Random Amplified Polymorphic DNA Genotyping에 의한 항결핵제 내성 결핵균의 분자 역학적 특성

서 론

결핵은 국민의 보건수준이 향상에도 불구하고 아직도 국내의

이환률 및 사망률이 높아 많은 경제적 손실을 초래하는 만성질환 이다. 국내 결핵이환 환자는 약 42만명 이상인 것으로 추정되고, 인구 10만명당 연간 폐결핵 유병률은 인구 10만명당 흉부 엑스선 검사소견으로는 약 1,032명, 객담의 결핵균 양성소견으로는 약 219명인 것으로 추정되며[1] 인구 10만명당 결핵에 의한 사망률 은 7.4%이고 감염성 질환자중 결핵 사망률은 57.3%인 것으로 통 계되었다[2]. 결핵균 배양양성 환자의 약 10%가 하나 또는 그 이 상, 6% 이상에서 두가지 또는 그 이상의 항결핵제에 대해 내성을 보이며 구환에서의 항결핵제 획득내성률은 25.0%이므로 아직 환

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Random Amplified Polymorphic DNA Genotyping에 의한 항결핵제 내성 결핵균의 분자 역학적 특성

Molecular Epidemiological Characteristics of Drug-resistant Mycobacterium tuberculosis by Random Amplified Polymorphic DNA Genotyping

Jong Chan Jeon, M.D., Dong Seok Jeon, M.D.,* and Jae Ryong Kim, M.D.*

Department of Family Medicine, Kyungju-Dongsan Hospital, Kyungju;

Department of Clinical Pathology,* University of Keimyung College of Medicine, Taegu, Korea 전종찬∙전동석*∙김재룡*

경주동산병원 가정의학과, 계명대학교 의과대학 임상병리학교실*

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접 수

:

:

:

교 신저 자

:

우 700-310 대구광역시 중구 동산동 194 계명의대 동산의료원 임상병리과 전화: 053-250-7222, Fax: 053-250-7275

E-mail : [email protected]

Background :

In spite of appropriate therapy and control for tuberculosis, the prevalence of tuberculosis is still frequent in Korea. Emerging infection and rapid detection of multidrug-resistant

study, we evaluated the usefulness of random amplified polymorphic DNA (RAPD) genotyping for molecular epidemiological characteristics of MDR-TB.

Methods :

We analyzed 64 clinical strains of M. tuberculosis including 35 strains which showed resistance to one or more antimycobacterial drugs and M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294), as a drug-sensitive control strain. RAPD genotyping analysis was carried out under eight reaction con- ditions and using ten random primers (A-1245, AP-50, B-1245, DKU-44, DKU-49, Leg-1, INS-2, IS- 986-FP, PF-15 and MBR).

Results :

RAPD patterns using six primers (IS-986-FP, DKU-44, DKU-49, INS-2, B-1245, and AP- 50) showed marked polymorphisms that were easier to discriminate than those with other primers.

RAPD patterns represented various polymorphisms among 64 strains. However, RAPD could not discriminate MDR-TB strains from drug-sensitive ones.

Conclusions :

RAPD genotyping is assumed a preferable technique for discrimination among clin- ical strains of M. tuberculosis but not for specifying MDR-TB strains. (Korean J Clin Pathol 2001; 21:

274-81)

Key words : Mycobacterium tuberculosis, MDR, RAPD, Genotyping

자관리가 효율적이지 않음을 보여주고 있다[1]. 이런 다약제 내성 (Multidrug resistance, MDR) 결핵균의 출현으로 효과적인 결핵 치료 및 약제내성 검사방법이 요구되고 있는 실정이다[3].

Mycobacterium tuberculosis

의 균주간 감별을 위해 PCR에 의한 형별검사법이 처음 사용된 이후[4], random amplified polymorphic DNA (RAPD) 분석법으로 발전되었다. 이 방법은 미생물의 형별 구분이 용이한 일종의 DNA 지문 검사법으로서 증폭하고자 하는 표적 유전자의 유전자 구조(염기서열)에 대한 사전지식이 필요하지 않는“low-stringency”원리를 이용한 것 이다. 외국에서는 RAPD 기법을 이용한

및

other than tuberculosis (MOTT)의 형별분석 이 보고되고 있지만[5-7], 아직 우리나라에서는 결핵균에 RAPD 기법을 적용한 분자 역학적 분석사례가 없었다.

