피부 생물벽체 시험

TER(Transcutaneo us Electrical Resistance) 측정- 시험방법

① 시험물질을 시험동물의 피부 일부분에 적용 후 첩포로 덮고 시간에 따라 반응 관찰 ② 시험동물의 한쪽 안구에 10 cm거리에서 1초간 분무 후 독성 관찰

① 물리적, 화학적 특성 조사 ② 수용성 폐기물 및 고형폐기물의 침출액 pH 측정 ③ 시험물질에 세포를 24시간 동안 노출 후 시액 제거 후 세포 성장 저해 측정 ④ 쥐 피부에 시험물질을 노출시켜 경피성 전기 저항을 측정 ⑤ 시험물질이 생물벽체를 파괴하면 CDS 색 변화로 자극성 감지 죽은 시험동물의 표피에 시험물질을 최대 24시간 노출 후 전기를 흘려준 후 반응 평가

- 시료① 액체 0.5 mL, 고체 혹은 반고체 0.5 g ② 액체 0.1 mL, 고체 혹은 반고체 혹은 입자 상태인 경우 100 mg

① 단면적 40 mm 이하 단일폐기물 입자를 4 mm이하로 한 다음 탈염수에 용출 ② 고형폐기물은 적절한 침출시험 선택 후 침출수로 시험-- 판정방법

① 시험물질을 첩포로 부착하여 14일 동안 관찰 후 제거한 뒤 1, 24, 48, 72시간 후 피부에 나타나는 반응을 임상증상 및 피부반응 평가표에 따라 판정 ② 시험물질 적용 안구와 다른 한쪽 안구를 1, 24, 48, 72시간 동안 비교 후 안구병변등급과 임상증상을 별표에 따라 판정

① 시험물질에 따라 달라지는 전도성과 산화환원전위 기록 후 데이터 해석하여 결과 도출 ② pH가 2이하이거나 11.5이상이면 부식성 유해폐기물로 간주 ③ 자극성 물질에 노출된 세포에서 Neutral Red 방출되는 것을 측정 ④ 시험물질의 세포독성작용으로 전류의 각질층 투과가 증가함에 따라 부식성 판정 ⑤ 시험물질에 의해 파괴된 생물벽체에서 나온 CDS를 화학물질 검출기로 검출 시험물질에 의한 각질층의 물리적 파괴로 인한 이온 투과성 증가로 화학물질의 부식성 판정

- 위험성 (H5)판정방법-독성(H6)의 등급기준과 같이 결부되어 판정되고 있음Code 6.2, Code 9과 결부되어 판정되고 있음

H6.1, H11과 같이 결부되어 판정되고 있음

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표3. 국내외 유해특성 시험방법 및 판정기준 비교 (계속) 구분국내/OECDEUUNBasel 독성 (H6)

시험항목급성경구독성(① 고정용량법/② 고정등급법), ③ 급성경피독성, ④ 급성흡입독성

① 세균 생체발광 평가법, ② 강화된 화학발광 평가법 ③ 위험성(H5): ①, ②방법과 동일 Basel과 동일OECD와 동일 (H6.1, H11)

시험방법

① 시험물질을 5, 50, 30, 2000 mg/kg으로 단계적으로 늘려 경구 투여 후 사망 및 독성증상 관찰 ② 시험물질을 5, 50, 300, 2000 mg/kg 중 독성증상이 예측되는 용량을 선택하여 경구 투여 후 결과 관찰 ③ 시험물질을 피부 면적 10%에 단계별 용량으로 적용한 후 사망 및 독성작용 관찰 ④ 가스상 시험물질에 온도를 22±2 ℃로 유지하면서 4시간동안 노출시켜 사망 및 독성작용 관찰

① 생체발광 세균에 시험물질을 5-30분 동안 노출시켜 발생하는 광출력을 측정 ② 당근과산화효소로 인한 루미놀 산화의 발광저해물질로써 측정 시료

① 최대 1 mL/100g개체 미만 ② 수용액 2 mL/100g개체 미만 (수용성 - 물에 용해, 비수용성 - 오일(corn oil) 또는 기타 다른 용매에 용해) ③ 액체 0.5 mL, 고체 또는 반고체 0.5 g ④ 가스상 물질 22 ℃에서 4시간 노출

①, ②, ③ : 하수 유출물, 석유폐수, 산업폐수 판정방법

① 14일 정도 24시간마다 주기적으로 독성증상, 치사 개체 수 및 용량-독성반응관계 관찰 후 결과해석 ② 시험물질의 용량 5, 50, 300, 2000 mg/kg 중 독성증상이 나타날 것으로 예측되는 용량을 선택하여 3마리 투여후 독성증상 관찰 ③ 동물의 사망시간, 독성의 징후를 보이는 동물의 수, 독성의 영향 등을 바탕으로 LD50, ④ LC50를 판단

① 시험물질에 노출된 생체발광 세균으로부터 생기는 광출력으로 판정 ② 시험물질의 효소반응 저해로 빛의 방출 감소를 측정하여 판정 ③ ①, ②방법과 동일하며 독성 등급에 따라 위험성(H5) 평가

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표3. 국내외 유해특성 시험방법 및 판정기준 비교 (계속) 구분국내/OECDEUUNBasel 발암성 (H7)

시험항목발암성 시험방법 OECD와 동일OECD와 동일독성(H11)과 같이 결부되어 판정되고 있음

시험방법시험동물에 시험물질을 전생애에 걸쳐 연속 투여 후 발암성 유무 관찰 시료사료나 음료수에 첨가 농도 5 %(w/w)이하로 경구투여 (경구투여 불가시 비경구투여도 가능) 판정방법

