흰 쥐 자 궁 에 서 스 테 로 이 드 호 르 몬 에 의 한 c - F os , CREB , A T F 및 H S P70 의 발 현 에 관 한 연 구
이 영 기*, 김 성 례
이화여자대학교 의과대학 의학과 및 의과학 연구소 분자생물학부,
*제주대학교 의과대학 조직학교실
Effe ct of S teroid Horm one s on the Ex pre s s ion of c - F os , CREB , A T F , and H S P70 in R at U teru s
Y oun gk i L ee*, S un g Ry e Kim
D ept of Biology , Colleg e of M edicin e, E w h a W om an s Un iv er sit y , S eou l, D ept of H ist olog y*, Colleg e of M edicin e, Ch eju N at ion al Univ er sity , Ch ej u , K or ea
F ootn ot e : 본 연구는 1996년도 교육부 학술연구조성비(기초의학 96- 204)에 의하여 연구되었음.
Cor r e spon den ce :
S un g Ry e Kim , P h .D . Dep ar tm en t of Biology Colleg e of M edicin e E w h a W om an s Univ er sit y S eoul 158 - 056, K or ea
T el ) 02- 650- 5761
=A b s tract =
S t er oid h or m on e is kn ow n t o cau see t h e dy n am ic ch an g e s of m am alian u t eru s dur in g r epr odu ct iv e cy cle. H ow ev er th er e is lit t l inform at ion ab out t h e effect of estr og en (E ) an d pr og est er on e (P ) on t h e ex pr es sion of v ar iou s tr an scr ipt ion fa ct or s in v olv ed in g en e ex pr e s sion . T hu s th e pr esen t stu dy w a s design ed t o dem on st r at e E an d/ or P - in du ced ex pr e s sion of c - F os , CRE B , A T F an d H S P 70 in r at u t eru s .
Rat s , ov ar iect om ized (OV X ) for t w o w eek s , w er e div ided int o 6 ex per im ent al g r ou p s , 1) OVX , 2) OV X +V , 3 ) OV X +E , 4 ) OV X +P , 5 ) OV X +E +V , 6 ) OVX +E +P , an d w est er n b lott in g a s say for n u clear ex tr act an d im m u n ohist och em ical st ain in g w er e car r ied ou t for each ex per im ent al g r ou p .
T r eat m en t of E (10μg ) sh ow ed t o in cr ea se th e ex pr es sion of c - F os , CRE B , A T F , an d H S P 70, an d m ax im al ex pr es sion w a s occur ed at 3 - 6 h r aft er E adm in istr at ion . P (1m g ) also in cr ea s ed, but m u ch les s t h an E , t h e ex pr es sion of c - F os , A T F , an d H S P 70.
H ow ev er , P did n ot r ev eal any effect on t h e ex pr es sion CRE B . P t r eat m ent 4 hr aft er E inj ect ion decr ea sed c - F os , CRE B , an d A T F ex pr es sion , but did n ot sh ow any ch an g e in t h e E - in du ced H S P 70 ex pr es sion . In im m u n ohist och em ical st u dy c - F os - , CRE B - , an d A T F - im m u n or eact iv it ies w er e confin ed t o t h e cells of lu m in al epit h elium of u t er in e en dom et r iu m . T h ese r esu lt s su g g est th at pr olifer at ion an d differ en tiat ion of r at u t er u s du rin g r epr odu ct iv e cy cle m ay m ediat ed v ia ex pr es sion of t r an s cr iption fact or s , su ch a s c - F os , CRE B , A T F , an d H S P 70.