이에 본 연구에서는 항결핵제 감수성 결과가 확인된 결핵균 64 주와

H37Rv (ATCC 27294) 1주를 대상으로 random 시발체 10종을 사용하여 RAPD 기법을 이용한 결핵균 의 DNA 형별분석을 실시하고 약제 내성유형과의 상관관계를 평 가하여 우리나라에서 분리되는 결핵균 균종간의 감별 및 다약제 내성 결핵균의 신속검출에 용이한 RAPD의 특정 시발체의 설정 가능성 및 그 유용성을 판정하고자 하였다. 또한 RAPD법에 의 한 검사결과를 결핵균의 유전자형에 대한 데이터베이스 구축의 기본자료로 이용하여 결핵관리 및 역학적 접근을 위한 자료로 활 용하고자 하였다.

재료 및 방법 1. 대상균주 및 항균제 감수성 검사

결핵균주는 대구 가톨릭 대학병원에서 42주와 대한 결핵협회에 서 22주를 분양받아 총 64주를 이용하여 RAPD 유전자형을 분 석하였으며, 이들은 모두 객담에서 유래하였다. 약제감수성검사 표준균주로는

H37Rv (ATCC 27294)를 이용 하였다. 항결핵제 감수성 검사를 위하여 Lowenstein-Jensen (LJ) 배지를 사용하였고, 동정된 결핵균주를 각각 일정한 농도의

항결핵제에 McFarland 탁도 1.0으로 조정하여 각각 분주하고 37

℃ 배양기에서 4-6주 동안 배양한 다음 균 증식유무를 판정하였 다. 항결핵제 감수성검사에는 isoniazid (INH), rifampin (RFP), streptomycin (Sm), ethambutol (EMB), kanamycin (KM), tuveractin (enviomycin sulfate), ethionamide cycloserin (CS), para-aminosalicylic acid (PAS)와 pyrazinamide (PZA)를[8]

사용하였고 결과에서 한가지 이상의 약제에 내성을 보인 35주에 서 내성유형과 RAPD 결과를 비교하였다.

2. RAPD 유전자형 분석

1)

분석에 이용한 시발체

시발체는 바이오니아사(한국)에 주문 제작하여 이용하였으며 A-1245[7], B-1245[7], AP-50[9], DKU-44[10], DKU- 49[10], INS-2[5], IS986-FP[5], Leg-1[7], MBR 및 RP- 15[11]로 10종의 random 시발체를 8가지 조건으로 사용하였다.

PCR 반응조건은 해당 random 시발체의 종류에 따라 다소간 차 이가 있으며 이는 Table 1에 명시하였다.

2)

^{분석을 의한}

^적정조건

RAPD 분석시 DNA 분리정제 방법에 따른 DNA 순도 영향을 보기 위하여 균집락을 100 L의 TE buffer에 부유하고 micro- wave oven에서 출력 750 Ｗ로 3분, 3분, 2분, 2분씩 4회 처리한 후 12,000 rpm으로 10분간 원심한 상층액을 주형 DNA로 이용 하였다(microwave법). 각기 DNA 농도는 파장 260 및 280 nm 에서 분광광도계를 측정하였다. Proteinase K법은 증식된 집락을 Tris-EDTA-NaCl (TEN, pH 8.0) 완충액에 부유하여 pro- teinase K와 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 각각 2 mg/

mL 및 1% (w/v) 농도로 가하여 잘 혼합하고 37℃에서 하룻밤 방치 후, phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1, v/v)을 넣고 진탕한 뒤 4℃에서 원심 분리하여 상층액을 상기의 방법으 로 1회 더 시행한 뒤 ethanol로 DNA를 원침시키고, 정제된 DNA 침사는 증류수에 녹여 검사 전까지 -20℃에 보관한 후 이용하였 다. RAPD 분석에 이용되는 주형 DNA의 분리방법에 따른 차이 를 보기 위한 실험 결과, microwave법은 시간적, 기술적인 면에