임상적으로 특이사항을 검사하고 독성발현 여부 관찰 후 독성증상과 시험물질의 투여량과의 관계 해석 후 판정, 투여량 증가에 따른 독성증상과 종양 발현에 따른 결과 해석 후 판정 감염성 (H9)

시료

의료법 규정에 의한 의료기관, 지역보건법에 의한 보건소 및 보건진료소, 농어촌 등 보건의료를 위한 특별조치법에 의한 보건진료소, 혈액관리법에 의한 혈액원, 검역법에 의한 동물검역기관, 수의사법에 의한 동물병원 등의 배출원에서 배출된 폐기물 산후관리, 진단, 치료, 질병예방, 감염예방을 위한 수거 및 처분 폐기물, 동물과 관련 연구, 진단, 치료, 질병예방으로 발생한 폐기물

의료/병원성 폐기물

동물, 인간에게 질병을 일으키는 폐기물, 미생물 또는 미생물 독을 포함하는 폐기물 판정방법인체조직물 등 적출물, 탈지면 등 의료기관 및 시험검사기관에서 배출되는 인체에 위해를 줄 수 있는 물질

EWC chapter 18 목록 포함 물질 인간 및 다른 생물체에 질병을 유발하는 미생물 및 독소를 함유한 물질

위험물수송에 대한 UN 권고안에 따른 물질

6가 크롬, 살생제 또는 감염성 물질을 포함하는 모피폐기물 병원성 및 관련 폐기물 (H6.2)

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표3. 국내외 유해특성 시험방법 및 판정기준 비교 (계속) 구분국내/OECDEUUNBasel 생식 독성 (H10)

시험 항목① 물벼룩류 생식능시험 ② 생식능 및 차세대 영향시험, ③ 생식 및 발생독성 스크리닝 ④ 2세대 생식독성시험① 히드라 분석 ② X-gal 분석 생식 독성 선별 검사 및 반복투여 독성 시험방법

- 시험 방법

① 물벼룩의 21일 동안 시험물질에 노출하여 생식능에 영향을 나타내는 농도(EC10, EC50) 산출 ② 시험동물 수컷, 암컷 모두에게 발정주기동안 투여 후 교미시켜 임신기간 및 수유기 동안 투여하여 생식능 및 후세대 발생에 미치는 영향 조사 ③ 시험동물 수컷, 암컷에 교미 전후로 시험물질을 단계적 용량으로 위관내주입법으로 투여 후 차산자의 성장 및 발생, 수태능, 번식능 등 관찰 ④ 수컷은 정자형성주기, 암컷은 성장기간 및 생식주기 동안 단계적 용량의 시험물질을 투여하여 생식능에 미치는 영향을 판단

① 성인히드라를 시험물질에 4, 20, 28, 44, 68, 92시간 후 단계별 관찰 ② 기형발생물질에 노출된 배아 세포는 저분자 열충격단백질 레벨 급증 관찰 시험동물 수컷은 짝짓기 기간 포함 4주간 시험물질을 투여하고, 암컷은 짝짓기 2주전부터 해부전까지 시험물질 투여 후 해부

- 시료

① 비수용성, 수용해도가 낮은 시료 - 유기 용매 acetone, ethanol, methanol, triethylene glycol, DMSO, dimethylformamide 등 사용, 분산제 cremophor RH40, methylcellulose 0.01% 또는 HCO-40 등 사용하여 용해 ② 사료에 첨가 농도는 5%(w/w)이하 ③ 위관내주입법으로 체중당 일정한 양을 투여 ④ 최대 1회 경구 투여량은 수용액 2 ml/100 g(체중), 비수용액 1 ml/100 g(체중), 옥수수유 0.4 mL/100g(체중) 미만

① 5 mg/mL 이하

수컷 - 최소 4주 투여 암컷 - 짝짓기 2주전, 임신 기간, 임신 후 4일, 실험결과 날, 해부 전 날 투여

- 판정 방법

① EC10, EC50, 무영향관찰농도(NOEC), 최소영향관찰농도(LOEC) 산출 후 결과해석 ② 출생 새끼수, 사망 유무 등을 통하여 독성증상과 시험물질의 투여량과의 관계에 대해서 통계학적 수법을 이용하여 결과를 도출 ③ 임신 0일부터 계산된 수태기간을 계산하고, 분만 후 24시간(분만 후 0일 혹은 1일) 및 분만 4일 후 차산자의 생존유무, 크기, 성별 관찰 후 판정 ④ 시험물질 투여군과 대조군의 비교 후 독성 영향을 평가하고 생식독성관련 NOAEL과 성장 등 부작용에 관한 결과를 평가하여 생식능에 미치는 영향을 판단

① 성인 히드라의 경우 튤립 단계, 인공 배아의 경우 붕괴 단계에서 생식독성 발현 판정 ② 배아 세포가 기형발생물질에 노출되었을시 급증하는 저분자 열충격단백질 레벨로 판정 시험동물 해부 후 고환독성 및 독성징후 파악-

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표3. 국내외 유해특성 시험방법 및 판정기준 비교 (계속) 구분국내/OECDEUUNBasel 변이원성 (H11)

시험항목① 복귀돌연변이 시험방법 ② 포유류 배양세포를 이용하는 염색체이상시험 ③ 골수세포 소핵시험 ④ 생체외 포유류세포 유전자 돌연변이시험 OECD와 동일

