제55권 제6호 ( 부록 ) : 위암 조직의 종양 혈관 신생 정도 및 염기성 섬유 모세포 성장 인자(bFGF) 발현과 예후와의 관련성 (Significance of Angiogenesis and bFGF Expression in the Prognosis of Gastric Cancer)

Vol. 55, No. 6(Suppl), December, 1998

위암 조직의 종양 혈관 신생 정도 및 염기성 섬유 모세포 성장 인자(bFGF) 발현과 예후와의 관련성

서울대학교 의과대학 외과학교실 및 ¹이화여자대학교 의과대학 외과학교실

김 영 우 * ・김 진 복^# ・한 호 성¹ ・배 재 문¹ ・양 한 광

= Abstract =

Significance of Angiogenesis and bFGF Expression in the Prognosis of Gastric Cancer

Young-Woo Kim, M.D.*, Jin-Pok Kim, M.D., Hon FACS

Jae-Moon Bae, M.D.

Department of Surgery, College of Medicine, Seoul National University and

1Department of Surgery, College of Medicine, Ewha Womans University

Background : In order to evaluate the clinical relevance of angiogenesis in patients with gastric cancer, the authors investigated the microvessel count in gastric cancer tissues and compared the results with several clinicopathological factors and the prognosis. The production of basic fibroblast growth factor (bFGF) which is known to have strong angiogenic activity in gastric cancer, was also evaluated. In addition the relationship between the expression of bFGF in human gastric carcinoma tissues and tumor angiogenesis, as well as patient outcome, were investigated.

Methods: Formalin-fixed paraffin-embedded gastric cancer tissues from 97 randomly selected patients who underwent radical gastric resections in 1990 at Seoul National University Hospital were used and microvessels were stained with factor VIII-related antigen polyclonal antibody, and bFGF immunostaining was performed with polyclonal anti-bFGF antibody. The microvessel count was determined in 200 microscopic field. Conventional H&E stained tissue slides were reviewed again and patient survival were followed up. The relationships among angiogenesis, bFGF expression, and pathological parameters were analyzed with the Student t-test, the ANOVA test, and the chi-square test. The survival rate was calculated with the Kaplan-Meyer method and a Log-rank test was done for analysis of prognostic factors.

Result: The microvessel count ranged from 22 to 2 10, and the median count was 61. The microvessel count was significantly lower in patients with early gastric cancer or EGC mimicking advanced gastric cancer. Lymph node metastasis, depth of invasion, and Lauren 's and Ming's classification were notsignificantly related with microvessel count, even though there was some tendency. bFGF expression was strong in undifferentiated carcinomas, Borrmann type III & IV, deeper invasion, and higher stage.

책임저자 ：김영우, 서울시 양천구 목 6동 911-1, 우편번호 : 158-710, 이대목동병원 일반외과 접수일 ：1998년 7월 29일, 게재승인일 ：1998년 9월 24일

*이 논문의 요지는 1998년도 대한외과학회 추계학술대회에서 구연발표되었음 .

*현재 : 이화여자대학교 의과대학 외과학교실 전임강사

#현재 : 인제대학교 서울백병원 중앙의료원장 한국위암센터 원장

973

서 론

암의 원인과 치료 방법에 대한 많은 연구에도 불 구하고 아직 대부분의 암에 있어 획기적인 치료 방 법이 나오지 않고 있다. 특히 위암, 간암, 폐암, 대 장암, 유방암, 자궁경부암 등 우리나라에 많은 암들 가운데 이미 조기 진단의 시기를 지나 진행성암이 된 경우에는 수술에 의한 치료 가능성이 적어 화학 요법 등의 전신적 요법을 반드시 실시하여야 하나 대부분 반응률이 매우 낮고 내성이 자주 생기며 화 학요법의 독성에 의한 부작용 등이 있어 새로운 형 태의 항암 요법이 요구되고 있다.

혈관의 신생이 종양의 성장에 미치는 영향에 대 해 처음으로 밝힌 Folkman은 종양 내의 종양 세포 군과 내피 세포군 은 고도의 통합된 생태계를 이루 고 있다고 기술하고 항 혈관 형성 치료가 고려할만 한 암 치료의 한 방법이라고 이미 주장한바 있다.

혈관 신생은 태생기, 월경시 자궁 내막층의 조절, 창상 치유시에 매우 엄밀한 조절을 받으며 이루어 지는 과정이나 이외에 여러 병적 상태 즉, 고형 종 양, 류마티스성 관절염, 당뇨성 망막증 등의 상태에 서는 정상적인 조절의 체계에서 벗어나게 된다. 종 양에 있어서 새로운 혈관의 생성은 종양 세포 자체 에서 분비되는 물질에 의해 기존의 내피 세포가 자 극을 받아 이루어지게 되며 이 과정은 종양의 성장, 침윤, 그리고 원격 전이에 매우 중요한 역할을 한다 고 알려져 있다.

동물실험을 통해서도 이러한 혈관 신생 인자가 비정상적인 세포의 성장에 관여해 암 을 유발한다는 결과가 보고되고 있다.

최근 들어 여러 종양에서 혈관 신생 인자의 발현과 함께 혈관 신생을 면역 조직 화학적 방법으로 혈관 염색을 하 여 비교하여 보았을 때 환자의 예후와의 연관성이 있음이 보고되고 있다. 현재 혈관 신생 인자로 알려

진 물질은 20여 가지로 그 가운데 주로 basic fi- broblast growth factor(bFGF),

vascular endothelial growth factor(VEGF),

TGF-,

platelet derived endo- thelial growth factor(PDEGF),

pleiotrophin(PTN) 등이 관여되고 있는 것으로 알려져 있다.