K ey W or d : Ut er u s , Ov ar iect om y , S t er oid h or m on e, T r an s cr iption fact or , W est er n blot tin g , Im m u n ohist och em ist r y
서 론
포유류의 자궁은 발정주기 (estr ou s cy cle)를 통하여 형태적, 기능적으로 변화하고 있으 며, 또한 수정된 배자를 착상시켜서 이것이 새로운 생명체로 분화해 갈 수 있도록 자궁 조 직세포의 분화가 활발하게 일어 나고 있다. 이와 같은 자궁내 조직의 분화는 시상하부- 뇌 하수체- 생식샘 축 (hypothalam u s - pituitary - g odadal ax is ) 에 의해 조절되는 estr og en과 pr og est er on e의 작용에 의해서 유도되고 있음이 알려지고 있다 (F inn & M ar tin , 1969; Cook
& H un t er , 1978 ; Kim & Ch o, 1982). 그러나 자궁속막 (en dom etr ium )은 자궁내강상피세포 (lu m in al epit h elial cell ), 자궁샘상피세포 (g lan dular epith elial cell ) 그리고 기질세포 (st r om a cell ) 등 여러 형태의 세포로 구성되어 있는 복잡한 구조이며, e st r og en과 pr og e st er on e의 두 호르몬도 성주기에 따라 뇌하수체에서 분비되는 생식샘자극호르몬 (gonadotr ophin s )에 의해 주기적으로 조화를 이루며 분비되고 있다.
한편 지난 몇년간에 걸쳐 pr oto- on cog ene인 c- fos가 다양한 자극에 반응하여 그 발현이 유도된다는 사실이 밝혀지고 있다. c- fos는 각종 성장인자, ion s , 스테로이드 호르몬 등에 의 해서 중추신경조직 및 말초조직에서도 발현되며 발생과정에서의 세포분화나 세포분열에도 관여하는 것으로 알려진 imm ediate early gen e (IE G)이다 (Curran & M or gan s , 1987). 또한 c - F os는 c - ju n의 산물과 h et er odim er 를 이루어 DNA 의 A P - 1 sit e에 결합으로써 다른 유전 자의 발현을 조절하는 tran scription fact or이며 근래에는 CRE B (cy clic A M P r espon siv e elem en t b in din g pr ot ein ), A T F (act iv at ion t r an s cr ipt ion fact or ) 등도 c - F os 혹은 c - Jun 과 dim er를 이루는 것으로 알려지고 있다 (P en ny pa ck er et al., 1995 ).
최근 estr og en은 자궁조직 및 중추신경계통에서 c- fos의 발현을 유도하며 특히 생쥐와 사람 자궁의 c - fos는 pr om ot er지역에 estr og en에 반응하는 ERE (estr ogen r espon siv e elem en t )를 가지고 있는 것으로 알려지고 있다 (Hy der & S t an cel, 1994 ). 이러한 사실은 발 정주기에 따라 혹은 임신의 초기에 스테로이드호르몬에 의해 세포분화 또는 세포분열이 역 동적으로 일어나는 자궁속막조직에서 estr og en이 그 수용체와 결합한 후 c- fos의 pr om ot er 에 결합함으로써 c - fos의 발현을 유도하고 그 결과로 세포분열이나 세포분화와 같은 자궁속 막의 여러가지 변화 (lat e r espon se effect )를 유발하는 것으로 추측할 수 있다. 그러나 자궁 속막조직에서 스테로이드 호르몬과 스테로이드 호르몬의 수용체, 그리고 c- fos , c- jun ,
A T F , CRE B 등을 비롯한 세포분열 및 세포분화에 관여하는 것으로 알려진 t r an s cr ipt ion fact or s와의 상호관계에 대한 연구는 아직 미미한 실정이다. 또한 est r og en의 처리에 의해 자궁조직에서 여러 종류의 h eat sh ock pr otein (HSP )이 발혀되며 이 pr ot ein의 발현양상은 c - F os의 발현양상과 비슷한 것으로 알려졌으나 est r og en에 의해 이러한 H S P s 이 자궁조직 의 어느 부위에서 생성되는지 그리고 c- F os가 발현되는 세포와는 어떤 관련성을 가지는가 에 대한 문제는 아직 전혀 알려지지 않고 있었다.
따라서 본 연구는 난소를 절제한 흰쥐에서 ster oid horm on e에 반응하여 위에서 언급한 여러가지 t r an s cr iption fact or 와 h sp - 70의 발현을 w est ern blot t in g a s say 와 im m un ohist och em istr y 를 이용하여 관찰함으로써 자궁속막의 분화와 관련된 기작의 일면을 밝히고자 수행하였다.
