1. 서론
생체 내 현미경은 살아있는 생체 내에서의 생물학적 현상을 관찰하기 위한 고해상도 영상화 기술이다. 생체 내 현미경은 in vivo 현미경이라고도 불린다. in vivo는
“살아있는 생체 내에서”라는 의미의 라틴어이며, 이와 대 비되는 ex vivo는 “살아있는 생체 밖에서”라는 의미이 다. 더불어, 많이 사용되는 in vitro는 “시험관 내에서”라 는 의미이다. 흔히 in vitro 연구는 배양접시나 시험관처 럼 조절된 환경에서의 암세포와 같은 살아있는 생물학적 개체를 사용하는 연구를 말한다. 생물체는 유전체, 단백 질과 세포와 같은 다양한 생물학적 물질로 이루어져있는 매우 복잡한 시스템이다. 예를 들어, 성인 인간은 대략 70조 개의 세포로 이루어져 있다. 그리고 개개의 단일
세포는 25,000 종류의 코딩 유전자를 가지고 있고, 이 유전자로 생산된 단백질들은 적절한 기능을 수행하기 위 해서 세포의 종류에 따라 특별한 방법으로 엄격하게 조 절된다. 또한 모든 세포들은 생명체의 생존을 위해서외 부 환경으로부터 광범위하게 항상성을 유지하기 위한 복 잡한 네트워크를 형성하며 다른 세포와 상호 작용을 한 다. 이 극도의 복잡성이 생물학자가 개별적인 요소를 확 인하고 그것들의 특별한 기능을 분석하는 과정의 가장 큰 어려움이다. in vitro 실험의 가장 큰 장점은 생물학
자가 집중하는 개별적인 요소의 기능만을 고려한 시스템 을 단순화하여, 잘 조절된 인위적인 환경을 제공한다는 것이다. 유전학, 세포생물학 그리고 분자생물학과 같은 많은 의생명 연구분야에서 시험관 내 환경의 유전체, 단 백질 또는 특정 세포 종류와 같은 개별적인 생물학적인 요소를 제어하여 유발되는 결과를 관찰하고 그 메커니즘 을 자세히 분석하는 방식으로 in vitro 연구는 광범위하 게 수행된다. 그러나 in vitro 연구는 생체 내 모델의 특 정 조직에서 관찰되는 복잡한 네트워크와 극도로 동적인 생리학적 환경을 재구성하는 것이 불가능하여, 실험 결 과의 오류 가능성을 배제할 수 없는 한계를 지니고 있다.
in vitro 연구의 결과가 실제 생명체를 사용한 in vivo 연 구에서 재현되지 않는 경우가 비일비재하다.
2. 생체 내 (in vivo) 및 생체 외 (ex vivo) 분석
살아있는 생명체를 사용하는 in vivo 실험의 특성 상, 실험체에서 발생하는 생물학적 과정을 상세히 분석하는 데에는 상당한 어려움이 따른다. 예를 들어 복잡한 생체 내 환경으로부터 높은 감도로 정확한 데이터를 얻으면 서, 동시에 생체 내 환경은 최대한 자연적인 상태로 유 지해야 하는 기술적 문제가 있다. 그로 인해 다양한 생 물학적 과정을 분석하고자 할 때 in vivo분석법 보다는
특집 ■ Biophotonics
의생명연구를 위한 생체 내 현미경
김필한*
* 한국과학기술원 나노과학기술대학원
의생명연구를 위한 생체 내 현미경 특집 ■ Biophotonics
실험체로부터 조직을 적출하는 ex vivo분석법을 기반으 로 한 실험이 주로 이루어졌다. 의생명 연구에 가장 많 이 사용되는 2가지 ex vivo분석법은 각각 조직학적 분 석법(histology)와 유동세포분석법(flow cytometry)으 로서 세포 수준의 정보를 얻을 수 있다. 조직학적 분석 법은 실험체로부터 적출된 조직을 화학처리하고 광학 현미경이나 전자 현미경을 이용하여 미세한 관찰을 가 능토록 한다. 조직학적 분석을 위한 시편은 고정 (fixation), 절편(sectioning), 염색(staining)의 3가지 과정을 통해 준비된다. 대개의 생물학적 조직은 자체적 인 광학적 대비가 거의 없으므로, 절편조직은 염색 과정 을 거친다. H&E는 가장 흔하게 사용되는 염색방식으로 서 세포핵은 청색, 근육과 세포외기질은 적색, 분홍색, 주황색 등으로 염색한다. 현대의학에서 적출한 조직을 염색하여 미세관찰하는 조직병리학은, 세포수준의 정보 를 제공하여 암이나 염증성 질환과 같은 다양한 질병에 대한 정확한 진단을 가능토록 해준다. 