임상약동학특론#5
Quercus acuta Thunb. (Fagaceae) 추출물의 활성 성분 분석 및 생물학적 효과 평가
참고문헌: Molecules 2018, 23, 1772;
doi:10.3390/molecules23071772
Quercus acuta (붉가시나무)
• Quecrcus acuta(붉가시나무) – 참나무과
• Quecrcus acuta는 한국, 중국, 일본 및 대만의 남부 에 널리 분포되어 있음.
• 주로 일본에서 관상용 식물로 재배되며 과일 (도토 리)은 한국에서 인기있는 전통 음식인 도토리 묵의 주 성분.
Quercus acuta Thunb.
• QA 추출물과 그 활성 성분의 약리학적 활성에 대한 연구는 소수에 불과
Quercus acuta Thunb.
• QA 잎의 에틸 아세테이트 추출물과 그 12 가지 활성 성분의 강력한 xanthine 산화 효소 및 antihyperuricemic 활성이 보고됨
• 다양한 용매 및 마커 화합물에 대한 추출 조건의 최적화 수행되지 않음
• 다양한 QA 추출물의 약리학적 효과를 보고한 상기 문헌은 향후 QA 추출물을 함유한 의약품 및 기능성 식품의 추가 개발을 기대할 수 있지만 아직 긍정적인 결과는 보고되지 않음
• QA 잎 추출물의 항균 효과에 대한 연구 없음
본 연구에서 생물학적 활성 및 식물 화학적 프로파일과 관련하여 최적 추출 조건을 결정하기 위 해 헥산, 에틸 아세테이트, 아세톤, 에탄올, 메탄올 및 물을 사용한 다양한 QA 잎 추출물 제조, GC-MS와 HPLC를 다양한 용매로 제조 된 추출물의 화학적 프로파일링에 사용.
최적화 된 QA 잎 추출물의 항산화 및 항균 활성을 조사
Quercus acuta Thunb.
QA 잎 분말을 실온에서 48시간 동안 헥산, 에틸 아세테이트, 아세톤, 에탄올 및 메탄 올 (100 mL)로 4시간 추출
용액을 증발시켜 건조시키고, 추가실험을 위해 -20℃에서 저장
Plant material and extact preparation
Chromatographic conditions
GC-MS 분석을 위해 메틸렌 클로라이드에서 개별 적으로 추출
각 샘플 최종 부피를 0.5 mL로 조정하여 트리플 루오르 아세트 아미드를 사용하여 분석 전에 각 분취량을 실릴화 하여 성분을 유도체화 함
이 연구에서 개발된 HPLC 방법을 사용하여 QA 잎 추출물의 catechin, epicatechin 및 taxifolin 함량을 정량적으로 측정.
Quercus acuta Thunb.
Parameters conditions
Column Zorbax extended-C18 (C18, 4.6 mm x 150 mm, 5 µm)
Flow rate 0.8 mL/min
Injection volumn 10 µL
UV detection 230 nm
Run time 35 min
Gradient Time (min) A(%) B(%)
0 10 90
10 10 90
20 20 80
25 30 70
27 100 0
28 10 90
35 10 90
샘플 용액(0.5 mL)을 DPPH 용액 (0.4 mM, 0.5 mL)과 10분 동안 혼합하고 microplate reade를 사용하여 517 nm에서 관찰
라디칼 소거 활성은 다음 식을 사용하여 백분율과 IC
50
(g/mL)값 계산 DPPH Free radical assay
Reducing power assay
추출물의 환원력은 이전 보고된 방법을 사용하여 측정
추출물(0.1 mL), 인산 나트륨 완충액 (0.2 M, 0.5 mL) 및 potassium ferricyanide (1% w/v, 0.5mL)을 혼합하고 50℃에서 20분 배양
반응 정지 후, 원심분리 (2000g, 10 min)한 뒤 상등액을 DW (0.5 mL)과 iron (III) chloridesolution (0.1% w/v, 0.1 mL)과 혼합
생성 된 혼합물의 흡광도를 700 nm에서 측정하고, 샘플의 환원력을 아스코르브 산 등 가물로 나타냄
Quercus acuta Thunb.