재 료 및 방 법
(1) 실험동물 및 처리
본 실험에 사용된 흰쥐는 이화여대 의과대에서 사육하는 성숙한 암컷의
S pr agu e - Daw ley st r ain 이다. 실험목적에 따라 발정주기는 자궁질 도말법에 의해 확인하여 2회 이상 정상적인 발정주기를 갖는 것을 사용하며 난소제거용 실험에 사용될 흰쥐는 난소 제거 후 2주일 경과 후 estr og en (5 u g estr adiol in 10 % ethan ol/ saline + 5 u g estadiol b en zoat e (E B ) in s esam e oil ) 및 pr og est er on e (1 m g in s esam e oil )을 실험군에 따라 피하 투여하였다. 실험군으로는 1) OVX , 2) OVX + v ehicle, 3) OVX + E , 4) OVX + P , 5) OVX + E + P 으로 나누어쓰며 각 군에 3마리씩 배정하였다.
(2) W est er n Blott in g
흰쥐를 decapit ation 한 후 ut er u s를 적출하며 nu clear pr ot ein ex tr act ion 은 H ag en du chle등 (1992)의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉 u t er u s를 h om og en izat ion b uffer (15 m M T r is pH 7.5, 60 m M K Cl, 15 m M N aCl, 0.15 m M sper m in e, 0.15 m M sper m idin e, 14 m M β- m er capt oet h an ol, 0.5% N P - 40, 10μM T P CK , 0.5 m M P M S F , 0.3 M su cr ose )에 넣어 균질화하여 50- 100 ㎛ m esh 로 filt er at ion한 후 0.9M su cr ose pad에 넣 어 3,500 rpm 으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 nucleu s pellet을 얻었다. Low salt buffer (20 m M T r is pH 8.0, 25% g ly cer ol, 1.5 m M M g Cl2 , 0.2 m M E DT A , 0.5 m M DT T , 0.02 M K Cl, 0.2 m M P M S F ) 에 넣어 stir r in g하면서 high salt b uffer (low salt buffer 의 0.02 M K Cl 대신 1.2 M K Cl)을 fin al con c .이 0.3M 이 되게 첨가하여 1시간동안 stir r in g하였 다. 17,000 r pm 으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 nu clear pr ot ein 을 얻어 L ow er y m et h od에 의해 단백질정량을 한 후 W est er n bloot in g 에 사용하였다. 전기영동은 10%
S D S - P A GE 로 시행하였으며 전기영동이 끝난 후 s em i- dry elect r oph or et ic t r an sfer m et h od 에 의해 단백질을 gel로부터 N C paper로 이동시켰다. 제1항체를 1:1000으로 희석한 후 24시 간 동안 반응 시켰으며 biotinylat ed secon d antibody , av idin labelled alkaline phosphat ase 로 각각 2시간 동안 반응시켰다. 발색은 chem ilunin escent sub str at e인 CSPD (T r opix )를 사
용하며, Am er sh am hyperfilm 으로 2시간동안 감광시켰다.
