서 론
현미부수체 불안정성(MSI)은 1개에서 6개의 뉴클레오티 드가 반복되어 나타나는 현미부수체(1,2)의 불안정을 의미 하는데, 이는 부정합 교정유전자 이상에 의해 나타나는 것 으로, MSI가 있는 경우 유전자 돌연변이의 가능성이 많고, 이로 인해 암발생 가능성을 높이는 것으로 알려져 있다.(3) MSI는 현미부수체 표지자를 이용한 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 확인할 수 있는데, 현 미부수체 표지자들은 그 PCR 산물 고리의 증가나 소실 유 무에 따라 이형접합성 상실(loss of heterozygosity, LOH)까지 확인할 수 있다.(4,5) MSI에 관한 연구는 주로 대장암을 중 심으로 이루어지고 있는데,(6,7) 가족성 비용종성 대장암의 경우 MSI의 빈도가 높아서 일부에서는 약 90%까지 관찰된 다고 보고하였다.(8) 유방암의 경우 MSI 빈도가 비교적 낮 고, 0∼33%까지 다양한 빈도로 보고되고 있는데,(9,10) 최 근 젊은 여성에서 발견되는 유방암에서 그 빈도가 높은 것
현미부수체 표지자를 이용한 연령에 따른 유방암 환자의 분자생물학적 차이에 관한 연구
전남대학교 의과대학 외과학교실, 1병리학교실
서승원·윤정한·박민호·남종희1
Molecular Biological Differences Between Youn- ger and Older Breast Cancer Patients Based on the Status of a Microsatellite Marker
Seung Won Seo, M.D., Jung Han Yoon, M.D., Min Ho Park, M.D. and Jong Hee Nam, M.D.1
Purpose: Younger women exhibit more aggressive patho- logical features of breast cancer than older women, based on previous studies. We wished to evaluate any molecular biological differences in breast cancer between younger and older women by determining the status of a microsatellite marker.
Methods: Microsatellite instability (MSI) and loss of hetero- zygosity (LOH) were investigated in paired tumour and normal tissue DNA from 32 younger (age less than 40 years old) and 32 older (age more than 50 years old) breast cancer patients with 12 simple repeated primer sets.
Results: MSI was observed at a single locus in 5 (15.6%) of the younger patients. In older patients, MSI was observed at a single locus in 5 (15.6%) and at multiple loci in 1 (3.1%) of the older patients. LOH was noted at a single locus in 7 (21.8%) and at multiple loci in 22 (68.7%) of 32 younger patients. In older patients, LOH was noted at a single locus in 9 (28.1%) and at multiple loci in 15 (46.9%). The greatest frequency of LOH was at loci UT5320 (37.5%), D8S321 (34.4%), D9S242 (31.3%), and D19S394 (31.3%) in younger patients and at loci L17686 (34.4%) and D19S394 (28.1%) in older patients. LOHs at D19S394 and L17686 were highly identified in both age groups. LOHs at D9S242 and D8S321 were significantly higher in the carcinomas of younger women (P=0.013, P=0.016, respectively). The LOH status
책임저자：박민호, 전남 화순군 화순읍 일심리 160 ꂕ 519-809, 화순전남대학교병원 외과 Tel: 061-379-7646, Fax: 061-379-7661 E-mail: [email protected]
접수일：2005년 6월 29일, 게재승인일：2007년 4월 27일 본 논문의 요지는 2005년 대한외과학회 춘계학술대회에서 구연되 었음.
was unrelated to clinical stage, nodal status, tumour size, histological grade or estrogen receptor (ER) status. A LOH at D8S321 was associated with tumor size (P=0.048) and a LOH at UT5320 was associated with histological grade (P=0.012) and ER status (P=0.018).
