서 론
간외담관암은 비교적 드문 암으로 방사선치료와 적극적 근치수술에도 불구하고 그 예후는 좋지 않 다. 많은 경우 담관이나 담관 주위의 림프관, 혈관, 신경을 따라서 전파되어 간동맥, 문맥, 간실질 등 중요한 인접장기에 전이된 후에 발견되어 근치절제 술을 시행하기가 쉽지 않으며, 근치절제를 하여도 국소재발이 많은 것으로 알려져 있다. 반면에 고식
적 수술만 받은 진행된 간외담관암 환자중 장기간 생존하는 경우도 볼 수 있다. 이런 결과에서 보듯이 지금까지 담관암에서 예후와 관련있는 인자로 알려 진 종양의 침윤정도, 림프절 전이, 원격전이에 따른 종양의 병기 및 조직의 세포분화도만으로 전부 설 명할 수 없는 부분이 있다.
최근에 분자생믈학이 급속히 발전하면서 세포의 성장 및 분화에서 성장인자 및 수용체의 역할이 알
Abstract
Significance of EGFR and c-erbB-2 Expression in Extrahepatic Bile Duct Cancer Gil Soo Son, M.D., Sang Yong Choi, M.D., Sung Ock Suh, M.D., and Young Chul Kim, M.D.
Department of Surgery, Korea University College of Medicine
Until now, surgical treatment of bile duct carcinoma has been unsatisfactory. There have been few reports dealing with the clinical significance of epidermal growth factor receptor(EGFR) and c-erbB-2 in bile duct cancer. To evaluate epidermal growth factor receptor(EGFR) and c-erbB-2 protein as a marker for prognosis, we analyzed the data and outcome of 32 cases of extrahepatic bile duct carcino- ma immunohistologically, as well as clinicopathologically. The expressions of EGFR and c-erbB-2 showed in 71.9%(23/32) and 34.4%(11/32), respectively. The expression of EGFR was closely associat- ed with the expression of c-erbB-2 (p<0.05). The expression rate of EGFR was significantly higher in well-differentiated cancer than in poorly-differentiated cancer (p<0.05), but was not related to stage, or lymph node metastasis. The expression of c-erbB-2 was not related to stage, lymph node metastasis, and differentiation. The expressions of EGFR and c-erbB-2 did not correlate with survival. In conclu- sion, the expression of EGFR or c-erbB-2 may be used as a tumor marker, but not as a prognostic fac- tor in extrahepatic bile duct cancer.
Key Words: Extrahepatic bile duct cancer, EGFR, c-erbB-2
고려대학교 의과대학 외과학교실
손 길 수 , 최 상 용 , 서 성 옥 , 김 영 철
려지면서 많은 종류의 암에서 이들을 예후와 관련 지어서 연구하고 있다. 대표적인 성장인자 수용체 로서 표피성장인자 수용체(epidermal growth fac- tor receptor)와 c-erbB-2 단백이 잘 알려져 있는데, 이 둘은 같은 종류의 성장인자 수용체(type I growth factor receptor)로서 세포의 성장 및 증식 에 관여하는 물질인 EGF나 TGF-α와 결합하여 타이 로신 키나제를 활성화시킴으로써 세포성장 및 증식 에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.1-3
여러 보고에 의하면 EGFR은 편평상피세포암4이 나 위장관암에서 잘 발현되고, c-erbB-2는 췌장암,5 유방암6, 난소암6과 위선암 등에서 높은 비율로 발 현되는데 많은 보고에서 암의 침습이나 불량한 예 후와 관련이 있는 것으로 보고하고 있다. 그러나 지 금까지 담관암에서 EGFR 및 c-erbB-2에 관한 연구 는 미진한 실정이다.
본 연구는 간외담관암에서 EGFR 및 c-erbB-2의 발현 양상에 따른 기존의 예후인자인 병기, 림프절 전이, 조직의 분화도와의 상관관계를 알아보고 생 존율과의 관계를 분석하여 예후측정의 지표로서 가 치가 있는지 알아보았다.
대상 및 방법
1. 대상
1989년 1월부터 1995년 6월까지 고려대학교 의과 대학 부속병원 외과에서 간외담관암으로 절제수술 받은 환자 32예를 연구대상으로 하였다.
