Correlation of C-erbB-2 Oncogene Amplification by Chromogenic in situ Hybridization and Expressions of Cell Cycle Regulatory Proteins in Infiltrating Duct Carcinoma of the Breast

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(1)대한외과학회지：제 70 권 제1호 Vol. 70, No. 1, January, 2006. □ 원 저 □. 유방의 침윤성 관암종에서 색소원제자리부합화에 의한 C-erbB-2 종양유전자 증폭과 세포주기 조절단백 발현의 연관성 중앙대학교 의과대학 외과학교실, 1병리학교실 1. 박봉근․김범규․차성재․박성준․임현묵․박성일․이태진. Correlation of C-erbB-2 Oncogene Amplification by Chromogenic in situ Hybridization and Expressions of Cell Cycle Regulatory Proteins in Infiltrating Duct Carcinoma of the Breast. P=0.036). The amplification of the c-erbB-2 oncogene between down-regulation of p27kip1 protein and E2F-1 protein showed a statistically significant correlation. Conclusion: The amplification of the c-erbB-2 oncogene may be correlation with cell cycle regulatory proteins such as p27kip1 and E2F-1. (J Korean Surg Soc 2006;70:14-24). Bong Keun Park, M.D., Beom Gyu Kim, M.D., Sung Jae Cha, M.D., Sung Jun Park, M.D., Hyun Muck Lim, M.D., Sung Il Park, M.D. and Tae Jin Lee, M.D.1. Key Words: Breast Cancer, c-erbB-2, p27kip1, Cyclin D1, Rb, E2F-1 중심 단어: 유방암, c-erbB-2, p27 kip1 , cyclin D1, Rb, E2F-1 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. Purpose: Gene amplification and/or over-expression of the c-erbB-2 are linked with poor prognosis in breast cancer. There has been only a few reports about the connection of c-erbB-2 oncogene amplification with cell regulatory proteins such as p27kip1, cyclin D1, Rb, and E2F-1. The purpose of this study is to determine the correlation the amplification of the c-erbB-2 oncogene and protein expressions of p27kip1, cyclin D1, Rb, and E2F-1. Methods: Using Chromogenic in situ Hybridization (CISH) the amplification the c-erbB-2 oncogene were determined from paraffin sections of 48 infiltrating duct carcinomas (IDC). The protein expressions of p27kip1, cyclin D1, Rb, and E2F-1 were studied immunohistochemically. Results: Among the 48 evaluated IDC patients, amplifications of the c-erbB-2 oncogene by CISH were observed in 14 cases (29.1%). The amplification of the c-erbB-2 oncogene showed a significant correlation with tumor size and stage (P=0.0001 and P=0.001). The proteins of p27kip1, cyclin D1, Rb, and E2F-1 were expressed by IHC in 23 cases (47.9%), 17 cases (35.4%), 27 cases (56.3%), and 22 cases (45.8%), respectively. Down- regulation of protein expressions showed a significant correlation with tumor size (P=0.031) in p27kip1 and estrogen and progesterone receptor status (P=0.026 and P=0.001) in Rb. The expression of the E2F-1 protein showed a significant correlation with tumor size, stage, and histologic grade (P=0.003, P=0.030, and. Departments of Surgery and 1Pathology, College of Medicine, Chung-Ang University, Seoul, Korea. 서. 론. 유방암을 유발하는 분자생물학적 기전은 아직 명확히 규 명되어 있지 않으며 예후 인자와 치료 방법 또한 다양하다. 유방암의 치료는 병기에 따라 다르나 근치적 수술 후 재발 방지와 생존율 증가를 위해 약물이나 방사선치료 등의 여 러 보존적 치료를 병행하게 된다. 그러나 조기 유방암일지 라도 전이나 재발이 일어날 수 있으며 같은 병기 또는 같은 조직학적 진단을 받은 경우에도 치료에 반응하는 양상이 다르다. 유방암의 예후를 결정하는 인자들 중에서 종양의 크기와 림프절 전이 유무가 가장 중요한 독립적 예후인자 로 밝혀져 있으며,(1) 유방암 중 재발 가능성이 높은 고위험 도군을 구별할 수 있는 보조적 예후인자로서 DNA 배수성, 증식분획, 호르몬 수용체, c-erbB-2와 p53 등의 종양유전자 및 종양억제유전자의 역할에 대한 연구가 진행되어 왔 다.(2) 이들 중 c-erbB-2 종양유전자는 유방암에서 현재 중 요한 예후인자로 간주되고 있으며, 최근 연구들에서 cerbB-2 종양유전자의 증폭은 호르몬이나 화학요법의 반응 을 예측할 수 있는 유용한 인자로 알려져 있다.(3) 임상적으 로 c-erbB-2 종양유전자가 중요한 이유는 c-erbB-2 단백에 대한 단일 항체인 trastuzumab (HerceptinⓇ)이 새로운 항암제 Ⓡ 로 사용이 증가할 것이 예측되며, 이 Herceptin 은 c-erbB-2 종양유전자의 증폭이나 과발현 시에만 효과가 있기 때문이. 책임저자：박성준, 서울특별시 동작구 흑석동 224-1 ꂕ 156-755, 중앙대학교 의과대학 외과학교실 Tel: 02-6299-1548, Fax: 02-824-7869 E-mail: [email protected] 접수일：2005년 4월 25일, 게재승인일：2005년 10월 4일. 14.