Conclusion: These results indicate that the pattern of chromosomal alterations are not exactly the same, especially at loci D9S242 and D8S321, in the carcinomas of the two age groups and suggest that the molecular pathogenesis of the carcinomas is not similar. (J Korean Surg Soc 2007;72:
444-452)
Key Words: Microsatellite marker, Microsatellite instability, Loss of heterozygosity, Breast cancer 중심 단어: 현미부수체 표지자, 현미부수체 불안정
성, 이형접합성 상실, 유방암
Departments of Surgery and1Pathology, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea
444
으로 보고되고 있다.(11) LOH는 2개의 이종접합 대립유전 자 중 하나의 대립유전자의 소실이 있는 것으로 흔히 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)의 존재 가능성을 의미하 며, 이는 유방암에서 관찰되는 가장 흔한 유전자 변화 중의 하나로 알려져 있다.(12) 유방암에서의 LOH에 관한 보고는 염색체 전체에서 다양한 빈도로 보고되고 있는데, 최근까 지 보고된 LOH 유전자좌 중에서는 7q, 16q, 13q, 17p, 8p, 21q, 3p, 18q, 2q 및 19p 염색체의 LOH가 유방암 발암과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.(13)
한편, 우리나라 여성 암 중 가장 많은 유방암의 예후인자 로는 진단 당시의 연령, 종양의 크기, 림프절 전이 유무, 임 상병기, 조직학적 등급 및 여러 분자생물학적 인자들이 알 려져 있다.(14,15) 특히 저연령층의 여성에서 발견되는 유방 암은 고연령층의 유방암 환자에 비해 재발이나 전이를 잘 하고, 조직학적 분화도도 낮아 예후가 더 나쁜 것으로 알려 져 있다.(16,17) 최근 저연령층의 여성 유방암이 고연령층의 유방암에 비해 MSI나 LOH 발생률이 높아(11,18-20) 양자간 의 암 발생기전이 다를 것으로 보고하였지만, 그 분자생물 학적 차이점은 아직 확실치 않다.
이에 연구자는 저연령층과 고연령층의 여성에서 발생하 는 유방암의 분자생물학적 성상에 어떠한 차이가 있는지를 알아보고자, 12개의 현미부수체 표지자를 이용하여 MSI와 LOH 유무를 확인하고, 이들과 다른 유방암 예후인자들과 의 연관성을 비교하여 보았다.
방 법
1) 대상
2001년부터 2003년까지 전남대학교병원에서 유방암으로 진단 받아 유방절제술을 시행 받은 환자 중 파라핀 포매괴 의 보관상태가 양호한 40세 미만 32예와 50세 이상 32예를 대상으로 하였으며, 같은 환자의 정상 유방조직을 대조군 으로 하였다. MSI 및 LOH는 12개의 현미부수체 표지자를 이용하여 확인하였고, 유방암의 임상병리학적 예후인자와 의 연관성을 비교하였다.
2) MSI 및 LOH assay
(1) 종양조직으로부터 DNA의 추출: 종양부위와 비종양
Table 1. Microsatellite primer for MSI and LOH assay
Primer Primer sequence Annealing Temp. PCR cycle Repeat type
BAT25 5'-TCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3'
55oC 28
5'-TCTGGATTTTAACTATGGCTC-3'
BAT26 5'-TGACTACTTTTGACTTCAGCC-3' Mononucleotide
55oC 30
5'-GTTTCTAACCATTCAACATTTTTATCCC-3' repeat
BAT40 5'-GTAGAGCAAGACCACCTTG-3'
55oC 30
5'-GTTTCTACAACCCTGCTTTTGTTCCT-3'
D2S123 5'-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3'
55oC 35
5'-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3'
D17S250 5'-GGAAGAATCAAATAGACAAT-3' Dinucleotide
55oC 35
5'-GCTGGCCATATATATATTTAAACC-3' repeat
D8S554 5‘-TTTCCAGACAGGGCCTA-3'
58oC 35
5'-AATGCACAGGACATCCTTT-3'
MYCL1 5'-TGGCGAGACTCCATCAAAG-3'
58oC 35
5'-CCTTTTAAGCTGCAACAATTTC-3'
D19S394 5'-AGACTACAGTGAGCTGTGG-3'
58oC 35
5'-GTGTTCCTAACTACCAGGC-3'
D9S242 5'-GTGAGAGTTCCTTCTGGC-3'
56oC 35
5'-ACTCCAGTACAAGACTCTG-3' Tetranucleotide
UT5320 5'-ACCGACAGACTCTTGCCTC-3' repeat
58oC 35
5'-TTGAGATGACCCTGAGACTG-3'
D8S321 5'-GATGAAAGAATGATAGATTACAG-3'
58oC 35
5'-ATTCTTCTCATGCCATATCTGC-3'
L17686 5'-GCACCAATGCTCCAGAAATG-3'
63oC 35
5'-TCATGGTGCCATGATAGGAG-3'
부위를 선별하고 각각의 파라핀 포매괴를 10μm 두께로 박 절하여 통상적인 헤마톡실린 에오신 염색을 시행하였다.