Primers Predenaturation (℃, min)

Denaturation (℃, sec)

Annealing (℃, sec)

Extension

(℃, min) Cycles Postextension

(℃, min)

AP-50 94, 3 94, 60 37, 60 74, 1 45 74, 4

RP-15/MBR 94, 3 94, 30 38, 30 72, 1 40 72, 4

DKU-44/49 94, 3 94, 30 40, 15 72, 0.5 35 72, 4

A-1245 94, 5 92, 60 35, 60 72, 2 36 72, 7

B-1245 94, 5 92, 60 35, 60 72, 2 36 72, 7

Leg-1 94, 5 92, 60 35, 60 72, 2 36 72, 7

IS-986-FP 94, 3 94, 20 35, 60 72, 1 40 72, 7

INS-2 94, 3 94, 30 40, 15 72, 0.5 35 72, 4

Table 1.

Eight PCR conditions of 10 primers tested for RAPD analysis

서는 신속하고 간단한 방법이었지만 proteinase-K법과 비교할 경 우 band의 개수 및 해상력, 분별력이 다소 떨어져 균주간의 형별 분석, 특히 유사도를 검증하기 위한 분석에는 적절하지 않았으므 로 주형 DNA의 분리는 후자의 방법으로 표준화하였다.

RAPD 분석시 주형 DNA 및 시발체의 농도비율을 결정하기 위하여 다양한 농도의 주형 DNA 및 시발체를 이용하여 분석하 였다. Random 시발체 RP-15와 MBR는 동량으로 50 pM에서 2,500 pM까지 양을 조절하여 검사하였으며, DKU-44와 DKU- 49 시발체의 농도를 각각 100 pM으로 하여 RAPD를 실시하였 다. RAPD 분석에 이용되는 주형 DNA의 분리방법에 따른 차이 를 보기 위하여 100 pM로 시발체 농도를 일정하게 고정하고 주 형 DNA 농도는 10 ng/mL에서 200 ng/mL로 하여 핵산 증폭 기(GeneAmp PCR system 9600, Perkin-Elmer, Norwalk USA)로 분석하였다. Random 시발체 RP-15와 MBR를 동량으 로 2,500 pM에서 50 pM까지 양을 조절하여 검사해 본 결과 random 시발체의 농도가 과다할 경우는 분획의 끌림(smear) 현 상이 생겼고, 약 100 pM에서 500 pM사이에서 비교적 분석이 용이하였다. RAPD에 적절한 주형 DNA 농도를 알기 위하여 DKU-44와 DKU-49 시발체의 농도를 각각 100 pM으로 하여

RAPD를 실시한 결과, 10 ng/mL에서 200 ng/mL까지 유사한 RAPD 분획 유형을 보였기에, 이 연구에서는 주형 DNA의 농도 를 20 ng/mL로 표준화하여 실험하였다.

3)

^{증폭산물 분석}

증폭된 산물은 2% SeaKem agarose (FMC, Rockland, ME., USA)에 분주하여 TBE 완충액(22.5 mM Tris-borate, 0.5 mM EDTA, pH 8.0)으로 100 V, 50-60분간 전기영동하였다. 전기 영동이 끝난 후 ethidium bromide로 염색, 세척하고 UV-tran- silluminator에서 관찰 및 사진 촬영하였다.

4) 유전적 계통분석 및

^도식화

RAPD 분석결과에서 얻어진 분획 유형의 판정을 위하여 균주 에서 band가 나타난 경우를 positive data로서 1로, 나타나지 않 은 경우를 negative data로서 0으로 처리하여 얻어진 data ma- trix를 군집분석에 이용하였다. RAPD결과를 바탕으로 분자유전 학적 연관관계(유사도)를 구하고. 군집분석을 위해 NTSYS-pc (version 1.8, Exeter Software Co., Setauket, NY, USA) 소 프트웨어를 이용하였고 UPGMA (unweighted pair group me- thod of arithmetic average) 분석법 및 Dice 공식을 이용하여 dendrogram을 도식화하였다. 각 균주간의 상사성을 알기 위한 Dice 공식은 다음과 같다.