설치류 우성 시험법- 시험방법

① 시험물질에 의한 DNA 염기쌍의 치환, 삽입, 결실과 관련된 점돌연변이를 찾고, 변이원성 및 필수아미노산을 합성하기 위한 기능성이 없는 균주의 회복을 통해 화학물질의 유전자 돌연변이 유발성을 평가 ② 포유류 배양세포를 시험물질에 노출시킨 다음 콜히친이나 콜세미드로 처리하여 세포분열의 증기상태로 만들어 염색체 이상 관찰 ③ 시험동물을 설치류로 선정하여 세포분열시 시험물질에 의해 출현하는 염색체로 인한 소핵의 형성으로 생체 내 유전독성을 평가 ④ 포유류 배양세포를 시험물질에 노출시킨 후 생체 외(in vitro) 시험조건에서 DNA 수준에서의 변화에 따른 돌연변이 여부 측정

수컷 시험동물을 시험물질에 노출시켜 자연상태에서 짝짓기 후 암컷 해부 후 착상 태아수를 대조군과 비교

- 시료 ① plate당 5㎎ 또는 5㎕ 이하 적용 ② 5㎕/㎖, 5㎎/㎖ 또는 0.01M의 농도 이하 적용, ③ 투여기간 14일 이내 2000mg/kg/day, 14일 이상 1000mg/kg/day-- 판정방법

① 시험물질 노출에 따른 최소 1개 이상의 균주에서 각 플레이트의 복귀돌연변이 콜로니 수가 모든 농도에서 농도 의존적이거나 하나 이상의 농도에서 재현성이 있는 증가를 보일 경우 양성 판정 ② 염색체 이상을 가진 세포수가 용량의존적으로 증가하거나 재현성 있는 증가를 보이는 경우 양성 판정 ③ 시험동물의 계수한 미성숙 적혈구 수와 소핵을 가지는 미성숙 저혈구의 출현빈도, 전체 적혈구 중 미성숙 적혈구 수를 관찰하여 소핵을 가진 적혈구 수가 용량 의존적으로 증가하면 양성으로 판정 ④ 세포독성, 생존능력, 콜로니 수 및 돌연변이빈도 등의 결과값으로 유해특성 판단 착상 태아수 및 죽은 태아수를 대조군과 비교하여 결과해석

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표3. 국내외 유해특성 시험방법 및 판정기준 비교 (계속) 구분국내/OECDEUUNBasel 민감성 (H13)

시험항목피부과민성시험 방법국소 임파절 시험법 OECD와 동일

- 시험방법기니아피그(guinea pig)에 털 제거후 시험물질을 도포하여 피부자극 관찰-- 시료고상 - 매개물질로 용해 액상 - 0.5mL씩 도포-- 판정방법시험동물의 피부 반응 관찰 후 유발첩포 시험 반응 평가에 대한 Magnusson-Kligman 점수 매기기 이용하여 판단-- 생태독성 (H14)

시험항목물벼룩을 이용한 24시간 급성독성시험수생독성 시험 (Aquatic Toxicity Testing)

조류성장저해 시험법 OECD와 동일 (H12)

시험방법시험물질을 여러 비율로 희석한 시험수에 물벼룩을 투입하고 24시간 후 유영상태 관찰 후 시료농도와 치사 혹은 유영저해를 보이는 물벼룩 마리수와 상관관계 도출 물벼룩, 어류 등에 시험물질 처리 후, 24시간 동안 관찰 후 치사율 기록

조류에 시험물질 투여 후 대략 72시간 관찰 후 조류 바이오 매스 증가(평균 성장률) 성장 억제 정도 시료산업폐수, 하수, 하천수, 호소수 등 50 mL(원수 기준 100, 50, 25, 12.5, 6.25 %로 희석)2mL 이상/개체수- 판정방법희석한 시험수에 물벼룩을 넣고 24시간 동안 관찰하여 물벼룩의 50 %가 유영저해를 일으키는 시료농도(EC50)를 결정하고 단위환산에 의해 생태독성값(TU) 계산

24시간 후 반수영향농도(EC50), 반수치사농도(LC50) 산출 72시간 후 반수영향농도 (EC50) 산출

2. 유해특성 시험방법

가. 자극성 시험방법

나. 위험성 시험방법

다. 독성 시험방법

라. 발암성 시험방법

마. 감염성 시험방법

바. 생식독성 시험방법

사. 변이원성 시험방법

아. 민감성 시험방법(피부과민성시험)

자. 생태독성 시험방법(물벼룩을 이용한

24시간 급성독성시험)

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가. 자극성 시험방법

급성 피부자극성 및 부식성 시험

1.0 개요

1.1 목적

본 시험방법은 시험물질을 실험동물의 피부에 도포한 후 발생하는 피 부의 자극 정도를 평가하는 것을 목적으로 한다. 기존의 연구 결과, 구조 적으로 피부 자극성과 관련이 있는 화학물질 혹은 혼합물에 대한 자료, 화학물질의 강산 또는 강염기성, 검증된 생체외 시험(in vitro test) 결과를 바탕으로 화학물질의 피부 부식성/자극성을 평가한 후, 잠재성이 있다고 판단되는 경우, 본 시험을 수행할 것을 권고한다.

1.2 적용범위

이 시험방법은 OECD 유해특성 시험방법을 기초로 하였으며, 피부에 자극성이나 부식성을 보일 것으로 예상되는 물질을 대상으로 적용한다.

동물의 피부에 심각한 부식성이 있는 물질, 피부에 노출될 때 강한 독성 을 야기할 수 있는 물질 및 2,000 mg/kg 농도에서 피부자극을 일으키지 않는 물질에 대해서는 본 시험을 적용해서는 안 된다.

2.0 용어 정의

2.1 피부자극

화학물질에 최대 4시간 노출된 후 회복가능한(reversible) 피부 손상

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2.2 피부부식

화학물질에 최대 4시간 노출된 후 표피 및 진피에서 괴사가 나타나는 피부의 비가역적인 손상, 궤양, 출혈, 유혈성 딱지(bloody scab) 및 관찰 14일에 걸쳐 나타나는 피부 표백, 탈모증, 흉터에 의한 탈색이 대표적인 피부 부식(dermal corrosion) 반응이다.