Folin-ciocalteu 방법을 사용하여 총 페놀 함량 측정
샘플 (1mL)을 탄산나트륨 (2%, w/v)및 Folin-Ciocalteu phenol 시약 (10%, v/v) 10분
간 혼합혼합물의 흡광도는 750 nm에서 측정, 결과는 사료 1g 당 gallic acid 당량 밀리그램으 로 표시
Total phenolic content
Antibacterial activity assay
Vancomycin은 항균 활성을 비교하기 위한 기준 항생제로서 사용
추출물과 기준 항생제의 MIC value는 이전에 보고 된 바와 같이 기존의 한천 희석법 에 의해 결정
Quercus acuta Thunb.
Analysis of active substances
• 활성 성분은 헥산, 에틸 아세테이트 및 아세톤 추출물로부터
cinnamicacid, phytol, α-linolenic acid, α-tocopherol, β-sitosterol, β-amyrin, and friedelin-3-ol로 확인
• 에탄올, 메탄올, 물 추출물에서는 cinnamic acid, phytol, α-linolenic acid, α- tocopherol은 확인되지 않음
• Cinnamic acid, phytol, α-tocopherol, β-sitosterol, β-amyrin은 황산화 활성을 가짐.
• Cinnamic acid, phytol, β-sitosterol, friedelin-3-ol은 항균작용을 한다고 보고됨
Quercus acuta Thunb.
Analysis of active substances
• 각각의 유기 용매 추출물에 대한 7가지 활성 성분 함량의 비교
:헥산 ex (35.28%) > 에틸 아세테이트 ex (35.2%) > 아세톤 ex (29.7%) > 에탄올 ex (26.07%) > 메탄올 ex (0.79%) > 물 ex (검출되지 않음)
• 비극성 유기 용매의 사용은 7가지 성분의 추출 속도를 증가시킴.
Quercus acuta Thunb.
RT(min) Compound Quality M.W H (%) EA (%) A (%) Et (%) Me (%) W0 (%)
26.1 Cinnamic acid 99 308.126 0 0.7 0.25 0 0 0
27.1 Hexadecanoic acid 99 328.28 4.91 6.19 5.15 0 0.69 0
28.3 Phytol 99 368.347 2.53 3.72 3.09 0 0 0
28.7 9,12-Octadecadienoic
acid 99 352.28 1.38 1.37 1.14 0 0 0
28.7 α-Linolenic acid 99 350.264 3.24 3.6 2.73 0 0 0
34.1 Tetracosane 99 338.391 2.77 1.08 0.51 0 0 0
36.2 α-tocopherol 99 502.421 7.27 5.29 4.37 0 0 0
38.8 β-sitosterol 99 486.426 7.83 8.08 6.58 14.32 0.79 0
39.2 β-amyrin 99 498.426 10.69 11.74 9.55 6.52 0 0
39.9 2-Furancarboximidic
acid 99 312.075 17.46 13.04 10.55 0 0 0
42.4 Friedelan-3-one 99 426.386 3.72 2.07 3.13 5.23 0 0
Analysis of active substances
• Cinnamic acid는 자유 라디칼 소거 특성을 포함한 항산화 활성을 보임
대부분의 그람 음성균 및 그람 양성 세균에 대해 항균 활성을 보였으며, MIC값은 5mM 보다 높음
• Cinnamic acid는
mycobacterium tuberculosi
에 대한 항균 활성을 나타내는 것으로 밝혀짐• α-tocopherol은 환원력, 과산화물 음이온 라디칼 소거 활성, 금속 킬레이트 능력, 과산 화수소 소거 활성 및 지질 과산화 억제를 나타냄
• Phytol은 항산화 및 항균 작용이 있는 비 순환 diterpene 알코올, 히드록실 라디칼과 산 화 질소를 제거하고 티오바르비투르산 반응성 물질의 형성을 막음, phytol의 항균 메커 니즘은 완전히 확립되지 않음
• Phytol이
E.coli, candida albicans와 aspergillus niger
에 대해 항 박테리아 활성을 나 타내고 MIC(최소 억제 농도)는 62.5 µg/mL로 나타남Quercus acuta Thunb.