유동세포분석법 (flow cytometry)은 수용액 상에 분산되어 있는 세포의 수를 세는 기법이다. 세포들이 하나씩 줄지어 정렬되어 미세 관로를 지나가도록 구성하고, 관로 내 특정 지점에 빛의 초점을 형성하여 흘러가는 세포로부터 다양한 광 학신호를 다수의 검출기를 이용하여 감지한다. 특히 형 광 표지를 기반으로 한 현대적인 유동세포분석법인 FACS는 매 초마다 실시간으로 수천의 세포를 분석하거 나, 형광 특성에 따라 세포를 분류하는 데 사용될 수 있 다. 그러나, 살아있는 개체 내부의 세포수준 현상은 매 우 역동적인데 반해, 앞서 언급한 ex vivo 분석법은 단 하나의 특정 시점에서의 정보만을 제공한다는 점에서 근본적인 한계를 가진다. 앞서 언급한 바와 같이, 살아 있는 생명체는 복잡한 구조로 수많은 생물학적 과정이 역동적으로 시작되고 조절되며, 유전자, 분자 및 세포 수준에서 상호간 영향을 끼친다. ex vivo 분석법은 이러 한 과정들의 단 한 시점만을 보여주므로, 끊임없이 이어 져가는 역동적인 과정들을 추적하는 데 사용될 수 없다.
게다가 ex vivo 분석을 위해 행하는 고정, 절편(조직학 적 분석), 조직분해(유동세포분석) 등의 과정들은 in vivo 상태에서 세포가 처한 미세환경을 변화시킨다. 이
러한 한계를 극복하기 위해 직접적으로 살아있는 개체 내의 세포수준 과정들을 영상화하는 생체 내현미경에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
3. 생체 내 (Intravital / In vivo) 현미경 3.1 형광영상
현재 생체 내 현미경 기술은 대부분 형광물질을 사용 하여 형광영상을 획득한다 (1-2). 이와 같은 형광표지기 반 영상화는 높은 contrast와 sensitivity를 용이하게 구현할 수 있으며, 그 외에도 다양한 장점들이 있다. 우 선 생체 내부의 복잡다양한 구성 요소를 선택적으로 표 지하기 위해 지난 수십 년 동안 수만 가지의 형광 인자 들이 합성되었고, 현재에 이르러서는 in vivo, ex vivo 및 in vitro 등 어떤 상황에서도 관심 대상을 표지할 수 있는 수많은 protocol들이 확립되어 왔다. 두 번째로, 가장 많이 알려진 형광단백질인 녹색형광단백질 (GFP) 의 개발은 유전공학 기술을 통한 생체 내 다양한 유전자 의 본질적인 내인성 표지를 가능하게 하였고, 외인성 형 광 인자를 사용한 생체 내 표지 방법을 고안해야만 하는 기존의 어려운 과제를 해결할 수 있게 되었다. 마지막으 로, 형광 현미경에 최적화된 광원과 검출기의성능 향상 은 극도로 낮은 농도의 형광 물질도 높은 SNR로 감지해 내는 것을 가능케 함으로써 형광 현미경 기술이 모든 생 체 표본의 관찰을 위한 가장 이상적인 기술로 확립되도 록 하였다. 형광은 형광 물질이 특정 파장의 빛을 흡수 한 후 방출되는 빛이다. 그림 1(a) 는 Jablonski 다이어 그램으로 표현되는 전자의 에너지 상태를 보여준다. 흡 수되는 광자와 방사되는 광자의 파장 차이는 스토크스 이동 (Stokes shift) 이라고 불리는데, 이는 형광신호에 영향을 주지 않으면서 원치 않는 여기광을 완벽히 제거 하여 높은 contrast와 sensitivity의 형광 영상화를 가 능하게 하는 핵심적인 특징이다. 또한 흡수와 방출에 의 한 에너지 전이 현상은 각각의 상태 내부의 다수의 진동 모드 사이에서 일어나기 때문에, 그림 1(b) 에서 볼 수 있듯이 일반적인 형광 물질은 넓은 흡수 및 방출 스펙트 럼을 가진다. 지난 수십 년 동안 300nm 에서 800nm 에 이르는 자외선, 가시광선, 근적외선 영역의 다양한 색을 가진 형광물질들이 개발되어 그림1(c)에서와 같이 다른 색을 가지는 형광물질들로 각각 표지한 다수의 요 소들을 동시에 영상화하는 것이 가능해졌다. 다중 형광 영상화에 사용되는 다른 색을 가진 일반적인 형광물질 들을 표 1과 같이 정리하였다.