Bennett등은 1989년 위암 조직에서 TGF-alpha, EGFR, PDGF 등의 성장 인자들의 mRNA가 발현됨을 증명 하고 이러한 인자들이 종양의 변이와 성장에 관여 함을 시사한 바 있다.

또한 Chung등은 1992년 위암 조직에서 PDGF, IGF-I, TGF-alpha 등의 m-RNA와 그 들 수용체의 m-RNA를 in situ hybridization과 면역 조직 화학적 염색의 방법으로 발현 유무를 관찰한 바 있는데 위암 조직에서 이러한 성장 인자들이 종양 의 성장과 유지에 관여할 것으로 제시한 바 있다.

종양 혈관에 대한 기존의 연구들은 혈관 신생 물 질의 발현 여부와 이의 조직학적 요소와의 연관만 으로 종양의 진행에 미치는 영향을 논하거나 종양 주위의 혈관 신생의 정도가 종양의 진행 및 전이와 연관이 된다고 주장해 왔다. 그러나 어떠한 인자가 종양의 진행도와 연관성이 있다고 하더라도 실제 환자의 생존률 분석을 통한 검증을 거쳐야만 예후 인자로서의 가치를 정확히 알 수 있다고 생각된다.

본 연구에서는 위암에서 혈관 신생의 정도와 혈관 신생 인자인 염기성 섬유 모세포 성장 인자의 발현 도를 조사하고 조직학적 요소 및 병기와의 연관성 뿐 아니라 환자의 생존 분석을 통해 예후 인자로서 의 가치를 평가하고자 하였고 이러한 분석을 통해 궁극적으로는 위암 치료에 있어 혈관 신생이나 혈 관 신생 물질이 새로운 생물학적 치료의 표적으로 서의 가능성이 있는지를 고찰해 보고자 하였다.

대 상 및 방 법

서울대학교병원 외과에서 1990년 1월부터 같은 However, there was no significant difference of survival rate between the higher and the lower vascular groups and between the strong and the weak bFGF expression groups.

Conclusions: Microvessel count and bFGF expression are presumed to be related with tumor pro- gression. However, their prognostic value was not significant in this study. In view of profuse angiogenic activities and expression of angiogenic growth factor, future therapeutic targeting for angiogenesis could be reasonable in patients with gastric cancer.

Key Words: Gastric cancer, Angiogenesis, Basic fibroblast growth factor, Prognosis

해 12월 사이에 위암으로 진단이 되어 근치적 절제 수술을 받은 환자들 가운데 126예를 무작위 추출하 여 병리과에 보관되어 있는, 포르말린으로 고정시킨 후 된 파라핀에 포매된 원발 위암 조직 블럭을 찾 아 이가운데 분실된 것과 보관 상태가 좋지않은 것 을 제외한 97예의 블럭을 5 m의 두께로 절편하여 면역 조직 화학적으로 Factor VIII related antigen염색 을 하였다. 종양의 육안적 형태, 종양의 위치, 림프 절 전이의 유무, 원격 전이 여부 등은 환자의 의무 기록상의 병리 보고서와 수술 기록표를 검토하였고 침윤의 정도, 조직학적 분화도 및 형태, Lauren 분 류, Ming 분류 등은 보관되어 있는 당시의 헤마톡실 린-에오신 염색된 조직 표본을 찾아 한 명의 병리 의사가 일관성 있게 재판독하였다.

환자의 생존 여부는 일차적으로 의무 기록지를 검토하였고, 추적이 되지않은 경우 서울시 경찰청의 사망자 자료를 전산으로 탐색하여, 그 결과 97예 모 두에서 생사 여부 및 사망 일자를 파악할 수 있었다.

1) 면 역 조 직 화 학 적 염 색

면역 조직 화학적 염색에는 Factor VIII related antigen에 대한 일차 항체로 Rabbit polyclonal 항체 (DAKO Code No. 0082, Lot 105)를 사용하였고, 염기성 섬유 모세포 성장 인자에 대한 일차 항체로 는 역시 Rabbit polyclonal 항체(Calbiochem Cat#

PC 16)를 사용하였다. 나머지의 과정에는 모두 Vecta- stain사의 ABC kit를 이용하여 염색하였다.

우선 파라핀에 포매된 위암 조직(primary tumor)블 럭을 5 m의 두께로 절편하여 슬라이드에 고정시키 고 슬라이드를 Xylene에 40분간 담구어 파라핀을 제 거하였다. 100% 및 95% ethanol로 각각 10분씩 2회 함수시킨 후 증류수로 30분간 세척하고 0.2% Tryp- sin용액으로 15분간 37

C에서 반응 시켰다. Endoge- nous peroxidase의 활성을 억제하기 위해 3% hydro- gen peroxide를 충분히 조직 슬라이드에 떨어뜨려 5 분간 방치한 후 phosphate buffered saline(이하 PBS라 칭함)으로 세척하였다. 일차 항체의 물리적 요소에 의한 비특이적 결합을 막기 위해 pH 7.6의 0.05 M Tris/HCl buffer로 희석되고 6%의 carrier protein과 15 mM의 sodium azide를 포함한 non-immune goat serum (blocking serum)을 충분히 조직을 덮을 수 있도록 떨어뜨린 후 30분간 방치하였다. 그 후 nonimmune

goat serum으로 40배 희석한 일차항체인 anti-bFGF monoclonal antibody를 충분히 조직을 덮을 수 있도 록 떨어뜨린 후 30분간 방치하였다. 그 후 Biiotiny- lated antirabbit and antimouse immunoglobulin(link an- tibody)을 충분히 조직을 덮을 수 있도록 떨어뜨린 후 30분간 방치하였다. 희석된 streptavidin을 충분히 조직을 덮을 수 있도록 떨어뜨린 후 30분간 방치하 고 기질 용액인 DAB를 충분히 조직을 덮을 수 있 도록 떨어뜨린 후 2분간 방치하였다. 비수용성인 Har- ris' hematoxylin으로 15 ～20분간 대조 염색을 하였다.