결 과 1. 항결핵제 약제감수성 유형분석

총 64주의 항결핵제 감수성결과에서 내성유형은 22가지로 나 타났으며 한가지 이상의 약제에 내성을 보이는 경우는 35주 (53.8%)였다. RFP에 내성을 보이는 균주가 26주(40%)였고, 26 주 중에서 RFP 단독내성을 보이는 경우는 단 3주에 불과하였으 며, 23주(88.5%)가 RFP이나 다른 약제에 동시에 내성을 보였다.

35주의 약제내성 결핵균 중 2주(5.7%)는 INH 및 RFP이외의 항결핵제에 내성을 나타내고 있다(Table 2).

2. RAPD 분석과 dendrogram 분석

총 10종의 random primer를 이용한 RAPD 유형 및 dendro- gram의 결과, A-1245, AP-50, B1245, DKU-44/DKU-49, INS-2, IS-986-FP, Leg-1, RP-15/MBR의 random 시발체 및 시발체 조합 중에서 시발체 염기수가 10 mer인 경우 AP-50은 비교적 균주간 감별이 양호하였으며, RP-15와 MBR은 단독 사

두 균주간의 공통유전자 분획의 수 × 2 두 균주간의 염색체 유전자 분획의 전체수 Similarity

coefficient (%) = × 100

Inh 11, K10752, K10753, K10824

InhRfp 2, 17, K10421, K10445, K10458,

K10465, K10843

InhRfpEmb K10842, K10845

InhRfpEmbPza 66, K10851

InhRfpEmbPzaOfx K10852

InhRfpEmbPzaPasPth K10850

InhRfpEmbPzaKmOfx K10847

InhRfpEmbPzaKmOfxPth K10844

InhRfpEmbOfx K10846

InhRfpEmbOfxKm 55

InhRfpEmbOfxEthCp 56

InhRfpSmOfx 3

InhRfpSmOfxKmPthPza K10841

InhRfpSmPas K10849

InhRfpSmPza K10848

InhEmb 43

InhEthPas 9

InhEthSm 22

Rfp K10760, K10765, K10779

RfpEmbKm 16

Eth 14

EthCs 6

Antibiogram to resistant drugs Strains

Table 2.

Antibiogram of 35 strdins of drug-resistant M. tuber-

*Strains 2-66 were provided by Catholic University Hospital of Taegu and strains K10421-K10852 were provided by Korean National Tuber- culosis Association.

Abbreviations: Cp, capreomycin; Cs, cycloserin; Emb, ethambutol;

Eth, ethionamide; Inh, isoniazid; Km, kanamycin; Ofx, ofloxacin; Pas,

para-aminosalicylic acid; Pth, prothionamide; Pza, pyrazinamide; Rfp,

rifampin; Sm, streptomycin.

AP-50 TGCATGCTGA GD

RP-15/MBR TCGCTGGTGT/GCCGTTGCCG GD

DKU-44/49 CCGGGGCGGTTC/ GD

CCGCCGACCGAG

A-1245 GCCGCCGAAACGATCTAC PD

B-1245 {AGGTGGCGTCAGGAAGAC GD

Leg-1 GTCATGAGGAATCTCGCTG PD

IS-986-FP ACGCTCAACGCCAGAGACCA GD

INS-2 GCGTAGGCGTCGGTGACAAA GD

Primers Sequence (5'-3') RAPD profile

Table 3.

Ten primers tested for generation of RAPD profiles with purified DNA from strains of M. tuberculosis

Abbreviations: GD, good discriminations of RAPD bands; PD, poor discriminations of RAPD bands.