(2) 박봉근 외：유방의 C-erbB-2 종양유전자 증폭과 세포주기 조절단백 발현. 15. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 다.(4) 암형성과 진행에 관여하는 여러 기능적 생물학적 변수들 중 세포주기 조절인자에 대한 연구로 정상 세포주기의 장 애가 암형성의 중요한 과정이라는 사실이 밝혀졌으며 있고 세포주기에 관여하는 여러 구성 단백의 이상이 여러 인체 종양에서 보고되고 있다.(5) 세포주기 조절에 관련된 cyclin 계열의 단백과 cyclin dependent kinase (CDK) 그리고 cyclin dependent kinase inhibitor (CDKI) 등의 발견과 이들에 관한 활발한 연구는 세포주기를 조절하는 분자생물학적 기전을 이해하는데 크게 기여하였다.(6) 세포의 핵 내에서 cyclin이 라는 단백은 주기적으로 증가와 감소를 하고 있으며 cyclin 의 증가에 의하여 CDK는 Rb 단백의 serine 및 threonine을 인산화시키고, 그 결과 Rb 단백에 의해 억제되고 있던 E2F 나 c-Abl, Elf-1과 같은 전사인자들이 활성화되면서 세포는 G1에서 S기로 들어가게 되어 세포증식의 기반이 마련된 다.(7) 이와 더불어 세포의 주기를 정확히 조절하기 위하여 kip1 세포는 cyclin이나 CDK 같은 활성인자 이외에도 p27 , INK4A INK4B WAF1/CIP1 , p15 , p21 등의 CDK 억제인자(CDKI)들 p16 kip1 이 존재한다.(8) 이들 중 p27 은 세포 내에서 항상 일정량 으로 존재하고 있으며 cyclin 혹은 Cyclin-CDK 복합체와 결 kip1 합하고, cyclin A, B, D 및 E와도 결합할 수 있다. p27 은 cyclin D-CDK4 복합체 및 cyclin E-CDK2 복합체에 결합하 여 CDK의 활성을 억제함으로써 Rb 단백의 인산화를 억제 한다. 분열촉진물질의 자극이 계속되면 cyclin D 및 cyclin E의 양이 계속 증가하여 상대적으로 고정된 양으로 존재하 kip1 던 p27 은 희석되어 결국 CDK에 대한 억제 효과가 사라 지고 Rb 단백의 인산화가 가속되어 세포는 G1기에서 S기 로 진행된다.(9) 최근 이러한 세포주기 조절단백과 c-erbB-2 의 발현 사이의 연관성이 보고 되고 있으며 이들의 예후인 자로서의 가능성도 연구되고 있다.(10) 이에 본 연구에서는 유방암의 파라핀 포매 조직을 이용 kip1 하여 세포주기 조절단백인 p27 , cyclin D1, Rb, E2F-1의 발현 양상을 관찰하고 c-erbB-2 종양유전자에 대하여서는 chromogenic in situ hybridization (CISH)에 의한 유전자 증폭 여부를 확인하여 세포주기 조절단백들과 c-erbB-2 종양유 전자 증폭 사이의 연관성을 알아보고자 하며, 동시에 세포 주기 조절단백 및 c-erbB-2 종양유전자 증폭과 기존 예후인 자로 알려진 종양의 크기, 액와림프절 전이 유무, 병기, 조 직학적 등급, 핵등급, 호르몬 수용체 상태 등과의 연관성도 알아보고자 한다.. 방. 법. 1) 재료 1999년 9월부터 2003년 8월까지 중앙대학교부속 필동병 원 외과학교실에서 유방암으로 수술을 받았던 환자 중 병 리적으로 침윤성 관암종으로 진단 받은 예들 중에서 조직. 보관 상태가 양호한 48예를 대상으로 포르말린에 고정된 파라핀 포매 조직을 이용하였다. 검체는 환자에서 적출된 즉시 포르말린으로 고정 후 육안검색 후 종괴를 포함하여 절제된 림프절을 파라핀 절편으로 만들고 통상적인 Hematoxyline & Eosin 염색을 실시하였다. 선택된 환자의 임상기 록과 병리진단지 등을 재검색하여 환자의 나이, 종양의 크 기, 림프절 전이 유무, 병기, 조직학적 등급, 핵등급, 호르몬 수용체 상태 등을 확인하였다. 2) 연구 방법 (1) 병리학적 분류: 세포의 조직학적 악성도는 Bloom과 Richardson(11)의 방법을 Nottingham/Tenovus Breast Cancer Study에서 변형한 조직학적 및 핵 등급기준을 이용하였 다.(12) 조직학적 등급은 ① 세관 형성의 결여를 기준으로 한 역분화: 1∼3, ② 핵의 크기, 모양 및 염색성의 변화: 1∼ 3, ③ 유사분열의 빈도: 1∼3로 구분하여 총 점수가 3, 4, 5이 면 1등급, 6, 7이면 2등급, 8, 9이면 3등급으로 구분하였으 며, 핵등급은 핵의 크기와 형태의 변화가 미약하면 1등급, 중등도의 변화를 보이면 등급 2, 심한 변화를 보이면 등급 3으로 하였다. 종양의 크기는 American Joint Committee on Cancer (AJCC)의 T 분류에 따라 2 cm 이하, 2.1∼5 cm, 5 cm 이상으 로 분류하였고, 림프절 전이는 그 수에 관계없이 전이 유무 로 분류하였으며, 병기는 AJCC의 분류에 따랐다. (2) 면역조직화학 염색: 선택된 환자의 파라핀 포매 조직 을 4∼5μm 두께로 박절하고 자일렌으로 탈 파라핀 과정을 거친 후(5분간 3회) 무수 알코올, 90%, 75% 및 50% 에탄올 에 각각 2분씩 처리하여 함수시켰다. 내인성 과산화 효소의 활성을 억제하기 위해 3% hydrogen peroxide-methanol에 10 분간 처리 후 증류수로 세척한 다음 50 mM Tris 완충용액 (TBS, pH 7.5)으로 수세 후 비특이성 반응을 제거하기 위해 30분간 염소혈청으로 처리하고, 여분의 용액을 제거한 다 kip1 (Neomarker, USA)을 1：100으로 음 일차항체인 p27 cyclin D1 (Zymed, USA), E2F-1 (Zymed, USA), Rb (Zymed, USA) monoclonal antibody를 1：50으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 TBS로 5분간 3회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체(1：300, Zymed Co.)에 20분 간 작용 후, 통상적인 avidin-biotin complex법으로 염색하였 다. 발색제는 AEC를 사용하고 Mayer's hematoxylin으로 대 조염색하였다. (3) C-erbB-2 유전자 증폭을 위한 chromogenic in situ hybridization (CISH): 파라핀 포매조직을 5μm 두께로 박 절하고 자일렌으로 탈 파라핀 과정을 거친 후(5분간 3회) 무수 알코올, 90%, 75% 및 50% 에탄올에 각각 2분씩 처리 하여 함수시켰다. Spot-Light Fluorescein Anti-fluorescein Peroxidase, Diaminobenzidine (FFPE) reagent Kit (Zymed, South San o Francisco, CA)를 사용하여 92 C에서 10분간 microwave oven.