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)와 Tetramethyl Rhodamine (TAMRA)은 수년 동안 성공적으로 사용되 어 왔던 전통적인 형광 염료이다. Fluorescein은 양자 효율이 매우 높고 물리적, 화학적 특성이 잘 알려져 있 지만, pH- 와 같은 환경적 요소에 매우 민감하게 반응 하여 밝기가 변화한다. InvitrogenTM 의 Alexa Fluor 염료는 전통적으로 쓰이는 형광 물질에 비해 더 높은 양 자효율과 광 안정성을 가지며 넓은 pH 범위에서 안정적 인 밝기를 유지하는 등의 장점을 가지나, 비교적 높은 가격이 단점이다. 시아닌 염료인 Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7은 환경적으로 안정하고, 따라서 유기 용매
색(GFP), 적색(RFP, DsRed)의 다양한 형 광 단백질은 특히 생체 내 영상에 많이 사 용된다. 반도체 양자점인 InvitrogenTM의 QdotⓇ 은 수십 나노미터 직경을 가지고 있 으며, 특정한 흡수 스펙트럼을 가지고 있는 일반적인 유기 형광 물질과는 달리 방출 파 장과 무관하게 단파장일수록 흡수 효율이 증가하는 특성을 지니고 있다. 따라서, 다 양한 색을 가진 다양한 종류의 양자점이 하 나의 자외선 영역 광원에 의해 여기될 수 있다. 또한 기존 합성염료로는 어려운 근적 외선 영역의 방사 파장을 가지는 양자점을 상대적으로 용이하게 합성할 수 있다 (3).
3.2 공초점 현미경
단면영상(sectioning)이 가능한 광학현미경에는 대표 적으로 공초점 현미경(4, 5)과 이광자 현미경(6, 7)이 있 다. 두 현미경 모두 형광물질을 여기 시키기 위해 초점 에 집중된 빛을 2D 래스터패턴으로 스캐닝하여샘플에 전달한다. 사용된 대물렌즈의 NA 값이 클수록, 광원의 파장(λ)이 짧을수록 회절한계에 더 가까운 작은 초점이 생성되며, 이론적 분해능은 흔히 0.61λ/NA로 정의된 다. 고해상도 정보를 위해 회절한계에 가까운 작은 초점 을 형성하여 초점면에서만 매우 국소적인 형광신호를 생성하지만, 초점면에서 벗어난 빛의 수렴 및 발산 경로 에서도 형광신호가 발생한다. 따라서, 고해상도의 정보
표 1. 대표적인 형광 물질
Color Blue Green Orange Red NIR
방사 파장 450-480 nm 500-520 nm 570-600 nm 660-700 nm 760-850nm
형광 물질
BFP, GFP, DsRed, APC
CFP YFP RFP, Cy5
DAPI FITC, TAMRA, Cy5.5 Cy 7
Hoechst Cy2, Cy3 Qdot
Ⓡ705 Qdot
Ⓡ800
Alexa Flour 488 Alexa Flour 555 Alexa Flour 647
그림 1. 형광과 형광물질. (a) 형광물질의 전자 상태와 형광 시 에너지의 전이를 그림으로 나타낸jablonski 다이어그램 (b) 일반적인 형광물질의 스펙트럼 특성. Alexa Flour 555 의 흡수 및 방출 스펙트럼 (c) 다중 형광 영상화를 위한 형광물질 조합의 예시인Alexa Flour 350, 488, 594의 흡수 및 방출 스펙트럼
의생명연구를 위한 생체 내 현미경 특집 ■ Biophotonics