2) 면 역 조 직 화 학 염 색 결 과 의 판 독

(1) 혈 관 신 생 의 정 도 : 염색이 끝난 조직은 Wei- dner등의 방법을 사용하여 혈관 신생의 계수를 하였 다.

100배의 배율로 광학 현미경으로 관찰하여 염 색이 강하게 된 영역을 결정한 후 200배의 배율로 조정한 후 사진 촬영을 하여 5 7 inch 크기로 인화 하여 확대경으로 정확히 미세 혈관의 형태를 관찰 하여 사진내의 모든 혈관의 갯수를 세었다.

(2) 염 기 성 섬 유 모 세 포 성 장 인 자 의 발 현 도 : 염 색 결과의 판독은 3분법을 이용하였다. 즉, 전체의 암세포 중 염색이 거의 안된 것을 음성( )으로, 전 체중 드문 드문 국소적으로 염색된 것을 약양성( ) 으로, 전체 암세포의 대부분이 진하게 염색된 것을 강양성( )으로 판독하였다.

(3) 통 계 적 분 석 : 여러 조직학적 요소와 혈관 신생 의 정도와의 관계를 Student t-test와 ANOVA 검정으 로 분석하였고, 염기성 섬유 모세포 성장 인자와 조 직학적 요소와의 관련성은 카이 스퀘어 검정으로 분석하였다. 생존율은 카플란-마이어법으로 구하였 으며 예후와의 연관성은 Log-rank test로 검정을 하 였다. 통계적 유의 수준은 모두 p ＜0.05로 하였다.

각 측정치의 값은 평균 표준 편차로 표시 하였다.

이러한 분석은 모두 SAS(version 6.04, release 6.11) 프로그램을 이용하였다.

결 과

1) 위 암 조 직 의 미 세 혈 관 계 수 와 조 직 학 적 요 소와 의 연관 성

위암 조직에서의 factor VIII realated antigen의 면

역 조직 화학적 염색은 각각 양성 대조군과 음성

대조군의 염색으로 염색의 특이성을 확보하였다. 미 세 혈관의 계수 결과 평균 67.8 33.7개로 종양 세 포 주변에 신생 혈관이 분포함을 확인하였다(Fig.

1). 최소 22개부터 최대 210개까지 분포하였고 중간 값은 61개이었다. 종양의 육안적 형태, 즉 조기 위 암과 조기 위암과 같은 형태의 진행성 위암에 비해 Borrmann I형, II형 군과 Borrmann III형, IV형에서 유의하게 혈관 신생이 많았다(Fig. 2). Lauren 분류와 Ming 분류에 의한 혈관 신생의 정도는 차이가 없었 으며(Fig. 3, 4), 침윤 정도가 깊을수록 그리고 림프 절 전이의 정도가 많을수록 혈관 신생이 많은 경향

은 보였으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다(Fig. 5, 6).

2) 염 기 성 섬 유 모 세 포 성 장 인 자 의 발 현 과 조 직학 적 요소 와의 연 관성

1) 전체 97예 가운데 50예(52%)에서 염기성 섬유 모세포 성장 인자가 강양성( )으로 염색되었다.

33예(34%)에서 약양성( )으로 염색되었고, 염기성 섬유 모세포 성장 인자 음성은 14예(14%)이었다.

2) 종양의 조직학적 특성과 염기성 섬유 모세포 Fig. 1. Invasive gastric adenocarcnoma stained for factor VIII relatred antigen highliting microvessel

densities (DAB-immunoperoxidase stain, M 200).

Fig. 2. Number of vessels according to gross type of tumor. Fig. 3. Number of vessels according to Lauren 's classifi-

cation.

성장 인자의 발현과의 관계를 본 결과 조직학적 분 화도가 낮을수록 염기성 섬유 모세포 성장 인자의 발 현율이 통계적으로 유의하게 높았다(P=0.003)(Table 1).

3) 종양의 육안적 형태를 보르만 I, II형 III, IV형 과 조기 위암 및 조기 위암의 형태를 갖는 진행 암 의 세가지로 나누어 본 결과 각각의 경우에 있어서 염기성 섬유 모세포 성장 인자 발현율과 환자의 예 후와의 관계는 통계적 유의성이 있는 차이가 있었 다(p ＜0.005)(Table 2).

4) 종양의 침윤 정도가 깊을수록 염기성 섬유 모 세포 성장 인자의 발현이 유의하게 높았다(p ＜0.05) (Table 3).

5) 병기가 높을수록 염기성 섬유 모세포 성장 인 자의 발현이 유의하게 높았다(p ＜0.05)(Table 4).

6) 종양의 위치, 임파절 전이 여부및 정도와 Lau- ren 및 Ming의 분류와 염기성 섬유모세포 성장 인자 의 발현율은 통계적 유의성이 있는 차이가 없었다 (Table 5 ～8).

7) 조직학적 분화도에 따라 암세포내의 염기성 섬

Table 1. The relationship between bFGF expression and histological classifications of tumor(p ＜0.05) Histological classification*

bFGF Total

W/D M/D P/D SRC Muc. Pap. Undiff.

Negative 5 1 2 3 0 0 3 14

Weak( ) 8 13 7 4 1 0 0 33

Strong( ) 5 15 25 2 1 2 0 50

Total 18 29 34 9 2 2 3 97

* W/D: well differentiated, M/D: moderatiely differentiated. P/D: porly differentiated, SRC: Signet ring cell, Muc.:

mucinous, Pap.: papillary, Undiff.: undifferentiated Fig. 5. Number of vessels according to depth of invasion.