2. 방법
환자는 American Joint Committee on Cancer (AJCC)의 TNM분류법에 기초하여 담관벽의 침윤정 도, 림프절의 침범 및 원격전이 여부에 따라 병기를 I기, II기, III기, IV(IVA+IVB)기로 분류하였고 조직 의 분화도에 따라 고분화암(well differentiated), 중 분화암(moderately differentiated), 저분화암 (poorly differentiated)으로 분류하였다.
각 절제조직의 면역조직화학 염색을 통해 EGFR, c-erbB-2의 발현을 검사하였고, 환자의 입원 및 외 래 기록지의 검토와 전화 및 왕복엽서를 통한 추적 조사를 통해 임상 조직학적 소견 및 생존율을 구하
여 통계적 분석을 하였다.
1) 면역조직화학 염색법
파라핀 포매 조직을 5μm 두께로 절편한 다음 56℃의 항온기에서 30분간 가열하여 슬라이드 에 부착하였다. 실온에서 xylene으로 탈파라핀 과정을 거친 다음 100%, 90%, 80%, 70% 에탄 올로 각각 3분씩 함수시키고, 흐르는 물에 세척 하였다. 세포내의 내인성 과산화 효소의 활성을 억제시키기 위하여 과산화수소-메탄올 용액 (100% methanol 40㎖ + 37% H2O2 1㎖)으로 30분간 처리하고 TBS(Tris buffer saline) 용액 에 씻었다. 일차 및 이차항체의 비특이적 결합 을 방지하기 위하여 정상 염소 혈청으로 20분간 처리한 후, EGFR 의 염색은 1:50으로 희석된 다 클론성 항EGFR 항체(SANTA CRUZ, rabbit polyclonal), c-erbB-2의 염색은 1:50으로 희석 된 다클론성 항c-erbB-2항체(ZYMED, rabbit polyclonal)를 사용하여 각각 도포하고 실온에 서 60분간 반응시켰다. TBS 용액에 수세한 후 이차항체인 biotinylated anti-rabbit and anti- mouse immunoglobulins를 도포하여 실온에서 30분간 반응시키고 TBS 용액으로 다시 3회 세 척하였다. peroxidase-streptavidin을 조직 위에 떨어뜨리고 실온에서 15분간 반응시키고 TBS 용액에 세척한 다음 DAB(diaminobenzidine) 용액으로 발색하고 Mayer’s hemato -xylin으로 대조염색한 후 수돗물에 세척하였다. 에탄올로 점차 탈수하고 xylene으로 처리한 후 수용성 봉 입제로 봉입하여 광학 현미경으로 판정하였다.
2) 염색 결과의 판정
염색 결과의 판독은 환자의 경과를 모르는 2명 의 해부병리과 의사에 의하여 이루어 졌다.
EGFR와 c-erbB-2염색의 판독은 광학현미경 시 야에서 주변의 정상 관상피세포와 대조세포들 이 염색되지 않은 상태에서 세포막과 세포질이 전체적으로 갈색의 과립성을 보이는 종양세포 들이 뭉쳐있는 경우를 양성으로, 염색이 안 되 었거나 주위 대조세포들과 같은 정도로 엷게 염 색된 경우나 짙게 염색된 세포가 있어도 산재되
어 있는 경우는 음성으로 판정하였다(Fig.1, Fig.2).
3) 통계 분석
임상 조직학적 소견들과 EGFR, c-erbB-2 발현 의 관계 및 두 염색의 발현간의 상호 상관관계 분석은 Chi-square법을 이용하여 p<0.05 범위 를 유의하다고 검정하였다. 누적생존율에 대한 생존곡선은 Kaplan-Meier법을 이용하였으며,
생존곡선간의 유의성에 대한 검정은 log-rank 법을 이용하여 p<0.05 범위를 유의하다고 판정 하였다. 이상의 통계 분석은 PC-SPSS 통계 프로 그램을 이용하였다.