를 얻기 위해서는 초점면 이외에서 발생한 형광신호를 차단해야 한다. 공초점 현미경은 검출기 앞의 샘플의 초 점과 공액을 이루는 곳에 핀홀(pinhole)을 위치시켜, 이 핀홀의 작은 구멍이 샘플의 초점면에서 발생한 형광신 호만 통과시킨다. 그림 2는 단면(sectioning) 형광영상 을 위한 공초점현미경의 원리를 보여준다. 핀홀, 대물렌 즈, Dichroic beam splitter (DBS)와 같은 주요 광학부 품들의 배치와 여기광의 경로는 그림 2(a)와 같다. 그림 2(b)와 같이 초점면에서 생성된 형광신호는 대물렌즈를 통해 모여 DBS를 거쳐렌즈에 의해 생성된 초점이 핀홀 을 통과하여 검출기로 도달하게 된다. 반면, 그림 2(c)와 같이 샘플 내 여기광원의 초점면 외에서 발생한 형광신 호는 핀홀의 구멍과 다른 위치에 초점이 생기기 때문에 검출기로 들어가지 못한다. 단면촬영(sectioning)의 효 과는 핀홀의 구멍크기와 연관된다. 얇은 샘플 (절편조직 및 배양세포 등)을 이미징
할 때는 핀홀의 구멍크기 를 샘플에 맺히는 초점크 기(1.22λ/NA, Airy Disk Size)와 동일하도록 조절 하는 것이 일반적이다. 그 러나, in vivo 상황의 살 아있는 두꺼운 샘플을 이 미징 할 때는 핀홀 크기를 Airy Disk size보다 2~4 배까지 크게 사용함으로 써 이미지의 밝기를 증가
시킨다. 이 때 샘플에서 산란된 빛이 핀홀 을 통과하는 비율이 증가하며 배경 노이 즈가 증가하나, in vivo 상황의 경우 충분 한 형광신호를 획득하는 것이 더욱 중요 한 경우가 대부분이다.
3.3 비디오-레이트 공초점 현미경
상용화된 공초점현미경에서 보편적으 로 사용되는 스캐닝 방식은 두 개의 갈바 노미터 기반의 거울을 이용하여 반사광의 패턴을 생성하는 방식이다. 일반적으로 2 차원 평면을 순차적으로 커버하기위해서, 한 거울은 여기광을 주로 횡방향의 ‘fast axis’로 스캔하 고, 다른 거울은 주로 종방향의 ‘slow axis’로 훨씬 느린 속도로 스캔한다. 따라서 영상획득의 속도는 ‘빠른 축’
스캐너의 최대 속도에 의해서 제한되게 되며, 보편적인 갈바노미터 기반 거울의 속도는 500 Hz에서 1 kHz로, 512 x 512 화소의 영상을 초당 1 - 2장 얻을 수 있는 속 도이다. 그러나, 생체 내 현미경과 같이 살아 있는 개체 내의 생명현상의 관찰을 목적으로는 초당 24 - 30장의 영상을 얻는 비디오-레이트 동영상수준의 영상획득 속 도가 매우 유용하다. 혈액순환이나 근육반사, 신경전달 등이 대표적인 빠르게 일어나는 생체 내 동적현상이다.
그림 3은 본 연구실에서 구축한 비디오-레이트 공초점 현미경 셋업의 개략도 및 사진이다. 491nm, 532nm, 637nm 3가지 파장의 레이저 광원을 이용하여 동시에 3 가지색 형광이미징이 가능하다. 다각회전거울과 갈바노
그림 2. 공초점 현미경의 원리. (a) 여기광의 경로 (b) 초점 면으로부터 방출된 형광신호의 광로 (c) 비초점 면으로부터 방출된 형광신호의 광로
그림 3. 비디오-레이트 생체 내 공초점 현미경셋업.생체 내 실시간 형광영상획득을 위해 구축된 3파장공초점 현미경 셋업의 (a) 개략도 및 (b) 사진 (DBS, dichroic beam splitter; BPF, band pass filter; M, mirror; PMT, photomultiplier tube; OBJ, objective lens)
다시 스캐닝시스템을 거쳐 DBS로 각 파장 대역 별로 분 리하여 핀홀을 통과한 후 PMT (Hamamatsu, R9110) 로 검출하였다. Frame Grabber (MATROX, Solios)를 사용하여 3파장 비디오-레이트 공초점 이미지를 초당 30장의 속도로 획득하였다.