(3 ) 면역조직화학적 염색
흰쥐를 ethyl ether (Jun s ei)로 흡입 마취시킨 후 흉곽을 절개하여 심장을 노출시킨 뒤 좌심실을 통하여 생리식염수와 0.1M ph osph at e bu ffer (pH 7.4)에 녹인 4%
p ar afor m aldeh y de 고정액을 관류시켰다. 그 다음 복강을 열고 자궁를 적출한 다음 동일한 고정액에 4시간동안 후고정을 하였다. 고정된 자궁은 냉동 절편을 위해서 20% su cr os e 용 액에 넣어 4˚C에서 ov ernight 시켰다. 다음날 냉동용 포매제인 OCT com poun d로 포매한 후 액체질소에 중탕한 에탄올에 넣어 얼렸다. 냉동절편기 (R eichert Jung cry ostat )로 25μm 두께의 연속절편을 얻은 후 0.01M phosph ate buffer ed s aline (pH 7.4)으로 2- 3번 수세하고 면역염색용 dish로 옮겨 fr ee- floating m ethod 혹은 gelatin - coat ed slide에 부착하여 면역조 직화학적 염색을 시행하였다. 내인성 per oxidase를 억제하기 위하여 3% H2O2로 10분간 처 리하고 PBS로 10분씩 3회 세척하였으며, 또한 비특이성 반응을 제거하기 위해 norm al goat s er um 을 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 여분의 혈청을 제거하고 제1항체를 4˚C에서 ov er n ig ht 시킴으로써 항원- 항체 반응을 유도하였다. 제1항체의 조직내로의 투과성을 높히기 위해 T rit on X - 100을 0.4%가 되도록 PBS에 첨가하여 (이하 PBST x로 함)만든용액에 1:500 정도로 희석하여 사용하였다. 1차 항체로 반응시킨 조직은 P BST x 로 30분씩 3회 세척한후, 제2항체인 biotinylat ed goat anti- r abbit im munoglobulin G (Vector )를 1:100으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. P BS T x 로 다시 3회 세척하고 p er ox ida se - lab elled av idin (V ect or )를 1:500으로 희석하여 1시간 동안 반응시키고 같은 방법으로 세척한 후 기질액에 넣어 갈색의 침적물을 확인하였다. 이때 사용한 기질액은 3,3 ' - diaminoben zidin e (Sigm a ) 20m g을 100m l 의 PBS에 포화시켰으며 정색반응 직전에 과산화수소를 0.005%가 되도록 첨가하여 5분동안 반응시켰다. 방법론적 특이성을 규명하기 위해서 1차 항체 대신 PB S를 대신사용하며 면역 염색을 하여 염색반응이 나타나지 않은 것을 관찰하였으며, 또한 본 연구에 사용한 1차 항
체의 특이성을 검증하기 위해서는 제1항체를 1: 500으로 희석한 1m l의 용액에 각각의
ant ig en s을 10μg첨가하여 제1항체 대신 사용함으로써 그 특이성을 규명하였다.
결 과
E st r og en을 처리한 후 시간대별로 흰쥐의 자궁을 적출하여 c - F os와 H S P 70의 발현을 W est er n Blott in g으로 관찰한 결과 c - F os는 1시간이 경과한 후 발현되기 시작하여 3 - 6시간 대에 최고로 발현되었으며 12시간 이후에는 급격히 감소되는 양상을 보여 주었으며 ( F ig . 1), CRE B , A T F 의 경우에서 비슷한 발현양상을 관찰할 수 있었다. 반면에 H S P 70은 e st r og en에 의해서 1시간대에 발현되기 시작하여 3- 6시간 경과후에 최대로 발현되었으나 12 시간 이후에도 어느정도 유지되었다 (F ig . 2).
한편 스테로이드호르몬에 의한 c- F os의 발현은 estr og en과 pr og est er one에 의해서 모두 증가하는 양상을 보여 주었으나 estrogen에 의해서 그 증가하는 양이 훨씬 컸으며(약 18배), e st r og en을 투여한 후 24시간 후에 pr og est er on e을 함께 투여한 군에서는 오히려 est r og en 을 투여하고 24시간 후에 saline을 투여한 군에 비해 c- F os의 발현이 감소하는 것으로 나타 났다 (F ig . 3). CREB의 경우는 pr ogester one은 거의 영향을 주지 않았으며 estr og en을 투여 한 경우에는 그 발현이 현저히 증가하였다. 그러나 estr og en을 처리하고 24시간 이후에 pr og est er on e을 투여하였을 경우는 대조군 (X +E +V )에 비해 약간 감소하는 양상을 보여주었 다 (F ig . 4). AT F 는 estrogen을 처리했을 때 그 발현이 현저히 증가하였고 pr ogester one을 투여한 경우는 대조군 보다 약간 증가한 것으로 나타났다. E str og en과 progest er on e을 함께 처리한 실험군에서는 대조군보다 약간 감소하는 것으로 나타나 전체적으로 CREB의 경우와 비슷한 양상을 보여 주었다 (F ig . 5). H S P 70은 est og en이나 pr og e st er on e 모두에 의해 그 발현이 증가하는 양상을 보여 주었고 두 스테로이드호르몬을 동시에 투여한 경우에도 증가 한 정도에 별 차이가 없었다 (F ig . 6). 마지막으로 자궁조직의 어느 부위에서 estr ogen에 반 응하여 이러한 pr otein이 발현되는 가를 규명하기 위하여 면역조직화학적방법을 시행하였는 데 이들 모두 자궁속막의 lum inal epith elium 에서 발현되는 것으로 나타났다 (F ig . 7).