Fig. 4. Number of vessels according to Ming's classifi- cation.

Fig. 6. Number of vessels according to lymph node metas-

tasis.

유 모세포 성장 인자의 분포의 차이는 발견할 수 없었다. 염기성 섬유 모세포 성장 인자는 선내강의 연안을 따라 조잡한 선상으로 나타나 주로 암세포 의 선단에서 보이기도 하며 때로는 이러한 극성이 없이 세포막을 따라 나타나기도 하였으며, 세포질에

는 미세하고 조대한 과립상의 형태로 보였다. 드물 게는 세포의 핵에서 염기성 섬유 모세포 성장 인자 가 발현되었으며 암세포 뿐 아니라 주변의 내피 세 포와 섬유 모세포에도 발현이 관찰되었다. 그러나 주로는 암세포의 세포질에서 발현이 되었다(Fig. 7).

8) 위암 조직에서의 염기성 섬유 모세포 성장 인 자의 발현과 혈관 신생의 정도와의 상관 관계를 검 정한 결과 Spearman 상관 계수가 0.25로 크지는 않 Table 2. The relationship between bFGF expression and gross type of tumor(p ＜0.005)

Gross type

bFGF Total

EGC&AGC mimicking EGC Borrmann type I&II Borrmann type III&IV

Negative 7 6 1 14

Weak positive 17 5 11 33

Strong positive 4 10 36 50

Total 28 2 1 48 97

Table 3. The relationship between bFGF expression and depth of invasion (p ＜0.05)

Depth of invasion*

bFGF Total

m sm pm SS s o

Negative 4 3 1 3 3 0 14

Weak 6 6 5 10 6 0 33

positive

Strong 2 2 7 22 16 1 50 positive

Total 12 11 13 35 25 1 97

*m: mucosa, sm: submucosa, pm: proper muscle, ss:

subserosa, s: serosa, o: extended to the other organ

Table 4. The relationship between bFGF expression and stage (p ＜0.05)

Stage

bFGF Total

I II III IV

Negative 7 2 5 0 14

Weak positive 17 3 13 0 33 Strong positive 14 5 27 4 50

Total 38 10 45 4 97

Table 5. The relationship between bFGF expression and location of tumor (p ＞0.05)

Location of tumor

bFGF Total

Cardia&

Antrum Body

diffuse

Negative 8 6 0 14

Weak positive 23 8 2 33 Strong positive 29 17 4 50

Total 60 31 6 97

Table 6. The relationship between bFGF expression and lymph node metastasis (p ＞0.05)

Lymph node metastasis

bFGF Total

Negative 1～3 ≥4

Negative 2 9 3 14

Weak positive 19 1 13 33 Strong positive 16 11 23 50

Total 37 2 1 39 97

았으나 통계적인 유의성은 있었다(p=0.0125)(Fig. 8).

3) 위 암 조 직 의 혈 관 신 생 의 정 도 및 염 기 성 섬 유 모세 포 성장 인자 발 현과 예 후와 의 관 계

환자의 생사 여부는 모든 환자에서 파악할 수 있 었다. 환자의 생존 곡선을 구한 결과 전체 5년 생존 율은 69%이었으며 혈관 신생의 정도를 종양 주위의 Table 7. The reationship between bFGF expression and

Lauren's classification (p ＞0.05)

Lauren's classification

bFGF Total

Intestinal Diffuse or mixed

Negative 5 9 14

Weak positive 2 1 12 33 Strong positive 20 30 50

Total 46 5 1 97

Table 8. The relationship between bFGF expression and Ming's classification (p ＞0.05)

Ming's classification

bFGF Total

Expanding Infiltrative

Negative 3 11 14

Weak positive 6 27 33

Strong positive 9 42 50

Total 18 79 97

Fig. 7. Immunohistochemical staining with anti-bFGF antibodies revealed strong reactivity in the cyto- plasm of gastric cancer cells(a: poorly differentiated adenocarcinoma with intense granular cyto- plasmic staining. b: well differentiated adenocarcinoma with strong reactivity in the margin of cytoplasm ( 200).

Fig. 8. The correlation between the number of microves-

sels and the degree of bFGF expression (Spearman

coefficient=0.25, p ＜0.05).

미세 혈관 계수로 보았을 때 갯수가 40개 이하, 4 1～

70개, 7 1～100, 101 이상의 4군으로 나누어 본 결과 생존율에 유의한 차이가 없었다(p=0.43)(Fig 9). 염기 성 섬유 모세포 성장 인자의 발현의 차이에 따른 환자의 생존율을 구한 결과 통계적으로 유의한 차 이가 없었다(p=0.98)(Fig. 10). 병기에 따른 차이가 있 는지 보기 위해 병기별로 분석도 하였으나 마찬가 지로 통계적인 유의성이 없었다.

고 찰

종양의 성장 및 전이에는 혈관의 신생이 필수적 이다. 왜냐하면 종양 세포가 어느 정도의 크기에 이 르면 대사 요구에 의해 혈관으로부터 영양분을 공 급 받아야만 하기 때문이다. 따라서 암 자체의 특성 이라 할 수 있는 조절되지 않는 무한 성장과 다른 조직으로의 전이 및 착상 과정에는 반드시 종양 세 포 주변에 미세 혈관의 존재가 동반되어야 한다. 이 러한 새로운 혈관의 출현이 어떠한 과정에 의해 이 루어지는지에 대한 연구는 암의 성장 및 전이의 과 정을 조절할 수 있는 방법을 찾을 수 있는 데에도 도움을 줄 수 있을 것이다. 혈관 신생을 관찰하는 방법으로는 종양 주위에 존재하는 미세 혈관을 일 반 광학 현미경으로 관찰할 수도 있으나 혈관 내피 세포만을 특이적으로 강조할 수 있는 염색을 하여 혈관의 갯수를 세는 것이 병리학적 진행도 및 예후 와 연관을 시킬 수 있는 방법으로 소개되었다. 혈관 내피 세포를 염색하는 방법은 여러가지가 시도되었 는데 본 연구에서 시행한 Weidner등의 방법은 특이

도와 민감도 등을 고려할 때 가장 신뢰할 만한 것 으로 보고되고 있다.