(3) 16. 대한외과학회지：제 70 권 제 1 호 2006. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 에서 전처치 과정을 실시하였다. 슬라이드를 20분 동안 식 히고 PBS 완충액으로 수세하고, 상온에서 10∼15분간 FFPE digestion enzyme을 슬라이드 당 100μl씩 가하고, PBS 완충용액으로 다시 수세하였다. Digoxigenin- labeled c-erbB2 probe (Zymed)를 첨가한 후 14×14 mm coverslip으로 덮고 o o 이들 슬라이드를 94 C에서 3분간 hybridization 시긴 후 37 C o 에서 하룻밤 동안 방치하였다. 이 슬라이드를 75 C에서 0.5 ×SSC (Sodium chloride-sodium citrate buffer)로 5분간 수세 하고 다시 실온에서 PBS 완충액으로 세 번 수세하였다. 이 슬라이드를 anti-digoxigenin fluorescein, anti-fluorescein peroxidase, diaminobenzidine으로 처리하고, hematoxyline으로 대 조 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.(13) (4) 결과판정: CISH에 의한 c-erbB-2 유전자의 증폭은 종 양세포의 50% 이상에서 핵 한 개당 6∼10개의 signal이 관 찰되면 low-level의 증폭, 10개 이상이 signal이 관찰되면 high-level의 증폭으로 판정하고 high-level의 증폭을 유전자 kip1 증폭이 있는 것으로 간주하였다.(13) p27 은 전체 종양의 50% 이하에서 핵에 염색이 되면 단백 발현에 감소가 있는 음성으로 판독하였고, cyclin D1, Rb, E2F-1 단백 발현은 종 양세포의 핵에 10% 이상에서 염색이 되면 양성으로 간주하 였다.(10) (5) 통계학적 분석: Window용 SPSS (version 8.0) 통계 프 로그램을 이용하여 Pearson Chi-square test와 correlation test 를 실시하여, P값이 0.05 이하일 때를 통계학적으로 유의성 이 있는 것으로 하였다.. A. 결. 과. 1) 임상 및 조직학적 소견 환자의 연령은 24세부터 76세로 평균 46.6세였다. 연령별 로 보면 20에서 29세 군이 3예(6.3%), 30에서 39세 군이 10 예(20.8%), 40세에서 49세 군이 19예(39.6%), 50세에서 59세 군이 10예(20.8%), 60세에서 69세 군이 4예(8.3%), 70세에서 79세군이 2예(4.2%)로 40대가 가장 많았다. 종양의 크기는 2 cm 이하 군이 9예(18.8%), 2.1 cm에서 5 cm 군은 33예(68.7%), 5 cm 이상인 군이 6예(12.5%)였다. 액와 림프절 전이 유무는 전이가 있는 군이 28예(58.3%)였 고, 전이가 없는 군이 20예(41.7%)였으며, AJCC에 의한 환 자의 병기는 병기 I이 3예(6.3%), 병기 IIA가 21예(43.7%), 병기 IIB가 18예(37.5%), 병기 IIIA가 6예(12.5%)였다. 조직학적 등급의 기준인 소관 형성 정도, 핵의 다형성, 유 사분열 수에 따라 조직학적인 등급을 나누었을 때 1등급이 4예(8.4%), 2등급이 22예(45.8%), 3등급이 22예(45.8%)였고, 핵등급은 1등급이 4예(8.4%), 2등급이 19예(39.6%), 3등급이 25예(52.0%)였다. 면역조직화학 염색에서 종양세포의 핵에 10% 이상 염색 이 된 경우에 양성으로 판정한 에스트로겐 수용체가 양성 인 군은 27예(61.7%)였으며 음성인 군은 21예(38.3%)였고, 프로게스테론 수용체가 양성인 군은 38예(79.2%)였으며, 음 성인 군은 10예(20.8%)였다.. B. Fig. 1. Chromogenic in situ hybridization for c-erbB-2 in the infiltrating duct carcinoma of the breast. (A) Low-level amplification, (B) high-level amplification (×1,000)..

(4) 박봉근 외：유방의 C-erbB-2 종양유전자 증폭과 세포주기 조절단백 발현. 17. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 2) C-erbB-2 종양유전자 증폭 색소원제자리부합화(CISH)에 의한 c-erbB-2 종양유전자 증폭을 시행한 결과 14예(29.1%)에서 핵 내에 10개 이상의 signal이 관찰되어 유전자 증폭이 있는 것으로 간주하였다 (Fig. 1). C-erbB-2 유전자 증폭의 환자 나이에 따른 차이는 없었고, 종양의 크기가 커질수록 유전자 증폭의 빈도도 통 계학적으로 유의하게 증가하였는데 종양의 크기가 0∼2 cm, 2.1∼5 cm, 5 cm 이상으로 증가할수록 c-erbB-2 종양유. Table 1. Comparison between c-erbB-2 amplification and clinicopathologic variables in 48 breast cancers ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ C-erbB-2 amplification ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ (n) (-)(%) (+)(%) P-value ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Age 20∼29 3 2 (66.6) 1 (33.3) 30∼39 10 6 (60.0) 4 (40.0) 40∼49 19 13 (68.4) 6 (31.6) NS 50∼59 10 7 (70.0) 3 (30.0) 60∼69 4 4 (100) 0 (0) 70∼79 2 2 (100) 0 (0) Tumor size 0∼2 cm 9 9 (100) 0 (0) 2.1∼5 cm 33 25 (75.8) 8 (24.2) 0.0001 ＞5 cm 6 0 (0) 6 (100) Nodal metastasis (-) 20 16 (80.0) 4 (20.0) NS (+) 28 18 (64.3) 10 (35.7) Stage I 3 3 (100) 0 (0) IIa 21 17 (90.0) 4 (10.0) 0.001 IIb 18 14 (77.8) 4 (22.2) IIIa 6 0 (0) 6 (100) Histologic grade 1 4 4 (100) 0 (0) 2 22 15 (68.2) 7 (31.8) NS 3 22 15 (68.2) 7 (31.8) Nuclear grade 1 4 4 (100) 0 (0) 2 19 12 (63.2) 7 (36.8) NS 3 25 18 (72.0) 7 (28.0) ER (-) 21 15 (71.4) 6 (28.6) NS (+) 27 19 (70.4) 8 (29.6) PR (-) 10 7 (70.0) 3 (30.0) NS (+) 38 27 (71.1) 11 (28.9) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ NS = not significant.. 전자 증폭의 빈도는 각각 0%, 24.2%, 100%로 증가하였다 (P=0.0001). 액와 림프절 전이가 있는 28예 중에서 c-erbB-2 종양유전자 증폭이 있는 예는 10예인 35.7%에서 관찰되었 고, 전이가 없는 20예 중에서는 4예인 20.0%에서 종양유전 자의 증폭이 관찰되었지만 통계학적인 유의성은 없었다. 병기에 따른 c-erbB-2 종양유전자 증폭은 병기 I에서 IIa, IIb, IIIa로 진행함에 따라 각각 0%, 10.0%, 22.2%, 100%로 통계학적으로 유의하게 증가하였다(P=0.001). 조직학적 등 급 및 핵등급과 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용 체 상태에 따른 c-erbB-2 종양유전자 증폭에는 차이가 없었 다(Table 1). 3) p27 kip1. kip1. , cyclin D1, Rb, E2F-1 단백 발현. p27 단백 발현의 감소는 총 48예 중 25예인 52.1%에서 관찰되었다(Fig. 2). 환자 나이에 따른 차이는 없었고, 종양 의 크기가 0∼2 cm, 2.1∼5 cm, 5 cm 이상으로 증가할수록 kip1 p27 단백 발현 감소의 비율은 각각 33.3%, 48.5%, 100%로 통계학적으로 유의하게 증가하였다(P=0.031). 액와 림프절 전이 유무에 따른 p27kip1 단백 발현의 차이는 통계학적 유 kip1 의성이 없었으며, 병기에 따른 p27 단백 발현의 감소는 병기가 I에서 IIA, IIB, IIIA로 진행함에 따라 0%, 57.1%, 38.9%, 100%로 나타났지만 통계학적인 유의성은 없었다. kip1 p27 단백 발현의 감소와 조직학적 등급 및 핵등급과 호르 몬 수용체 상태에 따른 연관성은 관찰되지 않았다(Table 2). Cyclin D1 단백의 발현은 총 48예 중 31예인 64.6%에서 관찰되었지만, 환자의 나이, 종양의 크기, 림프절 전이 유 무, 병기, 조직학적 등급, 핵 등급, 호르몬 수용체 상태 등과 연관성이 관찰되지 않았다(Fig. 3, Table 3). Rb 단백 발현의 감소는 27예인 56.3%에서 관찰되었다 (Fig. 4). 