Table 1. Clinicopathologic Features (n=32)
Clinicopathologic features No. of cases (%) Age
36 yr - 78 yr (average: 59 yr) Gender
Male 21 (65.6)
Female 11 (34.4)
Stage
I 6 (18.7)
II 8 (25.0)
III 3 (9.4)
IV 15 (46.9)
Lymph Node metastasis
negative 22 (68.7)
positive 10 (31.3)
Differentiation
well differentiated 15 (46.9)
moderately differentiated 15 (46.9)
poorly differentiated 2 (6.2)
Fig. 1. Positive cytoplasmic and membrane
staining with anti-EGFR antibody (x400) Fig. 2. Positive cytoplasmic and membrane staining with anti-c-erbB-2 antibody
결 과
1. 임상 조직학적 소견
환자의 나이별 분포는 36세에서 78세로 평균 59 세였고, 남:여 성별비는 1.9: 1이었다. 병기별 분포 는 I기 6예(18.7%), II기 8예(25.0%), III기 3예 (9.4%), IV기 15예(46.9%)였다. 조직의 분화도별 분포는 고분화암 15예(46.9%), 중분화암 15예 (46.9%), 저분화암 2예(6.2%)로 분류되었다. 림프 절 전이 양상은 림프절 전이가 없는 경우가 22예 (68.7%), 임파절 전이가 있는 경우는 10예(31.3%) 였다(Table 1).
2. EGFR 및 c-erbB-2의 발현율
면역조직화학 염색 결과 총 32예 중 EGFR은 23예
(71.9%), c-erbB-2는 11예(34.4%)에서 발현되었다.
EGFR과 c-erbB-2 두가지 모두 발현된 경우는 10예 (31.3%), EGFR만 발현된 경우는 13예(40.6%), c- erbB-2만 발현된 경우는 1예(3.1%), EGFR과 c- erbB-2 두가지 모두 발현되지 않은 경우는 8예 (25%)였다(Table 2).
3. 임상 조직학적 소견과 EGFR 및 c-erbB-2 발 현과의 상관관계
병기별로 EGFR의 발현율을 보면 I기에서는 50%(6예중 3예), II기에서는 87.5%(8예중 7예), III 기에서는 100%(3예중 3예), IV기에서는 66.7%(15 예중 10예)로 병기와 EGFR의 발현율 사이에는 상 관성을 보이지 않았다(p>0.05). 림프절 전이에 따 른 EGFR의 발현율은 림프절 전이가 없는 22예중 16예(72.7%), 림프절 전이가 있는 10예중 7예 (70%)로 림프절 전이와 EGFR의 발현율 사이에는 상관성을 보이지 않았다 (p>0.05). 조직의 분화도 에 따른 EGFR의 발현율은 고분화암 15예중 12예 (80%), 중분화암 15예중 10예(66.7%), 저분화암 2 예중 1예(50%)로 고분화암에서 EGFR의 발현율이 높았으나 통계적 유의성은 없었다(p>0.05)(Table 3).
병기별 c-erbB-2의 발현율을 보면 I기에서는 33.3%(6예중 2예), II기에서는 50%(8예중 4예), III 기에서는 33.3%(3예중 1예), IV기에서는 26.7%(15 예중 4예)로 병기와 c-erbB-2의 발현율 사이에는 상관성을 보이지 않았다(p>0.05). 림프절 전이에 따른 c-erbB-2의 발현율은 림프절 전이가 없는 22 Table 2. Expression of EGFR and c-erbB-2
Expression c-erbB-2 Case (%) positive negative
EGFR
positive 10 13 23 (71.9) negative 1 8 9 (28.1) Case (%) 11(34.4) 21(65.6)
Table 3. Correlation between c-erbB-2, EGFR Expression and Clinicopathologic Factors.
EGFR (%) c-erbB-2(%) Stage
I 3/6 (50.0) 2/6 (33.3) II 7/8 (87.5) 4/8 (50.0) III 3/3 (100) 1/3 (33.3) IV 10/15 (66.7) 4/15 (26.7) Lymph Node metastasis
negative 16/22 (72.7) 8/22 (36.4) positive 7/10 (70.0) 3/10 (30.0) Differentiation
well- 12/15 (80.0)＊ 4/15 (26.7) moderately- 10/15 (66.7) 7/15 (46.7) poorly- 1/2 (50.0) 0/2 (00.0)
＊ ; statistically significant (p<0.05)
Table 4. Correlation between EGFR and c- erbB-2 Expression
No. of c-erbB-2 EGFR cases positive (%) positive (%) EGFR
positive 23 10 (43.5)＊
negative 9 1 (11.1) c-erbB-2
positive 11 10 (90.9)＊
negative 21 13 (61.9)
＊ ; statistically significant (p<0.05)
예중 8예(36.4%), 림프절 전이가 있는 10예중 3예 (30%)로 림프절 전이와 c-erbB-2의 발현율 사이에 는 상관성을 보이지 않았다(p>0.05). 조직의 분화 도에 따른 c-erbB-2의 발현율은 고분화암 15예중 4 예(26.7%), 중분화암 15예중 7예(46.7%), 저분화암 2예중 0예(0%)로 조직의 분화도와 c-erbB-2의 발현 율 사이에는 상관성을 보이지 않았다(p>0.05) (Table 3).