광학현미경하에서 종양세포만을 선택적으로 미세 절제하 여 1.5 ml tube에 담은 후 DNA를 추출하였다. Xylene 1 ml를 넣고 충분히 섞어준 후 상온에서 10분간 방치하여 탈파라
핀시킨 후 14,000 rpm에서 10분간 원심 분리시켜 상층액을 버리는 과정을 2회 반복하였다. Xylene이 제거된 침전조직 에 100% 에탄올 1 ml를 넣어 충분히 섞은 후 14,000 rpm에 서 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하는 과정을 2회 실 시하였다. 침전물은 에탄올이 완전히 증발하여 흰 분말 상 Fig. 1. Microsatellite instability (MSI) of mono-, di-, and tetra-nucleo- tide repeat regions in breast carcinomas. N represents nor- mal DNA and T represents tumor DNA. Arrow head shows novel DNAs in the tumor DNA.
Fig. 2. Loss of heterozygosity (LOH) of mono-, di-, and tetra-nucleo- tide repeat regions in breast carcinomas. N represents nor- mal DNA and T represents tumor DNA. Arrow head shows allelic loss of the tumor DNA.
태가 될 때까지 dry oven에서 말린 후 TEN buffer (0.1 M NaCl, 10 mN Tris·Cl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) 375μl, 10% SDS 25μl, 20μg/μl proteinase K 15μl를 넣어 52∼
56oC에서 조직이 완전히 용해될 때까지 매 12시간마다 100 μg의 proteinase K를 넣어주며 충분히 방치하였다. 용해된 조직은 5 M NaCl을 100μl 첨가하여 섞은 후 10분간 원심 분리하여 proteinase K를 변성시키고, 상층액의 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)와 100% 에탄올을 넣어 원심 분리하여 DNA를 침전시켰다. 70% 에탄올로 수세한 후 적당량의 멸 균수에 추출한 DNA를 녹여 260 nm에서 흡광도를 측정하 여 DNA 농도를 결정하였다.
(2) Polymerase chain reaction: 추출한 DNA를 이용하여 tetranucleotide repeat region을 증폭하는 6개의 primer set와 dinucleotide repeat region을 증폭하는 3개의 primer set, mononucleotide repeat region을 증폭하는 3개의 primer set로 PCR을 시행하였다(Table 1). Autoradiography를 위해 primer
Table 2. Microsatellite instability (MSI) in breast cancer patients
Case MSI loci in younger patients
5 D8S321
13 L17686
22 D8S321
23 UT5320
28 MYCL1
Case MSI loci in older patients
2 UT5320
3 L17686
6 D8S554
16 D9S242
25 UT5320
32 D17S250 MYCL1 D9S242 D8S321
Table 3. Loss of heterozygosity (LOH) in younger patients
Case LOH loci
1 D8S321 L17686
2 D2S123 MYCL1 D8S321
3
4 BAT40 D8S554 UT5320 L17686
5 D8S321
6 D19S394
7 D19S394 L17686
8 MYCL1 UT5320 L17686
9 D19S394 L17686
10 D9S242 D8S321
11
12 D8S554 D9S242 UT5320 D8S321
13 D2S123 MYCL1 D19S394 D9S242 UT5320
14 D8S554 D8S321 L17686
15 D17S250 D19S394 D9S242 D9S242 UT5320 D8S321
16 BAT25 D17S250 D19S394
17 D17S250 D8S554 D19S394 D9S242 UT5320 D8S321
18 D17S250 UT5320 D8S321
19 D17S250
20 D17S250 D19S394 D9S242 UT5320 D8S321
21 MYCL1
22 D17S250 D19S394 UT5320
23 D8S554 UT5320
24 L17686
25 D8S554 UT5320
26 D9S242
27 MYCL1 D9S242
28 D9S242 UT5320
29 BAT40 D9S242
30
31 D8S554
32 MYCL1 D19S394 D8S321 L17686