환자의 나이, 종양의 크기, 림프절 전이 유무, 병기, 조직학적 등급, 핵 등급과의 연관성은 관찰되지 않았지만, 에스트로겐 음성인 군에서 pRb 단백 발현의 감소는 38.1% 에서 관찰되었고 양성인 군에서는 70.4%에서 관찰이 되어 통계학적으로 유의성이 있었으며(P=0.026), 프로게스테론 음성인 군에서는 0%, 양성인 군에서는 71.1%에서 관찰되어 통계학적으로 유의성이 있었다(P=0.001)(Table 4). E2F-1 단백 발현의 양성률은 26예인 54.2%에서 관찰되었 다(Fig. 5). 환자의 나이에 따른 발현의 차이는 없었고, 종양 의 크기가 0∼2 cm, 2.1∼5 cm, 5 cm 이상으로 증가할수록 E2F-1 단백 발현은 각각 11.1%, 57.6%, 100%로 통계학적으 로 유의하게 발현 빈도가 증가하였다(P=0.003). 액와림프절 전이 유무와는 연관성이 없었으며, 병기가 I에서 IIA, IIB, IIIA로 진행함에 따라 E2F-1의 발현 빈도는 33.3%, 42.9%, 55.6%, 100%로 통계학적으로 유의하게 증가하였으며(P= 0.030), 조직학적 등급과도 연관성이 있었다(P=0.036). 하지 만 핵 등급, 호르몬 수용체 상태와는 연관성이 관찰되지 않 았다(Table 5)..

(5) 18. 대한외과학회지：제 70 권 제 1 호 2006. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. A. B. A. 4) C-erbB-2 종양유전자 증폭과 p27 E2F-1 단백 발현의 연관성. B. kip1. , cyclin D1, Rb,. kip1 C-erbB-2 종양유전자 증폭과 p27 단백 발현 감소와의 연관성에서는 c-erbB-2 종양유전자 증폭이 관찰된 예 중에 kip1 kip1 단백 발현 감소가 관찰된 예는 48%였고, p27 서 p27 단백 발현 감소가 관찰되지 않은 예는 8.7%로 통계학적 유. Fig. 2. Immunohistochemical staining kip1 in the infiltrating for p27 duct carcinoma of the breast. (A) diffusely strong positive cells, (B) decrease of positive cells (AEC, ×200). Fig. 3. Immunohistochemical staining for cyclin D1 in the infiltrating duct carcinoma of the breast. (A) No positive cells, (B) diffuse positive cells (AEC, ×200).. 의성이 있었다(P=0.003). 또한 c-erbB-2 종양유전자 증폭은 E2F-1 단백 발현과도 연관성이 있었는데 c-erbB-2 종양유전 자 증폭이 관찰된 예 중에서 E2F-1 단백 발현이 양성인 예 는 50.0%였고 음성인 예는 4.5%로 통계학적인 유의성이 있 었다(P=0.001). 하지만 c-erbB-2 종양유전자 증폭과 cyclin D1의 발현과 Rb 단백 발현 감소와는 연관성이 관찰되지 않 았다..

(6) 박봉근 외：유방의 C-erbB-2 종양유전자 증폭과 세포주기 조절단백 발현. 19. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Table 2. Comparison between loss of p27kip1 protein expression and clinicopathologic variables in 48 breast cancers ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ p27kip1 loss ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ (n) (-)(%) (+)(%) P-value ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Age 20∼29 3 2 (66.7) 1 (33.3) 30∼39 10 4 (40.0) 6 (60.0) 40∼49 19 9 (47.4) 10 (52.6) NS 50∼59 10 5 (50.0) 5 (50.0) 60∼69 4 2 (50.0) 2 (50.0) 70∼79 2 1 (50.0) 1 (50.0) Tumor size 0∼2 cm 9 6 (66.7) 3 (33.3) 2.1∼5 cm 33 17 (51.5) 16 (48.5) 0.031 ＞5 cm 6 0 (0) 6 (100) Nodal metastasis (-) 20 10 (50.0) 10 (50.0) NS (+) 28 13 (46.4) 15 (53.6) Stage I 3 3 (100) 0 (0) IIa 21 9 (42.9) 12 (57.1) NS IIb 18 11 (61.1) 7 (38.9) IIIa 6 0 (0) 6 (100) Histologic grade 1 4 4 (100) 0 (0) 2 22 6 (27.3) 16 (72.7) NS 3 22 13 (59.1) 9 (40.9) Nuclear grade 1 4 3 (75.0) 1 (25.0) 2 19 6 (31.6) 13 (68.4) NS 3 25 14 (56.0) 11 (44.0) ER (-) 21 13 (61.9) 8 (38.1) NS (+) 27 10 (37.0) 17 (63.0) PR (-) 10 7 (70.0) 3 (30.0) NS (+) 38 14 (42.1) 22 (57.9) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ NS = not significant.. Table 3. Comparison between cyclin D1 expression and clinicopathologic variables in 48 breast cancers ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ Cyclin D1 expression ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ (n) (-)(%) (+)(%) P-value ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Age 20∼29 3 2 (66.7) 1 (33.3) 30∼39 10 1 (10.0) 9 (90.0) 40∼49 19 7 (36.8) 12 (63.2) NS 50∼59 10 6 (60.0) 4 (40.0) 60∼69 4 1 (25.0) 3 (75.0) 70∼79 2 0 (0) 2 (100) Tumor size 0∼2 cm 9 4 (44.4) 5 (55.5) 2.1∼5 cm 33 10 (30.3) 23 (69.7) NS ＞5 cm 6 3 (50.0) 3 (50.0) Nodal metamitosis (-) 20 5 (25.0) 15 (75.0) NS (+) 28 12 (42.9) 16 (57.1) Stage I 3 1 (33.3) 2 (66.7) IIa 21 7 (33.3) 14 (66.7) NS IIb 18 6 (33.3) 12 (66.7) IIIa 6 3 (50.0) 3 (50.0) Histologic grade 1 4 2 (50.0) 2 (50.0) 2 22 5 (22.7) 17 (77.3) NS 3 22 10 (45.5) 12 (54.5) Nuclear grade 1 4 1 (25.0) 3 (75.0) 2 19 4 (21.1) 15 (78.9) NS 3 25 12 (48.0) 13 (52.0) ER (-) 21 9 (42.9) 12 (57.1) NS (+) 27 8 (29.6) 19 (70.4) PR (-) 10 3 (30.0) 7 (70.0) NS (+) 38 14 (36.8) 24 (63.2) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ NS = not significant.. kip1. 세포주기 조절단백 상호간 발현의 연관성에서는 p27 단백 발현 감소와 E2F-1 단백 발현과의 연관성이 통계학적 으로 유의성이 있었으며(P=0.010), p27kip1 단백 발현 감소와 cyclin D1의 발현 및 Rb 단백 발현의 감소, 그리고 cyclin D1 과 Rb 단백 발현의 감소 및 E2F-1 단백 발현, Rb 단백 발현 의 감소와 E2F-1 단백 발현 사이에는 연관성이 관찰되지 않 았다(Table 6).. 고. 찰. C-erbB-2 종양유전자는 정상세포에서 단일 복제 형태로 존재하고, p185로 알려진 185 kD의 세포막 당단백이 암호 화되어 있다. 이 p185의 세포 내 성분은 tyrosine kinase의 활 성을 가지고 있으며, 표피성장인자 수용체와 구조적 상동 성을 가진다.(14) 이러한 c-erbB-2 유전자의 증폭과 단백의 과발현은 유방암에서 현재 중요한 예후인자로 간주되고 있.