Analysis of active substances
•
Staphylococcus aureus
는 phytol에 내성이 있음• β-sitosterol은 항산화 및 항균 특성이 있음, 활성 산소와 간 지질 과산화물의 수준을 감 소시킴
• Β-sitosterol은 또한
E.coli, Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Klebsiella pneumoniae
에 대한 항 박테리아 활성을 갖는 것으로 보고 됨DPPH hydroxyl nitric oxide superoxide
IC
50va lu e ( mg /ml )
0 20 40 60 80
• β-amyrin은 DPPH, hydroxyl, nitric oxide, 100
superoxide의 라디칼 소거 효과에 대해 매우 우수 한 IC
50
값을 나타냄• 환원력이 높고 지질 과산화를 억제
Quercus acuta Thunb.
Analysis of active substances
• Pterocarpus santalinoides에서 정제된 Friedelin-3-ol과 항균 활성 평가 -
MRSA, H. pylori
와E.coli
에 대해 MIC value (10 µg/mL)- MRSA, H. pylori, Candida krusei, S.aureus, S. pneumoiae, C. tropicalis
에 대한 최소살균/살균농도(MBC/MFC)의 값은 10-40 µg/mL 범위• 크로마토그램 프로파일에서 주요피크는 catechin으로 확인, epicatechin과 taxifolin 의 2개의 미량 화합물 확인
• 다양한 추출물에서 3가지 활성 화합물의 함량 비교결과 메탄올 추출물에서 추출 수율과 함량이 가장 높음
Quercus acuta Thunb.
Extract Extraction Yield
(%) (+)-Catechin (+)-Epicatechin Taxifolin
H 0.65 - - -
EA 0.98 7.32 1.51 0.95
Ace 1.54 14.15 2.05 2.53
MeOH 11.96 27.04 3.05 2.56
EtOH 13.68 19.25 2.27 2.40
Water 12.01 15.72 3.43 1.53
Extract Reducing power (Ascorbic Acid eq. µg/100 µg Extract) Total phenolic content (Gallic Acid eq. mg/g)
H ex 4.73 ± 0.04 1.53 ± 0.05
EA ex 28.52 ± 0.29 10.37 ± 0.18
Ace ex 61.00 ± 0.47 21.38 ± 0.51
MeOH 163.69 ± 1.37 83.25 ± 2.39
EtOH 151.39 ± 2.42 85.20 ± 0.89
Water 171.57 ± 0.93 74.21 ± 1.04
Antioxidant activity and total phenolic content of the QA extracts
• QA 추출물의 항산화 활성을 DPPH 자유 라디칼 소거 및 환원력 검정을 사용하여 평가, 총 페놀 함량 (mg/g as gallic acid) 측정
• Fe
3+
의 감소를 측정하여 추출물의 환원 능력 측정Quercus acuta Thunb.