set 중 reverse primer에 T4 polynucleotide kinase (TAKARA, Japan)를 이용하여 γ-32P[dATP]를 표지하였다. 효소반응은 30 pmol Reverse primer, 10μCi γ-32P[dATP], 1 X polynucleo- tide kinase buffer, 6U T4 polynucleotide kinase (TAKARA, Japan)를 넣고 총 부피를 10μl가 되도록 한 후 37oC에서 30 분간 방치하였다. 효소의 불활성을 위해 95oC에서 5분간 방 치한 후 4oC에 보관하고 사용 전에 3배 희석하여 각 PCR 혼합물당 1μl씩 사용하였다. 10 pmol forward primer, 1 pmol γ-32P[dATP] 표지 reverse primer, template DNA 50∼100 ng, 0.1 mM dNTP, 0.5 mM MgCl2, 1X PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.8, 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1U Taq polymerase (Supertaq, Korea)의 농도로 혼합 하고 총 부피는 20μl가 되도록 하여 thermal cycler (Perkin
Elmer 480, USA)에서 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 92oC 에서 7분간 전변성(predenaturation) 과정을 거친 후 92oC에 서 1분간 변성, 55∼63oC에서 1분간 annealing, 72oC에서 1분 간 extension 과정을 28∼35회 반복하고, 그 후 72oC에서 10 분간 방치하여 4oC에 보관하였다.
(3) MSI 및 LOH 여부 판정: PCR 산물은 95oC에서 10분 간 변성 후 4oC에서 5분 동안 방치하여, 7M Urea/6% Acryla- mide gel상에서 전기영동하였으며, -70oC에서 X-ray 필름 에 3∼6시간 감광한 후, 고리를 확인하여 MSI 및 LOH 유무 를 판정하였다.
3) 유의성 검증
유의성 검증은 SPSS 12.0 컴퓨터 프로그램을 이용하여 실시하였는데, LOH 유무와 종양의 크기와의 상관성은 student t test를, LOH 유무와 조직학적 등급, 림프절 침범 유무, 임상병기 및 ER과 CyclinD1 발현과의 상관성은 Pearson's chi-square test를 시행하여 확인하였다. P값이 0.05 Table 4. Loss of heterozygosity (LOH) in older patients
Case LOH loci
1 D17S250
2 UT5320
3 MYCL1
4 D19S394
5
6 D8S554 D19S394
7
8 D17S250 D19S394 UT5320
9 D2S123
10 D19S394 UT5320
11 MYCL1 D19S394 L17686
12 13
14 D8S554 MYCL1 L17686
15
16 D19S394 UT5320
17 D8S321
18 D17S250 MYCL1 D8S321
19 D19S394 UT5320
20 L17686
21 L17686
22 L17686
23 D17S250 D9S242
24 UT5320 L17686
25 D17S250 L17686
26 D17S250 D19S394 L17686
27
28 D19S394 L17686
29 30
31 D17S250 D8S554 D8S321 L17686
32 BAT40 D9S242 L17686
Table 5. Clinicopathologic correlation according to patient age
＜40 years ＞50 years P-value
Tumor size (cm) 0.231
＜2 8 (25.0) 8 (25.0)
2∼5 21 (65.6) 20 (62.5)
＞5 3 (9.4) 4 (12.5)
Histologic grade 0.192
I 10 (31.3) 4 (12.5)
II 17 (53.1) 22 (68.8)
III 5 (15.6) 6 (18.8)
Lymph node status 0.524
0 15 (50.0) 15 (46.9)
1∼3 10 (33.3) 9 (28.1)
4＜ 5 (16.7) 8 (25.0)
Stage 0.877
I 5 (15.6) 6 (18.8)
II 20 (62.5) 18 (56.2)
III 7 (21.9) 8 (25.0)
ER status 0.401
Positive 8 (27.6) 11 (37.9) Negative 21 (72.4) 18 (62.1)
Cyclin D1 status 0.201
Positive 21 (65.6) 13 (41.9) Negative 11 (34.4) 18 (56.1)
LOH 0.146
Negative 3 (9.5) 8 (25.0)
Single 7 (21.8) 9 (28.1)
Multiple 22 (68.7) 15 (46.9)
ER = estrogen receptor; LOH = loss of heterozygosity. Numbers in parenthesis mean percent.