3.0 시험 준비

3.1 시험동물

여러 종류의 포유동물을 사용할 수 있으나 바람직한 종은 뉴질랜드 화 이트 래빗 또는 알비노 래빗이다.

시험동물실의 온도는 22±3℃, 상대습도는 30～70%를 반드시 유지시킨다.

인공조명으로 할 경우 매 12시간 간격으로 점멸한다. 사료는 일반적으로 널리 쓰이는 것을 사용하며, 음료수는 자유로이 섭취시킨다. 동물은 성별 군으로 사육해야 하며, 케이지당 동물수는 개개의 동물을 충분하게 관찰 할 수 있는 범위로 한다.

3.2 시험물질

시험물질은 고체, 반고체, 액체 물질을 직접 피부에 노출시키도록 하며, 폐기물에 적용할 경우에도 고체, 반고체 및 액체 폐기물을 모두 시험물질 로써 직접 적용하도록 한다.

4.0 시험방법

4.1 원리

실험동물은 실험개시 24시간 동안 주로 등 피부를 선택하여 피부가 손상

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받지 않도록 약 2.5 X 2.5 cm의 면적을 지닌 찰과부위와 비찰과부위를 만들어 시험물질을 적용한 다음 피부병변을 관찰한다.

4.2 시험물질투여

투여량은 액체의 경우 약 0.5 mL, 그리고 고체 또는 반고체의 경우 약 0.5 g으로 한다. 시험물질을 시험동물의 피부에 4시간동안 노출시킨다. 도 포후 시험물질의 증발 예방 대책을 세운다.

4.3 임상결과 및 피부반응 평가

도포 종료후 각각 1시간, 24시간, 48시간, 72시간 후 피부에 나타나는 반응을 다음의 임상증상 및 피부반응 평가표에 따라 관찰한다.

표4. 임상증상 및 피부반응 평가표

홍반 및 가피 형성 부종형성

반응 등급 반응 등급

홍반이 전혀 없음 0 부종이 전혀 없음 0

아주 가벼운 홍반

(육안으로 거의 식별할 정도) 1 아주 가벼운 부종

(육안으로 거의 식별할 정도) 1 명확한 홍반 2 가벼운 부종 (뚜렷하게 부어올라서

노출부위가 구별될 정도) 2 중간정도부터 심한 홍반 3 중간정도의 부종(약 1 mm 정도

부어올랐을 경우) 3

심한 홍반과 홍반을 평가할

수 없을 정도의 가피형성 4 심한 부종(1 mm 이상 부어오르고 노출부위 밖까지 확장된 경우) 4

최고점 : 4 최고점 : 4

5.0 References

(1) OECD Test Guidelines : TG 404

(2) Appendix C : C4 Assessment of Hazards H4/H8 : Irritant and Corrosive (3) 국립환경과학원 고시 제2013-2호 : 화학물질유해성시험방법

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그림18. 피부자극성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차

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가. 자극성 시험방법

급성 눈 자극성 및 부식성 시험

1.0 개요

1.1 목적

본 시험방법은 화학물질이 안구나 점막에 노출되었을 때 나타나는 악 영향을 평가하는데 그 목적이 있다.

1.2 적용범위

이 시험방법은 동물의 안구에 심각한 자극성이나 부식성이 있는 물질, 피부자극 시험결과 심한 피부자극이나 부식독성이 있는 물질은 본시험을 적용해서는 안 된다.

2.0 용어 정의

2.1 눈 자극

시험물질이 눈에 노출되었을 경우 회복가능한(reversible) 안구의 변화

2.2 눈 부식

시험물질이 눈에 노출되었을 경우 일어나는 안구의 회복 불가능한 조직 장애(systemic adverse effect)로의 변화

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3.0 시험 준비

3.1 시험동물

실험개시 24시간 전에 미리 안과학적 검사를 실시하여 안구손상이나 각막손상 등이 없는 건강한 개체를 사용하며, 주로 토끼(2.0~3.0 kg)를 사 용한다.

시험동물실의 온도는 20~22℃(±3℃), 상대습도는 30～70%를 반드시 유 지시킨다. 인공조명으로 할 경우 매 12시간 간격으로 점멸한다.

3.2 시험물질

시험물질은 고체, 반고체, 액체 물질을 직접 안구에 노출시키도록 하 며, 피부자극성 시험방법과 동일하게 폐기물에 적용할 경우에도 고체, 반 고체 및 액체 폐기물을 모두 시험물질로써 직접 적용하도록 한다.

4.0 시험방법

4.1 원리

시험물질을 건강한 동물의 한쪽 안구에 1회 투여한 후 발생하는 독성 을 관찰한다.

4.2 시험물질투여

투여량은 액체의 경우 약 0.1 mL, 그리고 고체, 반고체, 입자상태의 경 우 100 mg 미만으로 한다. 분무상태의 물질인 경우는 눈에서 약 10cm 거 리에서 안구의 손상이 야기되지 않도록 주의하면서 1초간 분무한다.

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4.3 임상증상 및 안구반응 평가

점안 완료 각각 1시간, 24시간, 48시간, 72시간 후 안구병변등급과 임 상증상을 고려하여 평가표에 따라 관찰한다.

5.0 References

(1) OECD Test Guidelines : TG 405

(2) Appendix C : C4 Assessment of Hazards H4/H8 : Irritant and Corrosive (3) 국립환경과학원 고시 제2013-2호 : 화학물질유해성시험방법

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그림19. 눈자극성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차

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나. 위험성 시험방법

위험성 시험방법

위험성 시험방법은 독성 시험방법과 동일하게 진행되며 독성등급에 따 라 위험성과 독성으로 구분된다.