1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 16 17 19 22 25 31 34 36 38 39 40

M C

M C

M

42 43 44 53 54 55 56 57 58 59 60 64 65 67 70 H37Rv K10458 K10465 K10752 K10753 K10760 K10779 K10824 M

A

1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 16 17 19 22 25 31 34 36 38 39 40 42 43 44 53 54 55 56 57 58 59

M

M C

M

60 61 62 64 65 66 67 70 H37Rv K10421 K10445 K10458 K10465 K10752 K10753 K10760 K10765 K10779 K10824 K10841 K10842 K10843 K10844 K10845 K10846 K10847 K10848 K10849 K10850 K10851 K10852 980 981 M

B

1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 16 17 19 22 25 31 34 36 38 39 40 42 43 44 53 54 55 56 57 58 59

M

M

M

60 61 62 64 65 66 67 70 H37Rv K10421 K10445 K10458 K10465 K10752 K10753 K10760 K10765 K10779 K10824 K10841 K10842 K10843 K10844 K10845 K10846 K10847 K10848 K10849 K10850 K10851 K10852 980 981C M

D

1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 16 17 19 22 25 31 34 36 38 39 40 42 43 44 53 54 55

M C

M C

C M

56 57 58 59 60 64 65 67 70 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K13 K14 K15 K16 K17 H37Rv K10458 K10465 K10752 K10753 K10760 K10779 K10824M

C

1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 16 17 19 22 25 31 34 36 38 39 40 42 43 44 53 54 55 56 57 58 59 60

M

M

C M

61 62 64 65 66 67 70 H37Rv K10421 K10445 K10458 K10465 K10752 K10753 K10760 K10765 K10779 K10824 K10841 K10842 K10843 K10844 K10845 K10846 K10847 K10848 K10849 K10850 K10851 K10852 K8 K9 K10 980 981C M

E

Fig. 1.

RAPD profiles generated from 5 primer combinations, AP-50 (A), B-1245 (B), DKU-44/DKU-49 (C), INS-2 (D) and IS-986-FP (E), that showed good discriminations among 8 different combinations using ten random primers. Lane M of each figure is 100-bp DNA lad- der size marker. Lane C is negative control. The numbered lanes are strains of M. tuberculosis provided from 2 centers (see Table 2).

용시와 병용할 경우 성적이 유사하였으나, 12 mer인 DKU-44와 DKU-49는 병용시 더 좋은 RAPD 유형을 얻을 수 있었다 (Table 1). 전반적으로 AP-50, B-1245, DKU-44, DKU-49, INS-2 및 IS-986-FP의 6종의 시발체를 이용한 조합에서 얻은 RAPD 유형이 결핵균주 간의 감별에 우수하였다(Table 3, Fig.

1). 시발체의 종류에 따라 RAPD 양상은 약간의 차이는 있지만,

결핵균의 군집분석상 유사도가 비교적 높은 균주들의 형태를 나

타내고 있었다(Fig. 2). 그러나 10종의 시발체를 이용한 RAPD

유형을 전체적으로 종합하면 64주는 매우 다양한 RAPD 유형으

로 구분되었다.

3. 항결핵제 내성유형과 RAPD 유형의 비교분석

RFP을 비롯한 특정 약제내성 결핵균과 특정 RAPD 유형과 상관관계를 조사하기 위하여 dendrogram상에서 나타난 유사도 를 기준으로 하여 약제내성균에 의의가 있는 RAPD 유형과 유사 도가 상대적으로 높은 하나의 혹은 특정한 subclass의 존재여부 를 분석하였다. 항결핵제의 내성균주들이 모든 RAPD dendro- gram상에 산만하게 분포하며, 특정 dendrogram의 subclass에서 우세하게 분포하는 양상은 찾을 수 없었으므로 항결핵제 내성 여 부와 RAPD 유형에는 유의한 연관성을 찾을 수 없었다.