미만을 유의성이 있는 것으로 하였다.
결 과
MSI는 정상에 비하여 종양의 DNA에서 새로운 고리가 나타나는 경우, LOH는 고리의 소실이나 분명한 감소가 관 찰되는 경우로 하였다(Fig. 1, 2). MSI 빈도는 전반적으로 낮 았고, 50세 이상 1예를 제외하고 모두 하나의 locus에서만 관찰되었으며, 40세 미만에서 5예(15.6%), 50세 이상에서 6 예(18.8%)로 고령에서 약간 높게 나타났다. MSI locus는 mononucleotide-MSI (mono-MSI)나 dinucleotide-MSI (di-MSI) 가 2예, tetranucleotide-MSI (tetra-MSI)가 12예(40세 미만에서 5예, 50세 이상에서 7예)로 tetra-MSI가 더 많았다(Table 2).
LOH는 40세 미만에서 1 locus LOH가 7예(21.8%), 2 locus 이상 LOH가 22예(68.7%)로 총 29예(90.5%)였으며(Table 3), 50세 이상에서 1 locus LOH가 9예(28.1%), 2 locus 이상 LOH 가 15예(46.9%)로, 총 24예(75.0%)였다(Table 4). 연령에 따 른 LOH 빈도차이는 통계적인 유의성이 없었다(P=0.146)
(Table 5). 40세 미만에서 빈도가 높은 LOH locus는 UT5320 (12예, 37.5%), D8S321 (11예, 34.4%), D9S242 (10예, 31.3%), D19S394 (10예, 31.3%)였으며, 50세 이상에서 빈도가 높은 LOH locus는 L17686 (11예, 34.4%), D19S394 (9예, 28.1%), D17S250 (7예, 21.9%), UT5320 (6예, 18.8%)이었다(Table 3, 4). 연령에 상관없이 빈도수가 높았던 locus는 D19S394 (40 세 미만 10예와 50세 이상 9예)와 L17686 (각각 8예와 11예) 이었다. 그리고 40세 미만과 50세 이상 양자간에 빈도 차이 가 높았던 LOH locus는 D9S242 (40세 미만 10예와 50세 이 상 2예) 및 D8S321 (각각 11예와 3예)로 통계적으로 유의하 게 40세 미만에서 빈도가 높게 관찰되었다(각각 P=0.013, 0.016)(Table 3, 4).
연구대상 환자의 평균 연령은 40세 미만군은 33.9세, 50 세 이상군은 59.0세였으며, 평균종양의 크기는 각각 2.73 cm와 2.93 cm였다. 단일 종양이 각각 23예와 28예였고, 종 양의 위치는 주로 유방의 상외측부에 존재하였다. 환자의 연령에 따른 종양의 크기(P=0.231), 조직학적 등급(P=0.192), 림프절 침범 유무(P=0.524), 임상병기(P=0.877)와의 연관성
Table 6. Clinicopathologic correlation according to LOH status between younger and older patients
＜40 years ＞50 years
LOH status P-value LOH status P-value
Negative Single Multiple Negative Single Multiple
Tumor size (cm) 0.256 0.383
＜2 1 (33.3) 2 (28.6) 5 (22.7) 1 (12.5) 4 (40.0) 4 (28.6)
2∼5 2 (66.7) 5 (71.4) 14 (63.6) 6 (75.0) 5 (50.0) 9 (64.3)
＞5 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (13.7) 1 (12.5) 1 (10.0) 1 (7.1)
Histologic grade 0.385 0.472
I 1 (33.3) 4 (57.0) 5 (22.7) 1 (14.3) 1 (11.1) 1 (6.4)