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다. 독성 시험방법

급성경구독성시험(고정용량법)

1.0 개요

1.1 목적

이 시험방법은 경구로 단기간 노출될 때 나타날 가능성이 있는 건강장애 (adverse health effect)에 대한 정보와 화학물질의 분류와 표시의 기초자료를 제공하며 타 연구에서의 용량결정을 위한 예비시험단계로서 화학물질의 독성발현 형태에 대한 최초의 정보를 제공하는데 그 목적이 있다.

1.2 적용범위

이 시험방법은 Basel 협약에 의한 유해특성 시험방법을 기초로 하였으며, 시험동물의 보호를 위해 치사량 이상의 화학물질 사용을 가급적 피하고, 치사량 이하의 용량에서 경구 투여하여 독성증상을 관찰하는 방법이다.

주로 설치류에 대하여 규정하였으나 비설치류에도 적용된다.

2.0 용어 정의

2.1 급성경구독성

시험물질을 1회 또는 24시간 내 수회 경구 투여 시 짧은 시간 내에 나 타나는 악영향

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2.2 LD50: (median lethal dose)

경구로 1회 투여 시 시험동물의 50%를 치사시킬 수 있는 시험물질의 용량

2.3 용량-반응

규정된 영향을 보이는 시험개체의 비율과 용량과의 관계

3.0 시험 준비

3.1 시험동물

주로 랫드를 많이 사용하며 통상 사용되는 시험용의 계통을 사용한다.

시험에 사용되는 동물의 체중차이는 평균체중의 ±20%를 초과해서는 안 된다. 암컷은 임신한 경험이 없는 것을 사용한다.

동물사육실의 온도는 22±3℃, 상대습도는 30～70%를 반드시 유지시킨 다. 동물은 성별로 나누고, 집단사육을 할 경우 케이지 당 마리 수는 동물 개체마다 관찰이 용이하도록 조정한다. 시험물질의 생리학적 특성 또는 독성작용(예: 이환율과 흥분성)에 따라서 개별 케이지에서 사육해야 하는 경우도 있다. 식이에 대해서는 보통 일반적으로 사용되는 실험용 사료를 공급하고 물은 자유롭게 제공한다.

건강한 동물을 무작위로 선택하여 시험개시 전 적어도 5일간 시험환경 에 순화시킨다.

3.2 시험물질

시험물질은 수용성 물질을 용해하여 사용하는 것이 바람직하지만, 비 수용성 물질을 시험물질로 사용할 경우에는 유지(예: corn oil) 또는 다른 매체를 사용하여 용해/현탁하여도 무방하다. 비수용성매체를 사용할 경우 독성이 이미 알려져 있는 매체를 사용해야 하며, 만일 알려져 있지 않으 면 시험 전에 결정하여야 한다.

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4.0 시험방법

4.1 원리

급성경구독성시험법은 예비시험에서 한쪽 성(암컷을 원칙으로 함)에 대해 여러 시험용량의 독성효과를 조사하고 그 결과로부터 최소 치사량 및 용량-반응 관계를 확보하며, 본시험에서는 한쪽 성(암컷을 원칙으로 함)의 동물을 사용하여 고정용량(5, 50, 300, 2,000 mg/kg)에 대해 단계적 으로 시험한다. 시작 용량은 예비시험 결과에 근거하여 선정하는데 사망 과 같은 심각한 독성을 유발하지 않으나 그 외의 독성 증상이 관찰될 수 있을 것으로 예측되는 용량으로 한다. 시작 용량의 결과에 따라 다음 용 량을 결정한 후 단계적으로 투여한다.

4.2 시험물질투여

경구 투여하는 시험물질의 양은 고정용량(5, 50, 300, 2,000 mg/kg)으로 단 계적으로 늘린다.

4.3 독성증상 평가

각 용량 군단 사용동물 수, 독성증상을 나타내는 동물 수, 시험 중 사 망한 동물 수, 인도적으로 처분한 동물 수, 독성작용의 기록 그리고 본 시 험에서 명백한 독성의 관찰여부, 독성작용의 시간경과 및 해부소견을 관 찰하여 평가한다.

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표5. 경구독성증상 평가표

용 량 결 과 설 명

5 ㎎/㎏

100%이하의

생존율 경구투여 시 강한 독성(25 mg/kg 이하 LD

값)의 가 능성이 있는 화학물질

100%의 생존율

명백한 독성 있음 경구투여 시 독성(25~200 mg/kg LD

값)의 가능성이 있는 화학물질

100%의 생존율

명백한 독성 없음 다음 용량 단계인 50 mg/kg에서 시험

50 ㎎/㎏

100%이하의 생존율

경구투여 시 독성 또는 강한 독성의 가능성이 있는 화 학물질

전 용량 단계인 5 mg/kg에서 시험하지 않은 경우 전 용량 단계 5 mg/kg

100%의 생존율

명백한 독성 있음 경구투여 시 유독성(200~2,000 mg/kg LD

값)의 가능 성이 있는 화학물질

100%의 생존율

명백한 독성 없음 다음 용량 단계인 500 mg/kg에서 시험

500 ㎎/㎏

100%이하의 생존율

경구투여 시 독성 또는 유해성의 가능성이 있는 화학 물질

전 용량 단계인 50 mg/kg에서 시험하지 않은 경우 전 용량 단계 50 mg/kg

100%의 생존율

명백한 독성 있음 2,000 mg/kg이상의 LD

값이 있으나 요주의 화학물질 100%의 생존율

명백한 독성 없음 다음 용량 단계인 2,000 mg/kg에서 시험

2,000 ㎎/㎏

100%이하의 생존율

경구투여 시 상당한 주의를 요하는 화학물질

전 용량 단계인 500 mg/kg에서 시험하지 않은 경우 전 용량 단계 500 mg/kg

100%의 생존율 경구투여 시 중요한 급성독성의 위험이 없는 화학물질

5.0 References

(1) Work on hazard characteristics - Approach to Basel Convention hazard characteristic H11 : characterization of chronic or delayed toxicity