고 찰

결핵은 적절한 치료법의 발전과 예방대책의 수립에도 불구하고

아직도 국내에서는 유병률이 높은 편이며, 유전자변이에 의한 항 결핵제 내성 결핵균의 출현과 다약제 내성 결핵균에 의한 감염으 로 이에 대한 신속한 검출에 관심이 고조되고 있다. 결핵균의 균 주 감별 및 역학적 분석은 감염의 전파경로를 밝히는데 유용하며, 재활성 결핵인 경우 외인성 재감염과 내인성 재발을 구별하는데 필요하다. 세균감염시 역학조사를 위해 다양한 형감별법이 연구 되어 왔는데, 항균제 내성양상, 박테리오파지 분석법, 협막형, 혈 청형, 다방성 효소전기영동법 등의 표현형 검사와 플라스미드 분 석법, 염색체 유전자제한 분석법 등의 유전형 검사로 대별할 수 있다[12].

RAPD는 일명 arbitrary primer PCR이라고도 불리며 결핵균 을 비롯한 다양한 미생물의 DNA지문 검사에 이용되고 있다[13, 14]. 이 기법은 특이 표적에 대한 시발체 대신에 10-20-mer의 random 시발체를 이용하여 낮은 결합온도에서 여러 부위를 증폭 이 되게 하는“low stringency”를 이용하는 방법이다. 결핵균에

RAPD with AP-50

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

B

RAPD with A-1245 primer

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

A

RAPD with DKU-44 & 49 primer

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.9

D

RAPD with B-1245 primer

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

C

Fig. 2.

Dendrograms of RAPD patterns with 8 combinations of primers. A, A-1245; B, AP-50; C, B-1245; D, DKU-44/DKU-49 (Fig. 2. con-

1 2 3 32 63 34 45 14 19 13 4 20 28 29 31 25 46 15 41 17 5 53 61 6 7 9 10 11 18 40 43 44 12 13 21 22 23 24 25 26 36 42 55 57 60 8 48 27 33 51 50 37 39 47 30 39 54 42 59 56 62 58 52

1 8 14 16 60 18 21 24 26 28 36 46 47 45 5 7 13 54 17 49 62 34 3 11 12 4 25 6 22 50 27 29 38 44 31 23 33 43 52 56 58 51 6 20 48 59 63 15 55 2 30 40 41 10 18 57 35 38 61 37 53 22

1 2 8 44 49 25 3 4 26 31 32 33 41 45 46 6 7 23 42 10 57 51 47 56 38 12 27 18 28 29 11 5 58 60 53 54 37 13 14 55 63 15 16 17 24 48 50 20 36 35 40 22 34 19 30 21 62 53 52 43 38 61 9 1 43 46 49 50 22 23 24 30 32 31 43 44 47 45 33 35 34 2 3 9 10 27 28 29 36 37 4 25 26 6 9 14 15 40 11 12 41 17 19 38 39 5 7 42 13 16 19 20 21

대한 형감별법 시행시 RAPD는 박테리오파지법보다 더 많은 다 형성을 관찰할 수 있고 기술적으로 더 쉽고 더 빠르며 방사선물 질이 필요없어 안전하다고 하였으며[6]. Harn 등은 결핵균의 RAPD에 의한 지문검사가 RFLP법에 의한 경우보다 더 빠르고 기술적으로 더 쉽고 필요한 DNA량이 적으며 DNA 염기서열에 대한 지식이 없이도 시행할 수 있는 장점이 있다고 하였다[5].

또한, 항산균의 유전적 다형성 연구를 RAPD법으로 실시한 결과, 많은 대상군을 위한 유전형검사시 가격과 시간적으로 효과적이며 적절한 방법이라고 하였다[11]. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) 및 최근에 개발된 mixed PCR 등의 분 자형별 검사와 비교하였을 때 RAPD는 더욱 신속하며 증폭하고 자 하는 미생물에 대한 염기서열 및 유전자에 대한 사전지식이 필요하지 않으며 비교적 술식이 간편한 장점이 있다. 또한, PFGE를 하기 위해서는 고가의 장비가 있어야 하며 특수연구기 관이 아닌 일반적인 검사실에서 시행이 용이하지 않으나 RAPD 는 PCR이 가능한 검사실이라면 쉽게 시행할 수 있고 신속하므로

국내에서도 다른 균주에서 이용사례가 증가하고 있다[15, 16].