II 1 (33.3) 2 (28.7) 14 (63.6) 6 (85.7) 6 (66.7) 11 (68.6)
III 1 (33.3) 1 (14.3) 3 (13.7) 0 (0.0) 2 (22.2) 4 (25.0)
Lymph node status 0.461 0.447
0 1 (33.3) 3 (50.0) 11 (52.4) 4 (50.0) 5 (55.6) 6 (60.0)
1∼3 1 (33.3) 2 (33.3) 6 (28.6) 3 (37.5) 3 (33.3) 3 (30.0)
4＜ 1 (33.3) 1 (16.7) 4 (19.0) 1 (12.5) 1 (11.1) 1 (10.0)
Stage 0.611 0.127
I 0 (0.0) 1 (14.3) 4 (18.2) 0 (0.0) 3 (33.3) 3 (20.0)
II 3 (100) 5 (71.4) 12 (54.6) 7 (87.5) 5 (55.6) 6 (40.0)
III 0 (0.0) 1 (14.3) 6 (27.2) 1 (12.5) 1 (11.1) 6 (40.0)
ER status 0.109 0.711
Positive 1 (33.3) 4 (57.1) 3 (15.8) 4 (50.0) 2 (33.3) 5 (33.3)
Negative 2 (66.7) 3 (42.9) 16 (84.2) 4 (50.0) 4 (66.7) 10 (66.7)
Cyclin D1 status 0.036 0.117
Positive 1 (33.3) 5 (71.4) 15 (68.2) 6 (85.7) 3 (33.3) 4 (26.7)
Negative 2 (66.7) 2 (28.6) 7 (31.8) 1 (14.3) 6 (66.7) 11 (73.3)
ER = estrogen receptor; LOH = loss of heterozygosity. Numbers in parenthesis mean percent.
은 없었다(Table 5). 연령에 따른 ER 유무는 상관성이 없었 고(P=0.401, Table 5), 통계적인 유의성은 없었으나 LOH가 있는 경우 ER 음성예가 많은 경향이었다(Table 6). Cyclin D1 발현은 40세 미만에서 21예(65.6%)로, 50세 이상 13예 (40.6%)에 비해 높게 관찰되었으나 통계학적 유의성은 없 었다(P=0.201)(Table 5). 각 연령군에서 LOH 유무에 따른 임 상병리학적 예후인자들과의 상관성은 없었다(Table 6). 40 세 미만에서 비교적 빈도가 높았던 locus의 LOH 유무와 임 상병리학적 예후인자와 비교하여 보면, D8S321 LOH의 경 우 종양의 크기가 컸으며(P=0.048), UT5320 LOH의 경우 조 직학적 등급이 높았고(P=0.012) ER 음성예가 많았다 (P=0.018)(Table 7).
고 찰
MSI의 확인을 위한 현미부수체 표지자로는 주로 mono- nucleotide나 dinucleotide repeat를 확인할 수 있는 표지자를 많이 이용하고 있다.(4-7) 최근 tetranculeotide repeat marker
가 MSI 확인에 이용될 수 있고, tetra-MSI를 보이는 종양이 mono-MSI 또는 di-MSI 종양과는 분자생물학적 발생기전이 다르다고 알려졌다.(21) 유방암을 대상으로 한 연구는 대부 분 mononucleotide나 dinucleotide marker를 이용한 것으로 tetranucleotide marker를 이용한 연구는 거의 없다. 본 연구 에서는 MSI 연구에 자주 사용되고 있는 mononucleotide와 dinucleotide marker뿐만 아니라 tetranucleotide marker를 사용 하여 MSI 여부를 확인하여 보았다. 본 연구에 의하면, MSI 는 40세 미만에서 5예(15.6%), 50세 이상에서 6예(18.8%) 로 고령에서 약간 높게 나타났다. 