(7) 20. 대한외과학회지：제 70 권 제 1 호 2006. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. A. A. 다. C-erbB-2 유전자의 증폭이나 과발현은 14.6%에서부터 42%까지 다양하게 보고되고 있으며,(15) 예후인자로서의 가치에 대한 보고 또한 다양하다.(16) 이것은 c-erbB-2 종양 유전자의 증폭이나 단백의 과발현을 검출하고 분석하는 방 법상의 문제이기도 하다. 이전에 c-erbB-2 종양유전자의 증 폭이나 단백 과발현의 검출은 Southern이나 Western blotting 을 사용하였으나 이 방법은 검사방법이 복잡하여 통상적인. B. B. Fig. 4. Immunohistochemical staining for Rb in the infiltrating duct carcinoma of the breast. (A) Diffuse positive cells, (B) decrease of positive cells (AEC, ×200).. Fig. 5. Immunohistochemical staining for E2F-1 in the infiltrating duct carcinoma of the breast. (A) A few positive cells, (B) diffusely strong positive cells (AEC, ×200).. 진단 방법으로는 적절하지 않고, 통상적으로 면역조직화학 염색과 형광제자리부합화가 사용되었으며,(17) 현재는 표 준적인 검사 kit (일명 HercepTest)가 FDA (The United States Food and Drug Administration)의 공인을 받아 사용되고 있으 나 그것 또한 서로 다른 결과들을 보고하고 있다.(18) 그러 나 새로운 방법인 색소원제자리부합화는 DNA probe를 이 용하여 간단한 면역조직화학 염색처럼 peroxidase 반응으로.

(8) 박봉근 외：유방의 C-erbB-2 종양유전자 증폭과 세포주기 조절단백 발현. 21. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Table 4. Comparison between loss of Rb protein expression and clinicopathologic variables in 48 breast cancers ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ Rb loss ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ (n) (-)(%) (+)(%) P-value ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Age 20∼29 3 1 (33.3) 2 (66.7) 30∼39 10 7 (70.0) 3 (30.0) 40∼49 19 6 (31.6) 13 (68.4) NS 50∼59 10 6 (60.0) 4 (40.0) 60∼69 4 1 (33.3) 3 (66.7) 70∼79 2 0 (0) 2 (100) Tumor size 0∼2 cm 9 4 (44.4) 5 (55.6) 2.1∼5 cm 33 15 (45.4) 18 (54.5) NS ＞5 cm 6 2 (33.3) 4 (66.7) Nodal metastasis (-) 20 9 (45.0) 11 (55.0) NS (+) 28 12 (42.9) 16 (57.1) Stage I 3 3 (100) 0 (0) IIa 21 6 (28.6) 15 (71.4) NS IIb 18 10 (55.6) 8 (44.4) IIIa 6 2 (33.3) 4 (66.7) Histologic grade 1 4 3 (75.0) 1 (25.0) 2 22 6 (27.3) 16 (72.7) NS 3 22 12 (54.5) 10 (45.5) Nuclear grade 1 4 3 (75.0) 1 (25.0) 2 19 4 (21.1) 15 (78.9) NS 3 25 14 (56.0) 11 (44.0) ER (-) 21 13 (61.9) 8 (38.1) 0.026 (+) 27 8 (29.6) 19 (70.4) PR (-) 10 10 (100) 0 (0) 0.001 (+) 38 11 (28.9) 27 (71.1) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ NS = not significant.. Table 5. Comparison between E2F-1 protein expression and clinicopathologic variables in 48 breast cancers ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ E2F-1 expression ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ (n) (-)(%) (+)(%) P-value ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Age 20∼29 3 0 (0) 3 (100) 30∼39 10 3 (30.0) 7 (70.0) 40∼49 19 11 (57.9) 8 (42.1) NS 50∼59 10 5 (50.0) 5 (50.0) 60∼69 4 3 (75.0) 1 (25.0) 70∼79 2 0 (0) 2 (100) Tumor size 0∼2 cm 9 8 (88.9) 1 (11.1) 2.1∼5 cm 33 14 (42.4) 19 (57.6) 0.003 ＞5 cm 6 0 (0) 6 (100) Nodal metastasis (-) 20 10 (50.0) 10 (50.0) NS (+) 28 12 (42.9) 16 (57.1) Stage I 3 2 (66.7) 1 (33.3) IIa 21 12 (57.1) 9 (42.9) 0.030 IIb 18 8 (44.4) 10 (55.6) IIIa 6 0 (0) 6 (100) Histologic grade 1 4 4 (100) 0 (0) 2 22 9 (40.9) 13 (59.1) 0.036 3 22 9 (40.9) 13 (59.1) Nuclear grade 1 4 3 (75.0) 1 (25.0) 2 19 8 (42.1) 11 (57.9) NS 3 25 11 (44.0) 14 (56.0) ER (-) 21 10 (47.6) 11 (52.4) NS (+) 27 12 (44.4) 15 (55.6) PR (-) 10 6 (60.0) 4 (40.0) NS (+) 38 16 (42.1) 22 (57.9) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ NS = not significant.. c-erbB-2 종양유전자의 증폭을 검출할 수 있고, 형광제자리 부합화나 면역조직화학 염색에 의한 방법과 비교하여 볼 때 높은 일치율을 나타내는 방법으로 평가받고 있다.(13) 본 연구에서 색소원제자리부합화에 의한 c-erbB-2 종양유 전자의 증폭과 예후인자들과 비교하여 보았을 때 종양의 크기 및 병기와 연관성이 관찰되어 c-erbB-2 종양유전자의 증폭은 종양의 악성도를 나타내는 예후인자로서의 가치가 있다고 생각한다. 근래에 들어 유전자의 변화와 이로 인해 세포에 축적되. 는 단백들이 유방암의 진행과 예후에 미치는 영향을 규명 하기 위하여 세포주기 조절 인자들과의 연관성에 대한 연 구가 시행되고 있다.(10) kip1 세포주기 조절단백 중 억제인자의 하나인 p27 은 198개 의 아미노산으로 구성된 단백질로, 유전자는 12p13에 위치 하며 인체 종양에서 ink4군의 CDKIs와는 달리 유전자상의 kip1 돌연변이나 소실이 거의 없는 것으로 알려져 있다.(19) p27 은 cyclin E/CDKs, cyclin D/CDK4와 cyclin A/CDK2 복합체 에 결합하여 kinase 활성화를 억제함으로써 세포주기 중 G1.