고 찰
대부분의 포유류의 자궁조직은 발정주기와 임신기간동안 주기적으로 형태적 및 생리적 변화를 한다. 이 변화는 난소호르몬 즉 estr og en과 pr og est er one 의 조화있는 분비에 의한 것 (Yochim & DeF eo, 1963; Cook & Hunter , 1978)으로 알려지고 있다. 그러나 이들 호르 몬이 어떻게 자궁의 기능을 조절하는지 그 작용기작은 아직 확실히 알려지지 않아서 이를 밝히려는 연구가 여러모로 추진되고 있다. Nelson (1930)은 estr ogen 이 follicular ph ase에서 다량으로 분비되며 자궁조직을 분화시키는데 이것은 pr og est er one보다 앞서 작용한다고 하 였고 M ar cu s 등 (1967)과 F inn 등 (1969)은 이 estr og en이 착상유도요소라고 하였다. lut eal ph a s e에는 pr og est er on e이 자궁으로 하여금 착상을 위한 준비를 하도록 자극을 주며 임신을 유지하도록 한다. 또한 이 시기에는 미량으로 분비되는 estr og en도 착상을 유도하는 역활을 한다는 것이 밝혀졌다 (Sm ith & Bigg er s , 1968). 이상의 보고들로 미루어 볼 때 자궁조직은 follicu lar ph a s e에 est r og en 의 작용이 먼저 있은 후 lut eal ph a se에 pr og est er on e과 est r og en 에 의하여 str om al cell의 성장과 분화가 일어난다고 생각된다. 그러므로 이러한 호르몬의 주기적 분비와 그 양적 균형이 발정주기와 착상, 그리고 임신을 조절할 것이라는 추측을 하 게 된다.
한편 c - f o s 는 성 장 인 자 (g r o w t h f a c t o r )에 반 응 하 여 세 포 분 열 즉 G o stage에 서 S ph ase로 진행하는데 관여하는 유전자를 찾는 과정에서 발견되었으며 (Kelly et al., 1983 ; Gr eenb er g & Ziff , 1984 ) 이 유전자는 성장인자에 의한 자극 이후 수분 이내에 발현되 었다가 곧 소멸되는 특징이 있는 것으로 밝혀졌다 (M uller et al., 1984). c- fos발현의 이러한 특징은 외부의 자극에 대해서 나타나는 세포의 반응을 조절하는 역활을 할 것으로 추측되었 다. 결국 c- F os (c- fos pr ot ein )는 또 다른 IE G인 c- jun의 산물 (c- Jun )과 결합하여 h et er odim er ic t r an scr iption fact or com plex 를 이룬 후 (H alazon et is et al., 1988; K ou zar ides
& Ziff , 1988 ; Rau sch er et al., 1988 ) DN A 의 pr om ot er 지역에 있는 A P - 1 sit e에 결합함으로 써 유전자 (pr obably lat e r espon s e g en e)의 발현을 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Kouzarides
& Ziff , 1988 ; Gent z et al., 1989 ). 그 이후 c - F os와 유사한 구조와 기능을 가지는 F RA s (F os Relat ed A nt ig en s ) 그리고 c - Jun 과유사성을 가지는 Jun - B , Jun - D 등도 발견되었으며 (Coh en & Cu r r an , 1988 ; Ry der et al., 1988 ), 이들은 모두 다양한 조합의 dim er 를 이룬 후
- T GA CT CA - 의 DN A sequ en ce 로 이뤄진 A P - 1 sit e에 결합한다. pr om ot er 의 A P - 1 sit e 에 결합하여 A P - 1 DNA bin din g com polex 형성하는 tr an s cription fact or가 c- F os 혹은 c - Ju n계열으로서 dim er 를 이루나 최근에 이르러서는 이들외에도 cy clic A M P r esp on siv e elem en t bin din g pr ot ein (CRE B ), activ at or t r an script ion fact or (A T F ) 등도 c - F os 혹은 c - Ju n과 h et er odim er 를 이루어 A P - 1 sit e 혹은 CRE 에 결합하는 것으로 보고되고 있다 (H ai & Cur r an , 1991; P enn y pack er et al., 1995 ).