4. EGFR과 c-erbB-2 발현의 상관성
EGFR 발현중 c-erbB-2 발현은 43.5%(10/23)였고 EGFR 비발현중 c-erbB-2 발현은 11.1%(1/9))였으 며, c-erbB-2 발현중 EGFR 발현은 90.9%(10/11)였 고 c-erbB-2 비발현중 EGFR 발현은 61.9%(13/21) 로 EGFR과 c-erbB-2 발현 사이에는 유의한 상관성 을 보였다 (p<0.05).
5. EGFR 및 c-erbB-2 발현과 생존율
EGFR의 발현 여부에 따른 2년 누적생존율은 EGFR 발현군에서 21.2%였고 비발현군에서 32.5%
로 EGFR의 발현군에서 낮았으나 통계적으로 유의 하지는 않았다(p>0.05)(Fig.3). c-erbB-2의 발현 여 부에 따른 2년 누적생존율은 c-erbB-2 발현군에서 27.34%였고 비발현군에서 33.8%로, c-erbB-2의 발 현군에서 낮았으나 통계적으로 유의하지는 않았다 (p>0.05)(Fig.4).
고 찰
현재까지 밝혀진 약 20여종의 원종양유전자(pro-
tooncogene)중에서 3가지가 성장인자나 성장인자 수용체와 연관이 있는 것으로 밝혀져 있다. c-sis 유 전자는 PDGF(platelet derived growth factor)에 대 한 것이고, c-fms는 대식세포의 CSF-1(colony stim- ulating factor) 수용체에 대한 것이며, c-erbB는 EGFR(epidermal growth factor receptor)에 대한 유전정보를 가지고 있다.7 이중에서 c-erbB-1은 표 피성장인자 수용체에 대한 유전정보를 가지고 있는 원종양유전자이고, c-erbB-2은 표피성장인자 수용 체와 유사한 어떤 수용체에 대한 유전정보를 가지 는 원종양유전자이다.8
표피성장인자 수용체는 세포막 내외에 걸쳐 존재 하는 당단백으로서, 표피성장인자가 붙는 세포외영 역(extracellular EGF binding domain), 짧은 소수 성 막영역(transmembrane domain), 타이로신 키 나제(tyrosine kinase)의 세포내영역(cytoplasmic domain)으로 이루어져 있는데, 세포의 성장 및 증 식에 관여하는 물질인 EGF나 TGF-α와 결합하여 타 이로신 키나제를 활성화시킴으로써 세포성장 및 분 화에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.1,2EGFR는 c-erbB-1으로 명명된 염색체 7번에 위치하는 암유 전자의 산물로 주로 편평상피세포암에서 잘 발현되 나 위장관암에서도 발현되며, 암세포의 증식에 중 요한 역할을 한다.4
Cheifetz 등은 EGFR의 발현여부로 양성과 악성 담관질환을 구별할 수 있는지 알아보기 위한 동물 실험에서 EGFR은 담관의 증식에 큰 역할을 못하므 Fig. 3. Cumulative survival rate according to
EGFR expression (p>0.05) Fig. 4. Cumulative survival rate according to c- erbB-2 expression (p>0.05)
로 EGFR의 발현이 양성과 악성 담관질환을 감별하 지는 못 한다고 발표하였다.9 Lee 등은 담관암에서 높은(6/8; 86%) EGFR 면역반응을 보였으나, 염증 이나 선종같은 비악성 질환에서는 EGFR의 발현이 미약하다고 발표하였다.10元島幸一 등은 63예의 담 관암에서 EGFR 면역염색을 시행한 결과 림프절 전 이와는 상관성이 없으나 병기가 진행된 경우에 잘 발현되며 낮은 생존율과 연관이 있다고 보고하였 다.11 그러나 본 연구결과에서는 간외담관암에서 EGFR의 발현율이 71.9%로 높이 나타나서 암표식 자로서의 가치를 보여주고 있으나, 병기의 진행이 나 림프절 전이 및 생존율과 연관성이 없어서 元島 幸一 등의 결과와 상충되었다. 이런 결과의 차이를 판명하기에는 담관암에서 EGFR의 발현에 관한 연 구결과들이 너무 부족한 단계이며 앞으로 이 분야 에서 더 많은 결과들을 기대한다.