저자의 경우 직접 현미경 시 야에서 계수하는 Weidner의 방법을 약간 변형 시켜 사진 촬영을 하여 확대경을 이용하여 관찰하고 계 수하는 방법을 사용하였는데 사진의 경우 200배 시 야내를 모두 찍을 수 없어 실제 Weidner의 방법에 비해 혈관의 갯수가 10% 정도 줄어들 수 있으나 반 면에 실험 결과의 객관성을 확보하고 정확하게 숫 자를 세는데 도움이 되었다.

저자는 위암에서 혈관 신생의 정도의 차이가 조 직학적 요소와 어떻게 관련되는지와 궁극적으로 예 후 인자로서의 역할을 할 수 있는지에 대하여 확인 하고자 하였다. 종양의 진행도에 따라 혈관 신생이 많아지는 경향은 발견하였으나 통계적으로 유의한 차이를 보여주지 않아 본 연구에서는 예후 인자로 서의 가치를 보여주지 못했다. 저자의 결과와는 달

리 유암

과 대장암,

방광암,

자궁 경부암,

구

강암

등에서는 혈관 신생이 예후와의 관련성이 있

음이 보고된 바 있으며 위암에서도 재발의 예측을 할 수 있는 좋은 예후 인자가 될 수 있다는 보고가 있다.

Maeda등의 결과와 비교해 보면 저자와 같은 200

배 시야에서의 계수임에도 불구하고 숫자의 차이가

크게 있어 혈관의 계수 방법에 있어서 차이가 있을

수 있음을 고려할 수 있다. 저자의 경우 사진 촬영

을 하여 확대경으로 혈관의 내강이 보이는 모든 내

피 세포를 세었기 때문에 Maeda등의 보고보다 신생

혈관의 숫자가 많게 나온 것으로 생각된다. Maeda

등의 보고와 마찬가지로 림프절 전이와 침윤의 정

Fig. 9. Survival according to number of microvesssels. Fig. 10. Survival according to degree of bFGF expression.

도가 매우 두드러지게 강한 예후 인자로 나타났으 나 저자의 연구 결과는 혈관 신생의 정도가 위암에 서는 큰 영향을 미치는 예후 인자는 아닌 것으로 평가되었다. 위암에서의 예후 인자에 대한 저자의 이전의 연구에서도 림프절 전이와 침윤 정도가 매 우 강한 예후 인자로 보고한 바 있다.

두가지의 너무 강한 인자의 작용으로 종양 주위의 혈관 신생 의 정도가 예후에 미치는 영향이 적을 수 있다고 생각할 수 있다. 종양의 병기별로 생존율의 차이를 보았으나 마찬가지로 혈관 신생이나 bFGF의 발현이 영향을 주지않았음을 볼 때 위암에서는 이러한 혈 관 신생의 요소 이외의 다른 요소들이 복합적으로 예후에 관여할 것으로 생각된다.

예후 인자로서의 가치는 보이지 않았으나 병기의 진행이나 종양의 생물학적 행태와의 관련성은 관련 이 있을 것으로 기대할 수 있을 것이다. 병리학적 요소와 관련성을 본 결과 종양의 육안적 형태와 혈 관 신생의 정도가 의미있게 관련성이 있었고 그외 에 다른 요소와는 통계적 의미가 없었는데 림프절 전이가 많이될수록, 침윤정도가 깊을수록, 조직학적 분화도가 나쁠수록 혈관신생이 많은 경향은 보여 주었다. 통계적 유의성이 없었던 것은 분석한 환자 의 수가 많지 않기 때문으로 생각된다.

지금까지 알려진 바로는 종양 세포 자체에서 혈 관 형성 물질을 생산하여 분비한다고 하며 이 물질 의 기능은 종양 세포 자신의 증식에 작용할 뿐 아 니라 주위 기질 조직에서의 혈관 신생을 자극하여 암세포의 증식을 유도한다.

또한 신생혈관의 내피 세포는 종양의 성장을 자극하는 growth factor들을 분비하는 paracrine activity를 보여 서로 상호 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 암세포에서 분비하는 혈 관 형성 물질은 매우 다양하며 하나의 암에서도 암 세포주에 따라 다른 혈관 형성 물질을 분비한다.

유암,

간암,

췌장암,

난소암,

전립선암

등에서 염기성 섬유 모세포 성장 인자의 발현이 종 양의 진행도와 연관이 있다는 주장이 보고되고 있 다. 위암에서도 이러한 종양내의 혈관 신생과 함께 위암 세포에서 분비되는 혈관 신생 물질도 다양하 게 발견되었다. 위암의 경우 같은 위암 조직에서도 많은 암세포의 strain이 공존하며 따라서 하나의 암 조직에서도 다양한 혈관 신생 물질이 발현될 것으 로 생각된다. 염기성 섬유모세포 성장 인자 뿐 아니

라 PDGF, TGF, insulin like Growth factor, EGF, VEGF, midkine등이 위암에서 혈관 신생에 관여한다 고 알려져 있다.