앞서 언급한 바와 같이 생식샘에서 분비되는 estr og en과 pr ogesterone은 단백질합성이 나 세포성장을 조절하는 유전자의 발현을 조절하는 요소이며 (O 'M alley et al., 1983), 특히 e st r og en은 자궁속막의 상피세포에 작용하여 세포분열을 촉진한다 (Qu ar m b y & K or ach , 1984 ). 이러한 est r og en 의 작용이 어떤 기작을 통하여 일어나는가에 대한 문제는 거의 알려 진 바가 없었으나 지난 수년동안 세포분열과 관련된 일련의 pr otoon cog en e이 발견됨으로
써 일단의 해결의 실마리를 제공하게 되었다. 즉 c - fos의 pr om ot er 지역에
e st r og en - est r og en r ecept or com plex 와 결합하는 E RE (estr og en r e spon siv e elem ent )가 존 재하며 (Hy der & St an cel, 1994), north ern a s say에 의해서는 실제로 est og en에 의해서 흰 쥐 뇌의 시상하부와 자궁에서 c- fos 및 c- jun이 발현되는 것으로 보고되었다 (In sel, 1990;
W eis z et al., 1990; Zh en g et al., 1996 ). 한편 estr og en의 처리에 의해 자궁상피세포에서 h eat sh ock pr ot ein (H S P ) m RN A 가 유도되는 것으로 알려지고 있다 (M obb s et al., 1990).
이러한 사실은 estr og en에 의한 HS - 70의 발현양상이 c- fos의 발현양상과 비슷하며 또한 h eat sh ock에 의해서 c - fos가 발현되는 것으로도 알려지고 있으나 (Dr ag n ow et al., 1989 ) 자궁조직에서 estr ogen과 H SP 및 c- F os와의 연관성에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 연구에서 estrogen의 처리에 의해 발현되는 c - F os의 발현양상은 1- 3시간 대에 최고 로 발현되며 그 이후로는 어느정도 감소되는 것으로 나타났다. 이러한 양상은 CREB나 A T F 의 경우에서도 비슷한 모습을 보여주고 있어 c - F os가 CRE B나 A T F 와 h et er odim er 를 이루어 자궁속막의 증식과 분화를 유도하는 유전자 즉 lat e r espon se gen e의 pr om ot er에 결 합함으로써 그 기능을 할 것이라는 사실을 시사하고 있다. 또한 이러한 연구결과는 지금까 지 잘 알려진 바와 같이 신호전달체계에 있어서 pr otein kina se A 와 pr ot ein kin ase C를 통 한 경로 사이의 상호연결성 (cr os s t alk ) 과도 부합되는 결과라 할 수 있다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이 c- fos의 경우에는 pr om ot er에 ERE가 존재하는 것으로 밝혀졌으나 (H y der & S t an cel, 1994 ) CRE B와 A T F 의 pr om ot er 지역에서 E RE 가 존재하는지에 대해서
는 아직 밝혀진 바가 없어 보다 명확한 구명을 위해서는 연구가 더 진행되어야 할 것으로 사료된다. estr og en 처리후 24시간 대에서도 c- F os가 상당히 증가된 채로 유지되고 있었는 데 이것은 c- F os라기보다는 F os - relat ed antigen (F RA )인 것으로 보인다 (Coh en &
Cu r r an , 1988 ; Ry der et al., 1988 ). H S P 70의 경우 다른 연구자들에 의해 보고된 H S P 90과 는 달리 3- 6시간대에 최대로 발현되었다. 본 실험에서는 nuclear pr ot ein만을 측정대상으로 하였기 때문에 두 단백질이 실제로 시간적으로 다른 양상으로 발현되는지는 명확하지 않다.