(9) 22. 대한외과학회지：제 70 권 제 1 호 2006. E2F-1 (-)(%) (+)(%) 21 (61.8) 13 (38.2) 1 (7.1) 13 (92.9) 0.001 15 (65.2) 8 (34.8) 7 (28.0) 18 (72.0) 0.010 9 (52.9) 8 (47.1) 13 (41.9) 18 (58.1) NS 10 (47.6) 11 (52.4) 12 (44.4) 15 (55.6) NS 7 (31.8) 18 (69.2) 0.010. NS. NS 13 (61.9) 10 (37.0). 21 13 NS = not significant.. (-) (+) E2F-1 (P-value). 22 26. 15 19 (-) (+) Rb loss (P-value). 21 27. (-) (+) Cyclin D1 (P-value). 17 31. 21 (91.3) 13 (52.0) 23 25 (-) (+) loss p27 (P-value). kip1. (-) (+) C-erbB-2 (P-value). (n) 34 14. 14 20. 2 (8.7) 12 (48.0) 0.003 (82.4) 3 (17.6) (64.5) 11 (35.5) NS (71.4) 6 (28.6) (70.4) 8 (29.6) NS (95.5) 1 (4.5) (50.0) 13 (50.0) 0.001. 15 (68.2) 8 (30.8). 8 (38.1) 17 (63.0). 7 (41.2) 18 (58.1) 10 (58.8) 13 (41.9). 9 (40.9) 8 (30.8). 8 (38.1) 9 (33.3). NS. NS. 13 (59.1) 18 (69.2). 13 (56.5) 18 (72.0). 13 (61.9) 18 (66.7). 10 (45.5) 11 (42.3). NS. 12 (54.5) 15 (57.7). Rb loss (-)(%) (+)(%) 15 (44.1) 19 (55.9) 6 (42.9) 8 (57.1) NS 13 (56.5) 10 (43.5) 8 (32.0) 17 (68.0) NS 8 (47.1) 9 (52.9) 13 (41.9) 18 (58.1) NS D1 (+)(%) 20 (58.8) 11 (78.6). Cyclin (-)(%) 14 (41.2) 3 (21.4) NS 10 (43.5) 7 (28.0) NS (-)(%) 13 (38.2) 12 (85.7) 0.003 (+)(%) 21 (61.8) 2 (14.3). p27Kip1. C-erbB-2 (-)(%) (+)(%). Table 6. Correlation between amplification of c-erbB-2 oncogene and protein expressions of p27kip1, cyclin D1, Rb, and E2F-1. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 기에서 S기로의 진행을 차단해서 세포를 G1기에 머물게 한 다. 따라서 p27kip1의 감소는 암세포의 세포분열 억제 능력의 소실을 초래해서 급속한 성장을 유발시킨다고 알려져 있 kip1 다. 실험적으로 p27 유전자를 제거한 생쥐에서 다양한 장 기가 과형성되는 것을 확인할 수 있었고, 이를 통해 p27kip1 의 감소는 세포의 증식과 관계가 있다고 설명하고 있 kip1 다.(20) 하지만 인체 종양에서는 p27 유전자의 점 돌연변 이를 거의 발견할 수 없고, 단지 p27kip1 단백 발현 감소가 유방암, 위암, 대장암, 방광암 등에서 나쁜 예후 및 높은 재 발률과 연관성이 있다는 보고들이 있다.(9,19) 본 연구에서 kip1 단백 발현의 감소는 총 48예 중 25예인 52.1%에서 p27 관찰되었고, 종양의 크기가 커질수록 단백 발현 감소한 예 kip1 가 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 또한 p27 단백 발 현의 감소는 c-erbB-2 종양유전자의 증폭과도 연관성이 관 kip1 찰되었다. 이러한 결과는 c-erbB-2의 과발현과 p27 단백 발현의 감소가 연관성이 있다고 한 Loden 등(10)의 연구와 비슷한 결과를 보여주고 있다. 사람의 유전체에는 적어도 11개의 cyclin 유전자가 있고 이들은 3가지 종류로 분류된다. G1기 cyclin (C, D1-3, E, G, H), S기 cyclin (A, F), G2/M기 cyclin (A, B1-2)가 있고, 이들 과 결합하여 활성을 나타내는 1번부터 6번까지의 아형으로 분류되는 CDK가 있으며, 이들 각각은 세포주기 G1, S, G2, M기에 따라 발현양이 변화되어 세포주기 진행에 관여한 다.(8) 유방암, 두경부암, 식도암, 간세포암, 방광암 등에서 염색체 11q13이 증폭하여 cyclin의 발현이 증가되었음이 보 고되었고, 종양 세포주를 이용한 연구에서도 cyclin이 종양 형성에 관여한다고 알려져 있다.(21) Bartkova 등(22)은 cyclin D1 유전자 증폭 없이 cyclin D1 단백의 발현이 증가하 며, cyclin D1 유전자 증폭보다는 cyclin D1 단백의 과발현이 종양 형성과 더 밀접한 요소일 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서 cyclin D1 단백은 총 48예 중 17예인 35.4%에서 발현이 관찰되었고, 통계학적으로 유의성은 없었지만 종양 의 크기가 5 cm 이상인 군에서 발현 빈도가 높았고, 림프절 전이가 있는 군과 병기가 실험군 중에서 가장 높은 IIIa군에 서 높은 발현 빈도를 보여 종양의 형성과 진행에 영향을 미칠 것으로 생각한다. 하지만 본 연구에서 cyclin D1 단백 발현과 c-erbB-2 유전자 증폭과는 연관성이 관찰되지 않았 다. Cyclin과 CDKI들과 연관성을 가지는 Rb 유전자는 염색 체 13q14에 위치하며 정상 조직에서 발현하는 110 kD의 핵 내 인산 단백을 encoding하고, 세포조절 기전에서 성장억제 역할을 하는 주요 인자로 종양 발생에 관여한다.(23) 변이 나 결손이 있을 경우 그 단백의 생산이 감소하거나 기능이 소실되어 G1/S 이행 단계에의 조절에 이상을 초래하는데, 이때 cyclin D1/CDK4 복합체가 Rb 단백을 인산화시키면 그 결과 Rb 단백에 의해 억제되고 있던 E2F나 c-Abl, Elf-1과 같은 전사인자들이 활성화되면서 세포는 G1에서 S기로 들 어가게 된다고 알려져 있다.(24) Rb 단백의 기능적 불활성.