또한, MSI locus는 mono- MSI나 di-MSI가 2예, tetra-MSI가 12예(40세 미만에서 5예, 50세 이상에서 7예)로 tertra-MSI가 더 많았으나 전체적인 MSI의 빈도가 낮아 그 의미를 유추하기는 어려웠다. 본 연 구에서 유방암의 MSI 빈도가 낮은 것은 다른 연구 보고들 (9,10)의 결과와 유사하였는데, 이는 유방암의 발암과정에 부정합교정 유전자의 변화가 큰 역할은 하지 않을 것임을 시사해 주는 소견으로 생각되었다. 이는 본 연구에서 부정 합교정 유전자 중의 하나인 MSH2가 위치하는 2p locus를 Table 7. Clinicopathologic correlation according to LOH loci showing increased frequency in younger patients
LOH loss
Factors D9S242 D8S321 UT5320
P-value P-value P-value
- + - + - +
Tumor size (cm) 0.740 0.048 0.719
＜2 6 (27.3) 2 (20.0) 3 (15.0) 4 (36.4) 6 (30.0) 2 (16.7)
2∼5 13 (59.1) 8 (80.0) 16 (80.0) 5 (45.5) 13 (65.0) 8 (66.6)
＞5 3 (13.6) 0 (0.0) 1 (5.0) 2 (18.1) 1 (5.0) 2 (16.7)
Histologic grade 0.639 0.726 0.012
I 8 (36.4) 2 (20.0) 6 (30.0) 4 (36.4) 10 (50.0) 0 (0.0)
II 11 (50.0) 6 (60.0) 10 (50.0) 6 (54.5) 8 (40.0) 9 (75.0)
III 3 (13.6) 2 (20.0) 4 (20.0) 1 (9.1) 2 (10.0) 3 (25.0)
Lymph node status 0.812 0.391 0.272
0 10 (47.6) 5 (55.6) 11 (55.0) 3 (33.3) 8 (42.1) 7 (63.6)
1∼3 6 (28.6) 3 (33.3) 5 (25.0) 4 (44.5) 5 (26.3) 4 (36.4)
4＜ 5 (23.8) 1 (11.1) 4 (20.0) 2 (22.2) 6 (31.6) 0 (0.0)
Stage 0.693 0.216 0.859
I 4 (18.2) 1 (10.0) 1 (5.0) 3 (27.3) 3 (15.0) 2 (16.7)
II 12 (54.5) 8 (80.0) 15 (75.0) 5 (45.4) 12 (60.0) 8 (66.6)
III 6 (27.3) 1 (10.0) 4 (20.0) 3 (27.3) 5 (25.0) 2 (16.7)
ER status 0.192 0.516 0.018
Positive 7 (35.0) 1 (11.1) 5 (26.3) 3 (33.3) 8 (42.1) 0 (0.0)
Negative 13 (65.0) 8 (88.9) 14 (73.7) 6 (66.7) 11 (57.9) 10 (100)
Cyclin D1 status 0.206 0.826 0.145
Positive 17 (77.3) 4 (40.0) 13 (65.0) 8 (72.7) 15 (75.0) 6 (50.0)
Negative 5 (22.7) 6 (60.0) 7 (35.0) 3 (27.3) 5 (25.0) 6 (50.0)
ER = estrogen receptor; LOH = loss of heterozygosity; - = LOH negative; + = LOH positive. Numbers in parenthesis mean percent.
확인할 수 있는 BAT26의 MSI나 LOH 예가 전혀 관찰되지 않은 점과도 일치하는 것으로 생각되었으며, 이러한 결과 는 Siah 등(22)의 보고와 일치하였다.