c-erbB-2 유전자는 원래 ethyl nitrosourea에 의해 유도된 쥐의 신경아세포종에서 발견된 HER-2/neu 종양유전자와 상응하는 사람의 원종양유전자로 17 번째 염색체의 장완에 위치한다.12,13 이 원종양유전 자의 mRNA는 4.8 kilobase이며 유전자 산물은 타 이로신 키나제의 활성을 갖는 분자량 185 kD의 당 단백(p185neu)으로 알려져 있고, 표피성장인자 수 용체와 구조적 유사성을 가지고 있어14이 수용체와 같은 기능을 할 것으로 추측하고 있으나 아직 어떤 배위자(ligand)와 결합하는지 정보가 불충분하여 확실히 밝혀져 있지 않다. 여러 보고에 의하면 c- erbB-2 유전자의 발현은 췌장암,5 담도암,15 유방암 과 난소암6등 많은 암에서 발견되는데, c-erbB-2의 발현이 폐,16자궁경부,17유방18및 두경부암19에서 암 의 침습 및 전이와 관련이 있는 것으로 보이며, 유 방암과 난소암의 경우 c-erbB-2 유전자의 발현이 있는 환자의 예후가 불량하며, 위암에서는 논란이 많으나 불량한 예후와 관련이 있다는 보고가 많 다.20
Chow 등은 비대 담관세포에서는 c-erbB-2가 발 현되지 않으나 담관암의 1/4 - 2/3에서 c-erbB-2가 발현되어 암표식자로서 이용될 수 있으나, 병리조 직학적 등급이나 종양의 병기와는 상관성이 없어서
종양의 침습성과는 연관이 없다고 보고하였다.21 Motojima 등은 담관암에서 c-erbB-2의 발현율이 높고, 특히 병기가 진행될수록 높이 발현되며, c- erbB-2의 발현시 낮은 생존율을 보여서 담관암에서 c-erbB-2가 예후인자로서의 가치가 있음을 보고하 였다.22 본 연구결과에서는 34.4%에서 c-erbB-2의 발현율을 보였으나, 종양의 병기, 림프절 전이, 조 직의 분화도 및 생존율과 연관성을 보이지 않아서 예후인자로서의 가치는 없었다.
이상을 정리하여 보면 간외담관암에서 EGFR이나 c-erbB-2의 발현은 각각 71.9%, 34.4%에서 발현되 어서 담관암의 표식자로서의 가치는 인정되나, 병 기나 조직의 분화도 및 생존율과 연관성을 보이지 않아서 예후인자로서의 가치를 가지지는 못하였 다.
요 약
(목적): 간외담관암에서 EGFR 및 c-erbB-2의 발 현 양상과 병기, 림프절전이, 조직의 분화도 및 생 존율과의 관계를 분석하여 예후측정의 지표로서 가 치가 있는지 알아보기 위하여, (방법): 간외담관암 으로 절제수술 받은 32예를 대상으로 면역조직화 학 염색을 통해 EGFR, c-erbB-2의 발현을 검사하였 고, 임상 조직학적 소견 및 생존율과 비교하여 다음 과 같은 결과를 얻었다. (결과): 32예중 EGFR은 71.9%(23예), c-erbB-2는 34.4%(11예)의 발현율을 보였다. EGFR, c-erbB-2의 발현은 병기, 조직의 분 화도 및 림프절 전이와 상관성을 보이지 않았다. c- erbB-2의 발현은 EGFR의 발현과 연관성이 있었다.
EGFR와 c-erbB-2의 발현군과 비발현군 사이에 2년 생존율의 차이는 없었다. (결론): 간외담관암에서 EGFR, c-erbB-2는 높은 비율로 발현되어서 암의 표 식자로서 가치는 인정되지만, 예후인자로서의 가치 를 가지지는 못하였다.
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