또한 이러한 성장 인자가 위 암에서 예후 인자로서 작용할 수 있다는 보고도 있 다.

그러나 종양 주위의 혈관 신생은 혈관 신생 인자만 작용하는 것은 아니며 혈관 신생 억제 인자 와의 균형에 의한 결과적 현상이라 할 수 있다. 혈 관 신생 억제 인자로 알려진 물질들은 angiostatin, platelet factor4, interferon-alpha, interferon inducible pro- tein 10, gro-beta, 16kDa N-terminal fragment of pro- lactin 등이다.

염기성 섬유 모세포 성장 인자의 경우 다른 몇가 지 성장 인자와 함께 위암 세포주에서의 분비가 확 인된 바 있으며 종양 혈관의 신생 및 종양 주위의 섬유화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있

다.

염기성 섬유 모세포 성장 인자의 생물학적인

특성은 매우 다양하나 세포를 이형시킬 수 있고 섬 유 모세포의 증식 및 혈관 내피 세포의 증식에 강 력한 자극 물질이며 암세포의 성장 및 세포 주기의 조절에 관여한다.

저자는 위암에서도 염기성 섬유 모세포 성장 인자가 암세포 이외의 내피 세포와 섬 유 모세포에서도 발현되는 것을 확인하였고 따라서 암세포에서 직접 염기성 섬유 모세포 성장 인자가 생산되는 것을 확인하기 위해 mRNA의 전사 과정을 증명하였다. 같은 절단면의 H&E 염색으로 암세포의 위치와 m RNA가 발현되는 세포를 형태학적으로 보 여준 것이다. 염기성 섬유 모세포 성장 인자의 면역 조직 화학 염색의 결과로는 양성으로 발현된 예가 전체 97예 중 83예로 85.6%이었으며 mRNA의 발현 은 비록 다른 환자군이기는 하나 88.9% (8/9)로 비 슷한 정도를 보여 주었다. 비록 혈관 신생의 과정이 하나의 혈관 신생 인자만으로 결정되지 않으며 또 한 혈관 신생 억제 인자와의 상호작용의 결과로 이 루어지기는 해도 이렇게 염기성 섬유 모세포 성장 인자가 비교적 위암에서 발현률이 높은 것으로 볼 때 혈관 신생의 정도와 어느 정도 연관이 있을 것 을 것으로 예측할 수도 있을 것이다. 본 연구 결과 상관 관계는 통계적으로 유의하게 있으나(correlation coefficient=0.25, p=0.0 125) 지수가 그렇게 크지는 않 음을 알 수 있었다.

본 연구에서 염기성 섬유 모세포 성장 인자의 발

현이 예후와 연관이 안된 것은 혈관 신생의 정도가

예후에 미치는 영향이 유의하지 않은 것으로 나타 난 것과 전후 관계가 일치하는 결과라 할 수 있다.

또한 조직학적 요소 가운데 육안적 형태, 조직학적 분화도, 침윤 정도 그리고 병기의 진행과 염기성 섬 유 모세포 성장 인자의 발현도가 유의하게 관련성 이 있는 결과를 얻었다. 이는 혈관 신생의 정도와 마찬가지로 침윤도와 림프절 전이의 예후 인자가 너무 강한 예후 인자이기 때문에 예후와의 관련성 은 없다고 하더라도 종양 자체의 진행과 성장에는 염기성 섬유 모세포 성장 인자가 유력한 영향을 미 치는 것으로 생각된다.

최근 위암에서 염기성 섬유 모세포 성장 인자 mRNA의 활성과 환자의 예후가 관련성이 있다는 보 고가 있으며,

흑색종에서 염기성 섬유 모세포 성 장 인자 mRNA의 활성도와 종양의 진행도와 연관이 있다는 보고가 있으나

다양한 혈관 형성 물질의 발현과 또한 이러한 물질간의 상호 작용과 그 결과 를 완벽히 파악하기도 어렵기 때문에 결국 이러한 혈관 형성 인자들의 작용의 결과라 할 수 있는 혈 관 신생의 정도가 암세포의 생물학적 행동을 가장 잘 대변할 수 있다고 하겠다. 또한 암 세포 내에서 의 염기성 섬유 모세포 성장 인자의 생산을 확인하 기 위해 mRNA를 발현시켜 볼 수는 있으나 결국 생 물학적 작용은 최종 산물인 염기성 섬유 모세포 성 장 인자 단백질이 하게 되며 나아가 수용체의 활성 이 더욱 중요할 수 있기 때문에 mRNA의 활성도와 예후와의 관련성을 보고자 하는 것은 큰 의미가 없 을 것으로 생각된다.

종양 혈관 신생의 정도가 예후나 병기와 통계적 으로 유의한 연관이 없다고 하더라도 종양의 침윤 이 깊을수록, 림프절 전이가 많을 수록 종양 혈관 신생이 많은 경향을 볼 수 있었으며 앞으로 추가적 인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 환자의 수가 너무 적어 통계적 변별력이 낮았고, 환 자 선택을 무작위로 하기는 하였으나 전체 97예 환 자의 생존율이 모집단의 생존율보다 높아 선택 오 차의 가능성이 있을 수 있기 때문이다. 다른 가능성 은 위암의 경우 종양의 침윤 정도와 림프절의 전이 가 매우 강한 예후 인자이므로 이러한 혈관 신생이 성장 및 전이에 중요하다고 하더라도 예후에 영향 을 줄 정도는 되지 못했을 것으로도 추측할 수 있 다. 또 하나의 가능성은 암의 변연부가 암 세포의

증식이 강한 부분이므로 혈관 신생을 관찰 하는데 이상적인 부분이나 후향적 연구이기 때문에 종양의 변연부에서 계획적으로 채취할 수 없었던 점이 결 과에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 따라서 이 점 은 전향적 연구를 함으로서 규명되어야 할 것으로 생각된다.