pr og est er on e에 의해서 c - F os의 발현이 약간 증가하는 것으로 나타났는데 이것은 pr og est er on e이 est er og en 과 더불어 자궁속막의 증식과 분화에 관여하는 호르몬이라는 사실 과 부합되는 결과이며 또한 흰쥐의 시상하부에서 estr og en과 pr ogester one에 의해 GnRH 신 경세포에서 c- F os가 발현된다는 보고 (H offm an et al., 1990; Lee et al., 1992) 와도 일치하 는 결과라 할 수 있다. X +E +P 군의 경우 대조군인 X +E +V 군에 비해 c- F os의 발현이 감 소하는 것으로 나타나 두 호르몬에 의한 부가효과 (additiv e effect )가 관찰되지 않았는데 이것은 pr og est er on e 처리 24시간 전에 estrogen의 처리에 의해 발현된 c- F os가 자궁속막의 증식과 분화를 이미 유도함으로써 나타난 결과로 보이며 이러한 양상은 CRE B나 A T F 의 경 우에도 동일하게 나타났다.
결 론
본 연구는 자궁속막의 세포증식과 분화와 관련하여 스테로이드호르몬이 여러 가지
t r an scr iption fact or와 H S P 70의 발현에 미치는 영향을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었 다.
1) estr og en 의 처리는 c - F os , CRE B , A T F , H S P 70의 발현을 현저히 증가시켰으며, 이들 은 처리후 1시간대에 발현되기 시작하여 3- 6시간대에 최대로 발현되었다.
2) pr og e st er on e의 처리는 c - F os와 H S P 70의 경우는 그 발현을 증가 시켰으나, CRE B와 A T F 의 경우는 영향을 미치지 않았다.
3 ) pr og e st er on e은 estr og en 에 의해 발현이 증가된 c - F os , CRE B , A T F 를 억제하는 것으 로 나타났다.
4 ) 면역조직화학적 염색의 결과 c - F os , CRE B , A T F 는 자궁의 lum in al epit h elium 에 존 재하는 세포에서 estr og en에 의해 발현되는 것으로 나타났다.
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Le g ends for F ig ure s
F ig . 1. T em p or al patt er n of c - F os in du ction by est r og en . A ft er estr og en t r eat m ent r at s w er e sa cr ificed at th e tim e in t erv al in dicat ed ab ov e an d n u clear ex tr act w er e an aly zed for c - F os im u n or eact iv ity u sin g w e st er n blot tin g an aly sis . c - F os lev els ar e ex pr e s sed a s A DU s ov er th e cont r ol w it h out estr og en t r eat m ent . E str og en (10μg )
F ig . 2. T im e cour s e of est r og en - in du ced H S P 70 ex pr e s sion in r at ut er u s .
F ig . 3. L ev els of c - F os in r at u t eru s in du ced by v ar iou s st er oid h or m on al m ileu . T w o w eek s aft er ov ar iect om y , e st r og en (10 μg ) or pr og est er on e (1 m g ) w a s sub cu t an eou sly in tr odu ced an d s acr ificed 3 h ou r s lat er (X +E , X +P ). 24 h our s aft er est r og en a dm inist r ation , pr og est er on e w a s inj ect ed t o X +E t r eat ed g r ou p s an d s acr ificed 3 h our s lat er (X +E +P ).
F ig . 4. E ffect of est r og en an d/ or pr og e st er on e on CRE B in du ct ion in r at ut er u s . F ig . 5. E ffect of est r og en an d/ or pr og est er on e on A T F in du ct ion in r at ut er u s . F ig . 6. E ffect of est r og en an d/ or pr og est er on e on H S P 70 in du ct ion in r at u t eru s .
F ig . 7. Im m u n ohist och em ical localization of esr t og en - in du ced c - F os , CRE B , an d A T F im m u n or eact iv it y in r at ut er u s . CT L , con tr ol gr oup . ×100