(2) Appendix C : C5 Assessment of Hazards H5/H6 : Harmful and Toxic

(3) OECD Test Guidelines : TG 420

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그림20. 경구독성(고정용량법) 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차

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다. 독성 시험방법

급성경구독성시험(독성등급법)

1.0 개요

1.1 목적

이 시험은 시험동물의 보호를 위해 시험물질에 의한 사망 또는 고통을 가급적 줄이고자 최소한의 동물에 시험물질을 경구 투여하여 급성독성 증 상을 관찰하는데 목적을 둔다.

1.2 적용범위

독성등급법은 Basel 협약에 의한 유해특성 시험방법을 기초로 하였으 며, 시험동물의 보호를 위해 치사량 이상의 화학물질 사용을 가급적 피하 고, 치사량 이하의 용량에서 단계적으로 경구 투여하여 독성증상을 관찰 하는 방법이다.

2.0 용어 정의

2.1 사망 임박(Impending death)

다음 관찰 시기 전 사망 또는 빈사상태가 예견되는 상태로서 경련을 일으키거나 옆으로 누워있는 상태가 관찰되는 상황

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2.2 예측 사망(Predictable death)

시험이 종료되기 전 사망을 예측 가능하도록 임상학적인 징후를 보이는 상태(예: 물이나 먹이에 접근하지 못하거나, 물이나 먹이를 먹지 못하는 상태)

3.0 시험 준비

3.1 시험동물

시험이 시작되는 시점에 연령이 8～12 주령 된 시험용 랫드(다른 설치 류도 가능)를 사용하며 개체 간 체중 차이는 평균 체중의 ±20%를 넘지 않도록 한다. 시험은 한쪽 성을 사용하는데 암컷을 사용하는 것을 원칙으 로 하며, 수컷을 사용할 경우 타당한 사유를 제시한다. 암컷은 과거에 새 끼를 낳은 적이 없고 현재 임신 중이지 않은 것을 사용한다. 시험에 사용 할 개체는 시험 시작 전 최소 5일 이상 실험실에서 순화시킨 건강한 동물 중에서 무작위로 선정한다. 각 동물의 식별을 용이하게 하기 위해 개개의 동물에 표시를 한다.

사육실은 온도가 22℃±3℃, 습도가 30～70%가 유지되도록 한다. 사육은 암․수를 구별하여 실시하며 각 개체의 상태 관찰이 용이하도록 밀도가 높지 않도록 한다. 조명은 명/암이 12/12시간이 되도록 조절하며, 먹이와 물을 적절히 공급한다.

3.2 시험물질

시험물질은 수용성 물질을 용해하여 사용하는 것이 바람직하지만, 비 수용성 물질을 시험물질로 사용할 경우에는 유지(예: corn oil) 또는 다른 매체를 사용하여 용해/현탁하여도 무방하다. 비수용성매체를 사용할 경우 독성이 이미 알려져 있는 매체를 사용해야 하며, 만일 알려져 있지 않으 면 시험 전에 결정하여야 한다.

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4.0 시험방법

4.1 원리

한계시험 또는 본시험에서는 단일 성(가능한 암컷을 우선으로 함)의 동물을 사용하여 제시된 용량에 대해 단계적으로 시험한다. 시작 용량은 기존의 독성자료에 근거하여 선정하는데 사망동물이 관찰될 수 있을 것으 로 예측되는 용량으로 한다. 시작 용량의 경과에 따라 다음 용량을 결정 한 후 단계적으로 투여한다.

4.2 시험물질투여

경구 투여하는 시험물질의 양은 고정용량(5, 50, 300, 2,000 mg/kg) 중 에서 독성 증상(사망 또는 빈사상태)이 나타날 것으로 예측되는 용량 하나 를 선택하여 3마리씩 투여한다.

4.3 독성증상 평가

각 용량 군단 사용동물 수, 독성증상을 나타내는 동물 수, 시험 중 사 망한 동물 수, 인도적으로 처분한 동물 수, 독성작용의 기록 그리고 본 시 험에서 명백한 독성의 관찰여부, 독성작용의 시간경과 및 해부소견을 관 찰하여 평가한다.

5.0 References

(1) Work on hazard characteristics - Approach to Basel Convention hazard characteristic H11 : characterization of chronic or delayed toxicity (2) Appendix C : C5 Assessment of Hazards H5/H6 : Harmful and Toxic (3) OECD Test Guidelines : TG 423

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그림21. 독성(독성등급법) 시험분석방법 및 판정절차

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다. 독성 시험방법

급성경피독성시험

1.0 개요

1.1 목적

이 시험은 경피로 단기간의 노출에 의해 일어날 가능성이 있는 건강장애 (adverse health effect)에 관한 정보를 제공하며 경피흡수 및 경피경로에 의한 독성작용기전에 대한 정보를 제공하는데 그 목적이 있다.

1.2 적용범위

급성경피독성시험방법은 Basel 협약에 의한 유해특성 시험방법을 기초로 하였으며, 시험동물의 보호를 위해 치사량 이상의 화학물질 사용을 가급적 피하고, 치사량 이하의 용량에서 피부에 노출시켜 독성증상을 관찰하는 방법이다.