(10) 박봉근 외：유방의 C-erbB-2 종양유전자 증폭과 세포주기 조절단백 발현. 23. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 화는 유전자 변화를 수반하지 않고도 Rb 단백이 인산화되 었을 때 가능하다고 알려져 있는데 Rb 유전자의 단클론 항 체를 이용한 면역조직화학 염색법은 원인에 상관없이 결과 적으로 초래되는 활성 단백의 소실을 검출할 수 있는 유용 한 방법으로 알려져 있다.(25) 현재까지 여러 연구자들에 의하여 악성 종양과 Rb 단백에 관한 연구가 진행되어 왔지 만 연구자마다 각각 다른 결과들을 보고하고 있다. 유방암 에서 Rb 단백 발현과 예후인자적 가치에 대해서는 연구가 부족한 상태이기는 하나 몇몇 보고에 의하면 예후와는 연 관성이 없는 것으로 알려지고 있다.(26) Rb 단백 발현과 호 르몬 수용체의 연관성은 별로 연구되지 않았는데 본 연구 에서는 에스트로겐과 프로게스테론 수용체 모두에서 연관 성이 관찰되었고 호르몬 수용체가 양성인 군에서 Rb 단백 발현의 감소 비율이 높았으며 통계학적인 유의성도 에스트 로겐 수용체 유무에 따라서는 P=0.026, 프로게스테론 수용 체 유무에 따라서는 P=0.001로 나타났다. 이러한 결과는 Pietilainen 등(27)의 연구와 비슷한 경향을 나타내고 있는데, 이들의 연구에서는 통계학적으로 유의성은 없지만 에스트 로겐(P=0.2)에 비하여 프로게스테론(P=0.07)이 더 연관성이 깊은 것으로 보고하였다. 이와 같은 결과는 Rb가 종양억제 유전자로서 처음 알려지게 된 망막모세포종이나 그 후 다 른 종양에서 알려진 바와는 반대되는 결과이다. 그러나 최 근 림프종을 비롯한 연구에서는 종양의 악성도가 증가함에 따라 Rb 단백 발현이 오히려 증가하는 경우가 있다고 보고 하였다. 이들은 Ki-67로 측정한 종양세포의 증식능이 증가 할수록 Rb 단백 발현도 증가하였다고 보고하면서 그 설명 으로 Rb 단백이 세포의 종양성 성장을 억제하기 위해 세포 분열이 왕성할 때 이를 억제하기 위해 Rb 단백도 함께 증가 할 것이라고 주장하였다. E2F는 DNA 합성에 관련된 많은 유전자들의 전사를 조절 하는 전사 조절인자로 알려져 있는데 여기에 Rb 단백이 결 합하면 전사인자로서의 기능이 상실된다. cyclin D1/CDk4 복합체는 Rb에 직접 결합하여 mid-G1기에서 late-G1기 동 안 이를 인산화하는데 이렇게 Rb 단백질이 과인산화되어 E2F와 결합하지 못하게 되면 자유롭게된 E2F는 S기를 위하 여 필수적인 유전자 발현을 촉진시키는 것이 가능하게 되 어 세포주기는 G1기에서 S기로 진행하게 되는 것으로 알려 져 있다.(28) E2F 전사인자군은 c-myc, c-myb, proliferating cell nuclear antigen (PCNA)과 CDK2 kinase 등의 몇 가지 유 전자의 발현을 조절한다. E2F 전사인자군에는 E2F1에서 6 까지가 기술되어 있고, E2F1-3은 과발현시 S기의 진행을 유 발시키지만 E2F4-6은 그렇지 않다. E2F-1은 46 kDa의 아미 노산으로 구성되어 있으며 cyclin A binding domain을 가지 고 있고, E2F-1의 과발현이 세포의 증식을 자극하고 종양을 유발시키는 것으로 알려져 있다.(29) 유방암에서 E2F-1 단 백 발현에 관한 문헌은 찾아보기 힘들어 비교는 어렵지만 본 연구에서 E2F-1 단백 발현은 22예인 45.8%에서 관찰되. 었다. 종양의 크기가 0∼2 cm, 2.1∼5 cm, 5 cm 이상으로 증가할수록 E2F-1 단백 발현은 각각 11.1%, 57.6%, 100%로 통계학적으로 유의하게 발현 빈도가 증가하였고, 병기가 I 에서 IIA, IIB, IIIA로 진행함에 따라 E2F-1의 발현 빈도는 33.3%, 42.9%, 55.6%, 100%로 통계학적으로 유의하게 증가 하였으며, 조직학적 등급과도 연관성이 있었다. 이러한 점 으로 전사인자인 E2F-1은 유방암종에서 종양의 진행에 관 여하며 예후인자로서의 가능성이 있고 또한 c-erbB-2 유전 자 증폭과도 연관성이 인정되는 인자로 생각한다. kip1 세포주기 조절단백 상호간 발현의 연관성에서는 p27 단백 발현 감소와 E2F-1 단백 발현과의 연관성이 통계학적 kip1 으로 유의성이 있었으며, p27 단백 발현 감소와 cyclin D1 의 발현 및 Rb 단백 발현의 감소, 그리고 cyclin D1과 Rb 단백 발현의 감소 및 E2F-1 단백 발현, Rb 단백 발현의 감소 와 E2F-1 단백 발현 사이에는 연관성이 관찰되지 않았다. 하지만 여러 인자들의 상호 연관성을 검증하기에는 연구대 상의 수가 다소 부족하였던 것으로 생각을 하며 추후 좀 더 많은 예들에 대한 보완적인 연구가 필요할 것으로 생각 된다.. 결. 론. 유방의 침윤성 관암종에서 색소원제자리부합화에 의한 c-erbB-2 종양유전자 증폭과 세포주기 조절단백 발현의 연 관성을 알아보기 위하여 48예의 파라핀 포매조직을 대상으 로 색소원제자리부합화에 의한 c-erbB-2 종양유전자 증폭 kip1 을 검사하고, p27 , cyclin D1, Rb, E2F-1에 대한 면역조직 화학 염색을 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다. C-erbB2 종양유전자는 종양의 크기가 크고 병기가 높을수록 유전 kip1 자의 증폭을 보이는 예가 증가하였으며, p27 단백 발현의 감소는 종양의 크기와 연관성이 있었고, Rb 단백 발현은 호 르몬 수용체가 음성인 군에서의 발현빈도가 높았다. E2F-1 단백 발현은 종양의 크기가 크고, 병기가 높으며, 조직학적 등급이 나쁜 군에서 발현 빈도가 높았다. C-erbB-2 종양유 kip1 전자의 증폭은 p27 단백 발현의 감소 및 E2F-1 단백 발현 kip1 단백 발현의 감소와 과 연관성이 관찰되었으며, p27 E2F-1 단백 발현과도 연관성이 있었다. 결론적으로 c-erbBkip1 2 종양유전자의 증폭은 세포주기 조절단백 중에서 p27 과 E2F-1의 발현과 연관성이 있는 것으로 생각한다.. REFERENCES 1) Fisher ER. The impact of pathology on the biologic, diagnostic, prognostic and therapeutic considerations in breast cancer. Surg Clin North Am 1984;64:1073-93. 2) Beenken SW, Grizzle WE, Crowe DR, Conner MG, Weiss HL, Sellers MT, et al. Molecular biomarkers for breast cancer.