4. 생체 내 현미경 기술을 사용한 응용연구
4.1 조혈줄기세포 생착 및 분화과정 생체 내 영 상화
조혈줄기세포(Hematopoietic Stem Cells)는 주로 골 수에 위치하며 세포분열 시 스스로를 재생하는 Self- renewal을 통해 전 생애에 걸쳐 유지되며, 생체 내 혈 액계를 구성하는 모든 종류의 혈액세포들로 분화할 수 있다. 조혈줄기세포는 다른 줄기세포에 비해 상대적으 로 쉽게 채취할 수 있으며, 타인에게 이식 후 효과적으 로 골수에 생착하여 혈액계를 전생애에 걸쳐 재구성하 기 때문에 임상에서 혈액질환의 치료에 광범위하게 이 용되고 있다. 조혈줄기세포의 활발한 임상활용에 근거 한 높은 경제적 가치에 비해, 아직 조혈줄기세포의 생착 기능 및 미세환경의 영향, 노화과정의 분자 및 세포 수
생착과정 연구가 이루어지고 있으나(8), 한 개체 내에서 장기간 관찰과 세포 수준의 고해상도 분석이 부족한 실 정이다. 본 연구에서는 단일세포수준 고해상도로 초당 30장의 3색 형광이미지를 얻을 수 있는 초고속 생체 내 공초점현미경을 이용하여, 살아있는 생쥐의 두개골 골 수에서 조혈줄기세포의 생착 및 분화과정을 장기간 영 상화하였다. C57BL/6 생쥐를 사용하였으며, 혈액세포 손상조건에서 조혈줄기세포의 생착을 관찰하기 위해 이 미징 2시간 전에 방사선을 쬐어주었다. 이미징하는 동 안 생쥐는 마취되어 있으며, 두피 절개를 통해 노출된 두개골과 생쥐의 체온은 각각 덥혀진 식염수와 Heating pad를 이용하여 온도와 습도를 유지시켰다. Anti- CD31 항체와 근적외선 형광물질(Alexa647)을 결합한 후, 혈액 내로 주입하여 두개골 골수내 혈관 및 sinusoid 내피를 형광표지 하였다. 일반 골수세포와 함 께 조혈줄기세포 밀도가 높은 선별된 c-kit+ 골수세포 를 각각 DsRed 생쥐와 H2B-GFP 생쥐에서 분리해내 어 주입하였다. c-kit+는 조혈줄기세포를 구분할 때 사 용되는 표지자 중 하나이다. DsRed 생쥐는 모든 세포에 서 적색형광단백질을, H2B-GFP 생쥐는 세포핵 내 H2B단백질에 녹색형광단백질이 발현되어, 추가적인 형 광표지 없이 생체 내 세포를 관찰 할 수 있다. 그림 4는 anti-CD31 항체(청색)로 염색된 두개골 골수의 혈관과 sinus를 보여주며, 골수 세포와 c-kit+ 세포들이 정맥 으로 주입된 후 시간에 따라 생착되고 분화되는 패턴을 보여준다. 정맥으로 세포주입 후 2시간 안에 많은 골수 세포들이 혈관 또는 sinus를 빠져나와 주위에 자리를 잡고, 96시간(4일)에 급격히 분열하기 시작한다. 18일이 지나면 이식된 세포들이 혈관 또는 sinus주위를 가득 메우게 되고 (그림 5), 일부세포는 sinus를 감싸며 혈관 주위에 위치하며 (그림 5D), c-kit+ 세포들 중 일부가 도넛모양의 세포들로 분화된 것을 관찰하였다 (그림 5E). 도넛모양의 세포들은 그림 5B, 5D에서 화살표로 표시된 세포 그룹에서 분화된 것으로 추정되며, H2B- GFP 신호(녹색)가 원래 모세포에 비해 낮으며 세포형상
그림 4. 두개골 골수 내 혈관과 sinus(청색, CD31). 이식한 골수 세포(적색, DsRed)와 c-kit+ 세포(녹색, GFP)의 생착 및 분화과정의 반복영상화 결과. 96시간 후이미지에 삽입된 사각형은 그림5(A-D)로 확대함
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도 도넛형으로 변화한 것으로 보아 적혈구의 전구세포 인 reticulocyte로 추정된다.