2.0 용어 정의

2.1 급성경피독성

시험물질을 피부에 1회 도말하였을 때 짧은 시간 내에 나타나는 악영향

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2.2 LD50 (median lethal dose)

1회 투여시 시험동물의 50%를 치사시킬 수 있는 시험물질의 용량

3.0 시험 준비

3.1 시험동물

성숙한 랫드, 토끼 또는 기니아피그(guinea pig)를 사용하고 시험동물 의 체중범위는 다음과 같다. 시험동물의 체중범위는 각각 랫드 200~300 g, 토끼 2.0~3.0 kg, 기니아피그(guinea pig) 350~450 g 이다.

각 용량단계에서 상처가 없는 건강한 피부를 가진 암수 동수의 동물이 필요하다. 각 용량단계에는 적어도 10마리의 동물을 사용하여야 한다. 암 컷은 출산의 경험이 없거나 임신하지 않은 동물을 사용한다. 토끼의 경우 가끔 동물수를 적게 사용할 수가 있으나 만족할 만한 LD50의 측정에 방 해요인으로 작용할 수 있다.

동물은 개별적으로 사육해야 하며 시험동물실의 온도는 설치류 22±

3℃, 토끼 20±3 ℃를 유지하고, 상대습도는 30～70%가 유지되도록 한다.

조명은 인위적으로 조정할 경우 매 12시간 간격으로 점멸하며, 이는 일반 실험용 사료와 함께 음료수를 자유로이 섭취시킨다.

3.2 시험물질

시험물질로 적용하는 시료는 액체의 경우 약 0.5 mL, 고체 또는 반고 체의 경우 0.5 g으로 준비하며, 고체인 경우에는 피부와 잘 접촉될 수 있 도록 최소량의 물과 함께 적용한다.

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4.0 시험방법

4.1 원리

시험물질을 여러 단계의 용량으로 군을 나누어 1군 1용량을 시험동물 의 피부에 적용한 후 독작용 및 사망에 대하여 관찰한다. 시험기간 중 사 망한 동물은 부검하고 시험 종료시 생존한 동물도 도살하여 부검처리한 다. 동물이 심하게 지속적인 고통의 징후를 나타내는 경우는 안락사를 시 킬 필요가 있다. 시험물질이 부식성과 자극성을 나타내어 동물에 현저한 고통을 일으키는 경우에는 시험할 필요가 없다.

4.2 시험물질투여

시험물질은 전체표면적의 약 10％ 범위에 해당하는 투여면적에 균일하 게 적용한다. 독성이 강한 물질은 도포면적을 보다 적게 하는 경우도 있 으나 도포부위 전체를 가능하면 얇고 균일한 필름상태로 넓게 피복해야 한다. 시험물질은 24시간의 노출기간 동안 다공성의 거즈(gauze), 비자극 성 테이프를 사용하여 피부와 접촉을 유지시켜야만 한다.

시험적용 부위는 시험물질과 거즈(gauze)를 유지시키기 위하여 적당한 방법으로 다시 덮어주어 동물이 시험물질을 섭취하지 못하도록 해주어야 한다. 시험물질의 섭식을 방지하기 위해 보조장비를 사용할 수 있으나 완 전히 부동구속하는 것은 권장할 만한 방법은 못된다. 노출기간의 종료시 에는 남아있는 시험물질은 물이나 적당한 용매를 사용하여 제거한다.

4.3 독성증상 평가

각 시험군마다 시험시작시의 동물수, 각 용량군의 개개 동물의 사망시 간, 독성의 징후를 보이는 동물수, 독성의 영향 및 부검소견 등을 관찰하 여 평가한다. 시험물질에 의한 고통과 괴로움 때문에 동물을 안락사시킨 경우에는 시험물질에 의한 사망으로 기록한다.

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LD50의 결정은 일반적인 방법, 예를 들면 Bliss, Litchfield and Wilcoxon, Miller and Tainter, Weil 등의 방법에 따라 구한다.

5.0 References

(1) Work on hazard characteristics - Approach to Basel Convention hazard characteristic H11 : characterization of chronic or delayed toxicity

(2) Appendix C : C5 Assessment of Hazards H5/H6 : Harmful and Toxic (3) OECD Test Guidelines : TG 402

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그림22. 경피독성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차

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다. 독성 시험방법

급성흡입독성시험

1.0 개요

1.1 목적

이 시험은 흡입경로로 흡입가능한 물질(가스체, 휘발성 물질 또는 입 자상물질)의 단기간 노출에 의해서 나타날 수 있는 건강장애(adverse health effect)를 평가하는데 그 목적이 있다.

1.2 적용범위

이 시험방법은 시험동물의 보호를 위해 치사량 이상의 물질 노출을 가 급적 피하고, 치사량 이하의 용량에서 흡입을 통하여 독성증상을 관찰하 는 방법이며, Basel 협약에 의한 유해특성 시험방법을 기초로 하여 선정 하였다.

2.0 용어 정의

2.1 급성흡입독성

흡입가능한 물질을 단기간(24시간이내)에 1회 흡입노출 시켰을 때 시 험물질에 의해 나타나는 악영향

2.2 LC50 (median lethal concentration)

시험물질에 노출 후 일정시간 또는 노출 중에 시험동물의 반수를 사망 시킬 수 있는 물질의 농도

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3.0 시험 준비

3.1 시험동물

여러 종류의 포유동물을 사용할 수 있으며 바람직한 종은 랫드이나 일반 적으로 실험실에서 사용되는 계통을 사용하도록 한다. 시험에 사용하는 동물 개체간 또는 군간의 체중변동은 평균체중의 ±20％를 초과하지 않아야 한다.