혈관의 신생 정도가 암의 진행과 성장에 관여한 다는 증거가 축적되면서 이러한 혈관의 생성을 억 제 함으로서 암을 치료하고자 하는 시도가 계속 이 루어지고 있다. 이번 실험을 통해 비록 위암의 종양 성장 및 전이에 있어 혈관 신생의 많고 적음이 유 의한 관련성이 없었으나 분명한 것은 위암 주위에 미세 혈관들이 분포하며 종양에서 분비되는 염기성 섬유 모세포 성장 인자를 확인하였으므로 위암에서 도 이러한 치료적 시도가 이루어져야 함이 타당할 것으로 생각된다. 최근 혈관 신생에 관여하는 성장 인자를 선택적으로 억제하고자 하는 시도들도 있으 나

염기성 섬유 모세포 성장 인자 이외에 다른 다 양한 성장 인자가 관여하며 혈관 억제 인자와의 상 호 작용이 중요한 것으로 알려져 있어 항 혈관 형 성 억제 치료의 방향은 혈관 내피 세포의 증식을 직접적으로 억제하는 물질을 찾는 것이 효과적일 것으로 생각된다. O'Reilly등은 1996년 angiostatin으 로 부터 분리해낸 endostatin이란 물질이 강력한 혈 관 형성 억제 인자로 매우 특이도가 높은 내피 세 포의 성장 억제 인자임을 발견하고 동물 실험을 거 쳐 임상 실험을 시도하였다.

흥미로운 것은 이러 한 항 혈관 억제 치료는 암세포를 목표로 한 것이 아니라 암 주위에 필연적으로 존재하며 빠른 세포 주기를 보이는 정상 내피 세포를 표적으로 한 것이 기 때문에 종래의 암 치료 모델과 달리 내성이 생 기지 않음을 보여 주었고 이러한 고무적인 결과는 기존의 항암 화학 요법 치료의 최대의 걸림돌을 어 느 정도 해결할 가능성이 있을 것으로 생각된다.

결 론

위암에서 종양 주위의 혈관 신생과 예후와의 관

련성을 본 연구에서 보여주지는 못했으며 bFGF의

발현 정도 및 병기별 분석에서도 마찬가지로 예후

인자로서의 의미를 보이지 않아 위암 조직의 다양

성으로 미루어 이외의 다른 요소가 복합적으로 관

여할 것으로 생각된다. 그러나 종양 혈관 신생의 정 도는 종양의 진행도와 관련성을 보여주었고 또한 가장 강력한 혈관 신생 물질인 염기성 섬유 모세포 성장 인자의 발현이 강하게 나타난 위암이 많으며 아울러 종양의 진행도와 관련성이 있음이 밝혀지게 되었다. 따라서 앞으로 위암의 치료에 있어서도 항 혈관 신생 치료의 연구가 이루어져야 함이 타당할 것으로 생각되며, 위암의 다양한 세포 형태를 감안 하여 위암에서의 항 혈관 신생 치료의 방향은 개개 의 혈관 신생 인자들에 대한 길항이 아닌 혈관 내 피 세포의 성장 억제에 초점이 맞추어져야 할 것으 로 생각된다.

REFERENCES

1) Altorki N, Schwartz GK, Blundell M, Davis BM, Kelsen DP, Albino AP: Characterization of cell lines established from human gastric-esophageal adenocar- cinomas. Biologic phenotype and invasion potential.

Cancer 72: 649, 1993

2) Bennett C, Peterson IM, Corbishley CM, Luqmani YA: Expression of growth factor receptor encoded transcripts in human gastric tissues. 49: 2 104, 1989 3) Beranek JT: Angiogenesis and basic fibroblast growth

factor. Br J Plas Surg 45: 254, 1992

4) Boehm T, Folkman J, Browder T, O'Reilly MS:

Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature 390: 404,

1997

5) Bossi P, Viale G, Lee AK, Alfano R, Coggi G, Bosari S: Angiogenesis in colorectal tumors: microvessel quantitation in adenomas and carcinomas with clinico- pathological correlations. Cancer Res 55: 5049, 1995 6) Chauhan AK, Li YS, Deuel TF: Pleiotrophin trans- forms NIH3T3 cells and induces tumors in nude mice.

Proc Natl Acad Sci USA 90: 679, 1993

7) Chung CK, Antoniades HN: Expression of c-sis/

platelet-derived groth factor B, insulin-like growth factor I, and transforming growth factor alpha messen- ger RNAs and their respective receptor messenger RNAs in primary human gastric carcinomas: In vivo studies with in situ hybridization and immunocyto- chemistry. Can Res 52: 3453, 1992

8) Di Blasio AM, Cremonesi L, Vigano P, Ferrari M, Gospodarowicz D, Vignali M, Jaffe RB: Basic fibro- blast growth factor and its receptor messenger ribonu-

cleic acids are expressed in human ovarian epithelial neoplasms. Am J Ob Gyn 169: 15 17, 1993 9) Durrant LG, Watson SA, Hall A, Morris DL: Co-

stimulation of gastrointestinal tumour cell growth bygastrin, transforming growth factor alpha and insu- lin likegrowth factor-I. Br J Cancer 63: 67, 199 1 10) Folkman J: Tumor angiogenesis: Therapeutic implica-

tions. N Engl J Med 285: 1182, 197 1

11) Garver RI Jr, Radford DM, Donis-Keller H, Wick MR, Milner PG: Midkine and pleiotrophin expression in normal andmalignant breast tissue Cancer 74: 1584, 1994