한편, 인체 여러 종양에서 염색체의 소실이나 결손이 흔 히 관찰되고, 결손 부위에 존재하는 종양 억제 유전자가 종 양발생에 깊이 관여하는 것으로 추측되고 있다.(23) 이러한 종양 억제 유전자가 기능을 소실하기 위해서는 한 쌍의 대 립 유전자가 모두 소실되거나 한쪽 종양 억제 유전자의 돌 연변이와 나머지 대립 유전자의 소실을 동반해야만 가능한 데, 종양 억제 유전자의 돌연변이는 나머지 대립 유전자의 소실을 흔히 동반하므로 특정 위치의 대립 유전자의 LOH 를 분석함으로써 종양 억제 유전자의 존재를 확인할 수 있 다.(24,25) 대립 유전자 소실은 처음에는 제한효소 분절길이 다형성(restriction fragment length polymorphism, RFLP)기법 을 이용하여 분석하였으나 비용이 비싸면서 시간이 많이 걸리고, 안전성이나 해석상의 어려움, 그리고 분석을 할 수 없는 동종 접합체가 많이 나오는 결점이 있어서 근래에는 현미부수체의 다형성을 이용한 중합 효소 연쇄 반응기법을 많이 이용하게 되었다.(26)
유방암의 LOH에 대한 보고는 상당히 방대하고 사용한 표지자와 방법에 따라 다양한 locus에서, 다양한 빈도로 보 고되고 있다.(4,5,10-13) 최근 Miller 등(13)이 유방암의 LOH 에 관한 151개의 연구논문들을 종합하여 유방암 LOH가 염 색체 전체에서 관찰되지만 그 중 7q, 16q, 13q, 17p, 8p, 21q, 3p, 18q, 2q 및 19p 염색체의 LOH가 유방암 발암과정에 중 요한 역할을 하는 것으로 보고하였다. 본 연구에서는 이 중 7q (L17686), 8pter-qter (D8S554), 8p (UT5320, D8S321), 19p (D19S394) 염색체의 LOH를 확인할 수 있는 표지자가 포함 되어 있었는데 이 중 7q의 LOH가 전체 64예 중 19예, 19p의 LOH가 19예로 전체 12개의 표지자 중 가장 높게 관찰되어 Miller 등(13)의 보고와 유사하였다. 추후 해당 locus에 대한 세세한 연구가 이루어진다면, 유방암과 연관된 종양억제유 전자의 역할을 포함한 유방암 발암과정에 대한 이해의 폭 을 넓힐 수 있을 것으로 생각되었다.
본 연구에서 LOH는 비교적 빈번하게 관찰되어 유방암 발암과정에서 종양억제유전자의 역할이 중요할 것으로 생 각되었다. 연령에 따른 전체적인 LOH 빈도차이는 없었으 나, 각각의 locus의 연령에 따른 빈도 차이가 몇 개의 locus 에서 관찰되었다. 이 중 40세 미만에서 빈도가 높은 LOH locus는 UT5320, D8S321, D9S242, D19S394였으며, 50세 이상 에서 빈도가 높은 LOH locus는 L17686, D19S394, D17S250, UT5320이었다. 연령에 상관없이 빈도수가 높았던 locus는 D19S394와 L17686이었으며, 40세 미만과 50세 이상 양자간 에 빈도 차이가 높았던 LOH locus는 D9S242 및 D8S321로, 유방암의 일부는 연령에 따라 분자생물학적 발암기전이 다 를 것으로 예상되지만 이들에 대해서는 추후 더 많은 예에 대한 연구가 필요할 것으로 생각되었다.
본 연구에서 환자의 연령에 따른 종양의 크기, 조직학적 등급, 림프절 침범 유무, 임상병기 및 ER 유무와의 연관성 은 없어서 다른 보고들(16,17)과 상이하였는데, 이는 본 연 구에 포함된 환자들에 대한 추적조사를 통해 실제 환자의 예후를 확인할 필요가 있을 것으로 생각되었다. 각 연령군 에서 전체 LOH 유무에 따른 임상병리학적 예후인자들과의 상관성은 없었다. 40세 미만에서 비교적 빈도가 높았던 locus의 LOH 유무와 임상병리학적 예후인자와 비교하여 보 면, UT5320 LOH의 경우 조직학적 등급이 높고, ER 음성예 가 많았으며, D8S321 LOH의 경우 종양의 크기가 커서, UT5320과 D8S321의 LOH가 40세 미만 환자의 예후인자로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였지만, 이 또한 추후 검색 이 필요할 것으로 생각되었다.
결 론
40세 미만의 저연령층 유방암의 MSI의 빈도는 비교적 낮 으나 LOH의 빈도는 높은 경향을 보이고, D9S242 및 D8S321 LOH의 출현빈도가 높아 연령에 따라 유방암 발암 과정에 차이가 있음을 알 수 있었다. 앞으로 본 연구에서 LOH가 높게 관찰된 염색체에 대한 자세한 연구를 통해서 잠정적 종양 억제 유전자의 위치를 확인하고 침윤성암뿐 아니라 상피내암 단계의 병변을 포함한 연구를 통해 각 연 령군에서의 상관성을 다시 확인할 필요가 있다고 생각된다.
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