각 농도군에 적어도 10마리(암컷 5마리, 수컷 5마리)를 사용한다. 암컷 은 출산의 경험이 없거나 임신하지 않은 동물을 사용해야 한다.

시험동물실의 온도는 22±3℃, 상대습도는 30～70％를 반드시 유지시킨 다. 인공조명으로 할 경우 매 12시간 간격으로 점멸한다. 사료는 일반적으 로 널리 쓰는 것을 사용하며, 음료수는 자유로이 섭취시킨다.

동물은 성별 군으로 사육해야 하며, 케이지당 동물수는 개개의 동물을 충분하게 관찰할 수 있는 범위로 한다.

3.2 시험물질

흡입독성시험법의 시험물질은 시료가 기체(가스) 상태인 경우에만 적 용한다.

4.0 시험방법

4.1 원리

몇 개의 군으로 나눈 시험동물에 1군 1농도로 시험물질을 일정기간 노 출하는데, 이 때 노출환경 중에서 적절하게 농도를 유지하기 위하여 용매 를 사용하는 경우에는 용매 노출군을 설정해야 한다. 그 후에 여러 가지 시험물질에 의한 영향이라든가 사망에 대한 관찰을 하며, 시험 중에 사망 한 동물은 부검하고 시험 종료 시에도 생존한 동물은 도살하여 부검한다.

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4.2 시험물질투여

노출직전에 시험동물의 체중을 측정하고, 지정한 장치에서 시험농도로 4시간 노출한다. 시험온도는 22±2℃로 유지해야 한다. 이상적인 상대습도 는 30～70％로 하지만 특별한 경우(예:aerosol의 시험)에는 이 조건은 실 행할 수 없다. 노출 중에는 먹이를 주지 않고 경우에 따라 물도 주지 않 는다.

4.3 독성증상 평가

성적은 각 군마다 시험개시시의 동물수, 개별동물의 사망시간, 독성징 후를 나타낸 동물수, 독성변화 및 부검소견을 관찰하여 정리한다.

LC50의 결정은 일반적인 방법, 예를 들면 Bliss, Litchfield and Wilcoxon, Miller and Tainter, Weil 등의 방법에 따라 구한다.

5.0 References

(1) Work on hazard characteristics - Approach to Basel Convention hazard characteristic H11 : characterization of chronic or delayed toxicity

(2) Appendix C : C5 Assessment of Hazards H5/H6 : Harmful and Toxic (3) OECD Test Guidelines : TG 403

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그림23. 흡입독성 시험분석방법 및 판정절차

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라. 발암성 시험방법 : OECD H7

발암성 시험방법

1.0 개요

1.1 목적

이 시험방법은 시험물질을 동물의 전생애에 걸쳐 연속투여하고, 시험 물질의 발암성 유무를 밝히는데 목적이 있다.

1.2 적용범위

발암성 시험방법은 OECD에 규정된 유해특성 시험방법을 기초로 하였 으며, 시험동물은 자연적 종양발생과 화학물질에 대한 종양 발현의 특성 정보가 존재하는 동물종에 적용한다.

2.0 용어 정의

발암성(Carcinogenic) : 적정 경로를 통하여 노출되었을 때 시험동물에 신생물(neoplasm)을 유발시키는 화학물질의 성질

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3.0 시험 준비

3.1 시험동물

마우스, 랫드 등 2종이상의 암수를 이용한다. 일반적으로 자연 종양발 생율, 화학물질에 대한 감수성 등 생물학적 특성이 잘 알려진 동물종이나 계통의 근교계나 그 1대 잡종을 이용한다. 이때 종양의 자연발생율이 낮 은 것을 이용한다.

시험동물의 연령은 5~6 주령의 균등한 체중의 동물을 이용한다. 시험 동물의 개체수는 각 군마다 암수 각각 50마리 이상으로 한다.

3.2 시험물질

발암성 시험의 시험물질은 시료의 상태(액체, 고체, 반고체)에 관계없 이 사료나 음료수에 첨가하여 투여하여 적용한다.

4.0 시험방법

4.1 원리

발암성 시험방법은 동물의 전생애에 걸쳐 시험물질을 일정한 시각에 연속투여하고, 시험물질에 기인하는 종양성 병리적 변화로 인한 사망에 의해 시험물질의 발암성을 평가한다.

4.2 시험물질투여

시험물질은 사료나 음료수에 첨가하여 투여하는 방법을 이용하며, 시 험물질의 농도는 사료 첨가 시 5%(w/w) 이하로 한다. 시험물질의 성상에 따라 사료에 첨가하기 힘든 경우에는 비경구투여도 가능하다.

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시험물질은 시험동물의 거의 전생애에 걸쳐 투여하며, 마우스나 햄스 터는 18개월 이상, 랫드는 24개월 이상 투여한다. 그러나 마우스와 햄스터 에서 18개월, 랫드에서 24개월이 됐을 때 시험물질에 기인하는 종양성 병 변이외의 원인에 의한 사망률이 50% 이내인 것으로 알려진 동물종이 필 요하다.

4.3 독성증상 평가

매일 임상적으로 특이사항을 검사하고 독성발현 여부를 주의깊게 관찰 하여야 하며, 관찰된 이상상태, 독성증상과 시험물질 투여량(dosage)과의 관계에 대해서는 적절한 통계학적 수법을 이용하여 처리한다.

5.0 References

(1) OECD Test Guidelines : TG 451

(2) Appendix C : C7 Assessment of Hazards H7 : Carcinogenic (3) 국립환경과학원 고시 제2013-2호 : 화학물질유해성시험방법

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그림24. 발암성 폐기물의 시험분석방법 및 판정절차