(11) 24. 대한외과학회지：제 70 권 제 1 호 2006. ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ. 3) 4). 5). 6) 7). 8) 9) 10). 11). 12). 13). 14). 15). prognosis: coexpression of c-erbB-2 and p53. Ann Sur 2001; 233:630-8. Ross JS, Fletcher JA. HER-2/neu (c-erbB-2) gene and protein in breast cancer. Am J Clin Pathol 1999;112:53-67. Shak S. Overview of the trastuzumab (Herceptin) anti-HER2 monoclonal antibody clinical program in HER-2 overexpressing metastatic breast cancer. Herceptin Multinational Investigator Study Group. Semin Oncol 1999;6:71-7. MacLachlan TK, Sang N, Giordano A. Cyclin, cyclin- dependent kinases and Cdk inhibitors: implication in cell cycle control and cancer. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1995;5: 127-56. Sherr CJ. Cancer cell cycles. Science 1995;274:1672-7. Ohtsubo M, Theodores A, Schumacher J. Human cyclin E, a nuclear protein essential for the G1 to S phase transition. Mol Cell Biol 1995;15:2612-24. Pines J, Hunter T. Cyclins and cancer II: cyclin D1 and CDK inhibitors come of age. Cell 1994;79:573-82. Mori M, Mimori L, Shirane M. p27 expression and gastric carcinoma. Nature Med 1997;3:593-7. Loden M, Perris F, Nielsen NH, Emdin SO, Landberg G. C-erbB2, p27 and G1/S aberrations in human primary breast cancer. Anticancer Res 2003;23:2053-61. Bloom HJ, Richardson WW. Histological grading and prognosis in breast cancer; a study of 1409 cases of which 359 have been followed for 15 years. Br J Cancer 1957;11:359-77. Frierson HF Jr, Wolber RA, Berean KW, Franquemont DW, Gaffey MJ, Boyd JC, et al. Interobserver reproducibility of the Nottingham modification of the Bloom and Richardson histologic grading scheme for infiltrating ductal carcinoma. Am J Clin Pathol 1995;103:195-8. Tanner M, Gancberg D, Di Leo A, Larsimont D, Rouas G, Piccart MJ, et al. Chromogenic in situ hybridization: a practical alternation for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol 2001;157:1467-72. Dean GS, Pusztai L, Xu FJ, O'Briant K, Desmombre K, Conaway M, et al. Cell surface density of p185 (c-erbB-2) determines susceptibility to anti-p185 (c-erbB-2)-ricin A chain (RTA) immunotoxin therapy alone and in combination with anti-p170 (EGFR)-RAT in ovarian cancer cells. Clin Cancer Res 1998;4:2545-50. Sutterlin MW, Haller A, Gassel AM, Peters K, Caffier H, Dietl J. The correlation of c-erbB-2 oncoprotein and established prognostic factors in human breast cancer. Anticancer Res 2000;20:5083-8.. 16) Yamauchi H, Stearns V, Hayes DF. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J Clin Oncol 2001;19:2334-56. 17) Tsuda H, Tani Y, Hasegawa T, Fukutomi T. Concordance in judgments among c-erbB-2 (HER2/neu) overexpression detected by two immunohistochemical tests and gene amplification detected by Southern blot hybridization in breast carcinoma. Pathol Int 2001;51:26-32. 18) Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ. Specificity of HercepTest in determining HER-2/neu status of breast cancers using the United states Food and Drug Administration-approved scoring system. J Clin Oncol 1999; 17:3690-2. 19) Catzavelos C, Bhattacharya N, Ung YC, Wilson JA, Roncari L, Sandhu C, et al. Decreased levels of the cell-cyclin inhibitor p27kip1 protein: prognostic implications in primary breast cancer. Nature Med 1997;3:227-30. kip1 20) Nakayama L, Ishida N, Shirane M. Mice lacking p27 display increased body size, multiple organ hyperplasia, retinal dysplasia, and pituitary tumors. Cell 1996;85:707-20. 21) Hinds PW, Dowdy SF, Eaton EN, Arnold A. Function of a human cyclin gene as a oncogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:709-13. 22) Bartkova J, Lukas J, Strauss M, Bartek J. The PRAD-1/cyclin D1 oncogene product accumulates aberrantly in a subset of colorectal carcinoma. Int J Cancer 1994;58:568-73. 23) Weinberg RA. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell 1995;81:323-30. 24) Kamb A. Cell cycle regulators and cancer. Trends Genet 1995; 11:136-40. 25) Yoo JY, Lee AW, Kang SJ, Kim BK. Expression of cyclin D1, p16 and proteins in human soft tissue sarcomas. J Korean Pathol 2001;35:238-44 26) T'Ang A, Varley JM, Chakraborty S, Murphree AL, Fung YK. Structural rearrangement of the retinoblastoma gene in human breast carcinoma. Science 1988;242:263-6. 27) Pietilainen T, Lipponen P, Aaltomaa S, Eskelinen M, Kosma VM, Syrjanen K. Expression of retinoblastoma gene protein (Rb) in breast cancer as related to established prognostic factors and survival. Eur J Cance 1995;31:329-33. 28) Nevins J. E2F: a link between Rb tumor suppressor protein and viral oncoprotein. Science 1992;58:424-9. 29) Nakamura T, Monden Y, Kawashima K, Nuruke T, Nishimura S. Failure to detect mutations in retinoblastoma proteinbinding domain of the transciption factor E2F-1 in human cancer. Jap J Cancer Res 1996;87:1204-9..

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