4.2 테라헤르츠파로 유도된 염증반응의 생체 내 영상화
테라헤르츠파 영역은 일반적으로 0.3~3THz의 진동 수를 갖는 전자기파 영역을 의미한다. 이 전자기파 영역 의 독특한 특성들로 인해, 발생, 검출, 활용 등이 다양하 게 연구되고 있다. 특히 수분과 강하게 상호작용하는 특 성은 다양한 생물학 관련 분야에 활용 가능할 것으로 기 대되고 있다. 테라헤르츠파의 활용에 대한 연구와 더불 어, 테라헤르츠파가 생명체에 미치는 영향에 대한 연구 또한 활발히 진행 중에 있다. 세포, 식물, 곤충, 동물 등 다양한 생명체에서 이루어진 여러 연구들에서, 테라헤 르츠 파의 조사가 생물표본의 기능변화를 비롯해 그에 따른 다양한 영향을 미침을 보였다(9). 본 연구에서는
구축된 비디오-레이트 공초점 현 미경을 사용하여, 피부조직에서 테라헤르츠파에 의한 염증반응을 관찰하였다. 원자력연구원에 구 축 된 자 유 전 자 레 이 저 기 반 2.7THz의 전자기파 발생 장치를 이용하여 실험을 수행하였다. 테 라 헤 르 츠 파 는 오 목 거 울 로 9.3kW/cm2의 macropulse intensity를 갖도록 300μm 지름 의 초점에 집속하여 3Hz 주기로 마취된 생쥐의 귀 피부 표면에 60 분간 조사하였다. 테라헤르츠파 의 영향을 관찰하기 위해 혈관내피세포에서 특이적으로 녹색형광단백질(Green Fluorescence Protein: GFP)을 발현하는 Tie2-eGFP 마우스를 사용하여 테라헤르츠파 조사 전후에 동일한 영역을 영상화하였다. 한편 테라헤 르츠파 조사 24시간 이전에 Alexa 647과 결합된 Gr-1 항체를 주사하여 염증반응의 중요한 세포 표지자인 neutrophils을 형광표지 하였다. 그림 6은 테라헤르츠 파 조사 1시간 전과 테라헤르츠파 조사 후 8시간 경과된 시점에 테라헤르츠파가 조사된 피부의 동일영역에서 획 득한 영상이다. 녹색혈관패턴을 통해 두 이미지가 동일 한 영역임을 확인할 수 있고, 테라헤르츠파 조사 후 적 색형광을 보이는 neutrophils의 수의 증가를 통해 염증 반응이 유도되었음을 확인하였다.
5. 결론
생체 내 현미경을 이용해 생체 내 환경에서의 세포수 준의 역동적인 과정들을 실시간으로 직접 영상화하는 것은 기존의 ex vivo 분석법으로는 접근이 불가능했던 새로운 관점을 제시해 준다. In vitro 기반 연구는실험 적 조작이 유연하며 다양하게 변형될 수 있다는 강점을 기반으로 많은 중요 발견을 가능토록 하였으나, 실제 생 체 내 조직이 생리학적 조건에서 가지는 미세환경을 재 현하는 것이 불가능함에 기인한 다양한 한계가 있다. 오 직 생체 내 in vivo 연구에서만이 이러한 실제 미세환경 내 현상의 분석이 가능하다는 점에서 생체 내 현미경 기
그림 5. 이식 후 4일(A, B)과 18일(C-E) 경과시점에 동일 위치의 두개골 골수 내 sinus(청색), 골수세포(적색)와 c-kit+ 세포(녹색) 영상화 결과. 그림 B와 D는 각각 A와 C의 사각형을 확대함. Scale bars, 30μm (B, D), 10μm (E)
그림 6. 테라헤르츠파 조사 전후의 Tie2-eGFP 생쥐의 피부 형광 영상, 혈관 (녹색, GFP), neutrophil (적색, Alexa 647)
참고문헌
[1] Diaspro, A., Optical Fluorescence Microscopy, Springer, New York (2010)
[2] Lichtman, J.W., Conchello, J-A., Fluorescence microscopy, Nat. Methods, 2, 910-919 (2005) [3] Kim, S, Lim Y. T., Soltesz E.G. et al.,Near-infrared
fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping,Nat. Biotech., 22, 93-97 (2004)
[4] Pawley, J.,Handbook of Biological Confocal Microscopy, Springer, New York (2006)
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Nonlinear Optical Microscopy, Oxford University Press, USA, New Work (2008)
[7] Helmchen, F., Denk W., Deep tissue two-photon microscopy,Nat. Methods, 2, 932-940 (2005)
(2011)
김필한
약 력• 2010년 11월 - 현재
한국과학기술원 나노과학기술대학원 조교수
• 2005년 11월 - 2010년 10월
Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital
Wellman Center for Photomedicine, Research Fellow
• 2000년 3월 - 2005년 8월 서울대학교 전기공학부, 공학박사
• 1996년 3월 - 2000년 2월 서울대학교 전기공학부, 공학사