Extract DPPH Scavenging Activity IC50 (µg/mL)
Vitamin C (control) 8.18 ± 0.28
H 1008.23 ± 56.33
EA 438.37 ± 72.49
Ace 149.63 ± 22.11
MeOH 49.58 ± 1.46
EtOH 59.01 ± 6.44
Water 73.67 ± 3.08
• Pterocarpus santalinoides에서 정제된 Friedelin-3-ol과 항균 활성 평가 -
MRSA, H. pylori
와E.coli
에 대해 MIC value (10 µg/mL)- MRSA, H. pylori, Candida krusei, S.aureus, S. pneumoiae, C. tropicalis
에 대한 최소살균/살균농도(MBC/MFC)의 값은 10-40 µg/mL 범위• 크로마토그램 프로파일에서 주요피크는 catechin으로 확인, epicatechin과 taxifolin 의 2개의 미량 화합물 확인
• 다양한 추출물에서 3가지 활성 화합물의 함량 비교결과 메탄올 추출물에서 추출 수율과 함량이 가장 높음
• Methanol 추추물물의 catechin, epicatechin, taxifolin의 총 함량은 32.6 mg/g 이며, 이는 총 페놀 함량의 39.2%를 차지
• 따라서 catechin, epicatechin, taxifolin과 같은 플라보노이드는 QA의 항산화 활성에 상당히 기여하는 것으로 간주
Antioxidant activity and total phenolic content of the QA extracts
Quercus acuta Thunb.
Antibacterial activity of QA extracts
• 최상의 추출 용매 조건을 선택하기 위해 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 메탄올 ,에탄올 및 물로 추출 한 후 디스크 확산법을 통한 메티실린 내성 S. aureus 693E (MRSA 693E) 에 대한 QA 잎 추출물의 억제 효과 분석
• 헥산, 에틸 아세테이트 및 아세톤 추출물이 항균 활성을 나타내는 것으로 관찰(에틸 아 세테이트 추출물이 가장 높은 항균 활성)
Quercus acuta Thunb.
Antibacterial activity of QA extracts
• Vancomycin(항생제)
• 에틸아세테이트 추출물은 Staphylococcus aureus KCTC 1928, Micrococcus luteus ATCC9341,
Salmonella typhimrium KCTC 1925, E.coli KCTC 1923및 125~500 µg/ml범위의 MIC 값을 갖는 8개의 MRSA 균주에 대한 항균 활성을 나타냄
• 따라서, QA 추출물은 포도상구균 감염에 의해 야기 되는 산화적 불균형을 완화시키고 박테리아 성장을 억제할 것으로 예상
Quercus acuta Thunb.
Organisms MIC (>1000µg/mL)
Extract Vancomycin
Alacligenes faecalis ATCC 1004 >1000 >80
Enterococcus Faecalis ATCC 29212 >1000 1.25
Bacillus subtilis ATCC6633 >1000 0.625
Staphylococcus aureus KCTC 1928 125 1.25
Micrococcus luteus ATCC 9341 500 1.25
Mycrobacterium smegmatis ATCC 9341 >1000 2.5
Salmonella typhimrium KCTC 1925 250 >80
Escherrichia coli KCTC 1923 250 >80
Pseudomonas aeruginosa KCTC >1000 >80
MRSA 693E 125 1.25
MRSA 4-5 250 >80
MRSA 5-3 125 >80
VRE 82 >1000 >80
VRE 89 >1000 >80
VRE 98 >1000 >80
VRSA(MRSA2-32) >1000 >80
MRSA S1 125 2.5
MRSA S3 250 1.25
MRSA U4 125 0.625
MRSA P8 125 1.25
MRSA B15 250 1.25
IMP 100 >1000 >80
IMP 102 >1000 >80
IMP 120 >1000 >80
QA 잎의 다양한 용매 추출물이 성공적으로 제조 되었고, 화학적 프로파일 및 생물학적 활성 평가
메탄올 추출물은 DPPH 라디칼 소거 활성과 총 페놀 함량이 가장 높았으며, 환원력은 물 추출물에서 가장 높음
에틸아세테이트 추출물은 S. aureus에 대해 가장 높은 항 박테리아 활성, S. aureus KCTC 1928, M.
luteus ATCC9341, S. typhimrium KCTC 1925, E.coli KCTC 및 8 개의 MRSA 균주에 대해 항균 활성 을 나타냄
QA의 메탄올 및 에틸아세테이트 추출물은 S. aureus에 의해 유발되는 다양한 형태의 항산화 불균형 및 감염성 질환에 치료적으로 적용 될 수 있는 가능성을 나타냄