12) Harris AL, Fox S, Bicknell R, Leek R, Relf M, LeJeune S, Kaklamanis L: Gene therapy through sig- nal transduction pathways and angiogenic growth factors as therapeutic targets in breast cancer. Cancer Suppl 74: 102 1, 1994

13) Horak ER, Leek R, Klenk N, LeJeune S, Smith K, Stuart N, Greenall M, Stepniewska K, Harris AL:

Angiogenesis, assessed by platelet/endothelial cell ad- hesion molecule antibodies, as indicator of node me- tastases and survival in breast cancer. Lancet 340:

1120, 1992

14) Hu Z, Evarts RP, Fujio K, Omori N, Omori M, Marsden ER, Thorgeirsson SS: Expression of trans- forming growth factor alpha/epidermal growth factor receptor, hepatocyte growth factor/c-met and acidic fibroblast growth factor/fibroblast growth factor rec- eptors during hepatocarcinogenesis. Carcinogenesis 17: 931, 1996

15) Jaeger TM, Weidner N, Chew K, Moore DH, Kers- chmann RL, Waldman FM, Carroll PR: Tumor angio- genesis correlates with lymph node metastases in in- vasive bladder cancer. J Uro 154: 69, 1995 16) Kim JP, Kim YW, Yang HK, Noh DY: Significant

prognostic factors by multivariate analysis of 3926 gastric cancer patients. World J of Surg 18: 872, 1994 17) Maeda K, Chung Y, Ogawa Y, Takatsuka S, Kang S, Ogawa M, Sawada T, Sowa M: Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma. Cancer 77: 858, 1996

18) Maeda K, Kang SM, Ogawa M, Onoda N, Sawada

T, Nakata B, Kato Y, Chung YS, Sowa M: Combined

analysis of vascular endothelial growth factor and

platelet-derived endothelial cell growth factor expres-

sion in gastric carcinoma. Int J Cancer 74: 545, 1997

19) Malden LT, Novak U, Burgess AW: Expression of

transforming growth factor alpha messenger RNA in

the normal and neoplastic gastro-intestinal tract. Int J

Cancer. 43: 380, 1989

20) Nakamoto T, Chang CS, Li AK, Chodak GW: Basic fibroblast growth factor in human prostate cancer cells. Cancer Res 52: 57 1, 1992

2 1) Ohta T, Yamamoto M, Numata M, Iseki S, Tsukioka Y, Miyashita T, Kayahara M, Nagakawa T, Miyazaki I, Nishikawa K, Yoshitake Y: Expression of basic fibroblast growth factor and its receptor in human pancreatic carcinomas. Br J Cancer 72: 824, 1995 22) O'Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, Chen C, Ros-

enthal RA, Moses M, Lane WS, Cao Y, Sage EH, Folkman J: Angiostatin: A noble angiogenesis inhib- itor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell 79: 315, 1994 23) O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y, Fukai N, Vasios

G, Lane WS, Flynn E, Birkhead JR, Olsen BR, Folkman J: Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 88: 277, 1997 24) Reed JA, McNutt NS, Albino AP: Differential ex- pression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in melanocytic lesions demonstrated by in situ hybridiza- tion. Implications for tumor progression. Am J Path

144: 329, 1994

25) Riegel AT, Wellstein A: The potential role of the heparin-binding growth factor pleiotrophin in breast cancer. Br Can Res Treat 31: 309, 1994

26) Singh RK, Gutman M, Bucana CD, Sanchez R, Llansa N, Fidler IJ: Interferon and down-regulate the ex-pression of basic fibroblast growth factor in human carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4562, 1995 27) Tanimoto H, Yoshida K, Yokozaki H, Yasui W, Nakayama H, Ito H, Ohama K, Tahara E: Expression of basic fibroblast growth factor in human gastric carcinomas. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol

Pathol 61: 263, 1991

28) Thomas AK: Fibroblast growth factors. Faseb J 1:

434, 1987

29) Ueki T, Koji T, Tamiya S, Nakane PK, Tsuneyoshi M: Expression of basic fibroblast growth factor and fibroblast growth factor receptor in advanced gastric carcinoma. J Path 177: 353, 1995

30) Visscher DW, DeMattia F, Ottosen S, Sarkar FH, Crissman JD: Biologic and clinical significance of basic fibroblast growth factor immunostaining in breast carcinoma. Mod Pathol 8: 665, 1995 31) Weidner N: Current pathologic methods for measuring

intratumoral microvessel density within breast carci- noma and other solid tumors. Brst Ca Res & Treat 36: 169, 1995

32) Weidner N: Intratumor microvessel density as a prog- nostic factor in cancer. Am J Path 147: 9, 1995 33) Wiggins DL, Granai CO, Steinhoff MM, Calabresi P:

Tumor angiogenesis as a prognostic factor in cervical carcinoma. Gyn Onc 56: 353, 1995

34) Williams JK, Carlson GW, Cohen C, Derose PB, Hunter S, Jurkiewicz MJ: Tumor angiogenesis as a prognostic factor in oral cavity tumors. Am J Surg

168: 373, 994

35) Yamanaka Y, Friess H, Buchler M, Beger HG, Uchida E, Onda M, Kobrin MS, Korc M: Overexpression of acidic and basic fibroblast growth factors in human pancreatic cancer correlates with advanced tumor stage.

Cancer Res 53: 5289, 1993

36) Yoshida K, Kyo E, Tsuda T, Tsujino T, Ito M,

Niimoto M, Tahara E: EGF and TGF-alpha, the

ligands of hyperproduced EGFR inhuman esophageal

carcinoma cells, act as autocrine growth factors. Int

J Cancer 45: 131, 1990