본 연구에서 결핵균 64주를 대상으로 10가지 시발체를 이용하여 RAPD를 실시한 결과, 그 양상이 균주간에 매우 다양함을 확인 할 수 있었다.

앞서 언급한 바와 같이 RAPD는 여러 가지 장점들을 가진 매 우 매력적인 방법이지만 검사실간 또는 검사간 재현성이 낮은 방 법으로 알려져 있으므로 재현성 있는 결과를 얻기 위해서는 몇가 지 고려해야 할 사항이 있다. 핵산증폭기의 종류,

poly- merase의 종류, 주형 DNA 농도와 순도 및 시발체와 DNA의 비 율 등의 요인이 재현성 있는 결과를 얻는데 영향을 줄 수 있다고 한다[17-19]. 그러므로 이 연구에서는 핵산증폭기를 한 기종으로 계속하여 동일한 조건을 유지하고자 하였으며, RAPD에 이용된 시약도 동일한 시약을 이용하는 등 동일한 검사조건을 유지하여 시행하였다. 그러나, 추후 동일 균주에 대한 반복검사나 다른 방 법에 의한 확인검사로 결핵균 균주감별시 RAPD법의 유용성을 검증하는 것이 필요하다고 생각된다. 주형 DNA의 농도는 20

RAPD with INS-2 primer

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

F

RAPD with Leg-1 primer

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

E

RAPD with Rp-50 & MBR primer

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H

RAPD with IS986-FP primer

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

Fig. 2.(Continued from the previous page) E, Leg-1; F, INS-2; G, IS-986-FP; H, RP-15/MBR primers.

1 3 7 10 11 17 19 20 21 23 24 47 49 44 45 51 38 36 33 32 30 29 27 26 25 49 28 8 35 43 40 39 2 31 5 12 34 52 54 9 57 53 50 13 14 15 16 4 6 22 41 42 46 37 56 55 16 58 60 59 61 64 62 63

1 3 5 6 22 24 26 27 29 31 32 18 40 21 2 9 33 10 13 17 23 62 63 65 64 48 50 4 8 11 12 14 15 16 19 25 28 34 35 39 27 38 7 41 56 57 55 42 60 20 44 58 59 30 43 49 52 46 51 53 47 36 45 61 54 1

3 9 20 24 27 29 30 31 33 50 35 47 46 9 26 15 16 7 39 19 5 25 59 6 44 56 13 63 11 45 51 18 41 60 52 61 14 29 34 62 10 55 17 2 4 21 49 22 32 23 48 40 65 54 64 42 53 57 43 36 37 39 58 12

1 21 24 25 2 8 9 10 23 27 13 61 7 62 3 4 6 15 16 17 35 58 30 33 31 18 40 5 14 12 19 26 28 29 39 41 32 52 24 37 38 20 56 22 55 45 57 63 11 36 44 54 42 65 53 50 48 46 60 43 59 47 42 51 64

G

ng/mL로, random 시발체의 농도는 시발체 단독 이용시는 100 pM로 병용시는 각각 100 pM로서 200 pM이 되도록 하여 재현 성 있는 결과를 얻고자 하였다. 또한 결합온도가 40℃ 이상으로 올라가면 증폭되는 분획의 수는 급격하게 감소하므로 35-40℃의 온도에서 결합하도록 하였다. 또 본 연구에 사용된 10종의 시발 체 중 IS-986-FP, DKU-44, DKU-49, INS-2, B-1245 및 AP- 50의 6종의 시발체가 결핵균의 감별에 유용함을 알 수 있었다.

본 연구에서는 신속한 방법으로 약제내성 결핵균을 검출하여 치료에 적용하고자 RAPD 기법으로 결핵균의 유전자형을 결정 하고, 항결핵제 내성 유형과 연관성을 찾고자 하였다. 즉, RAPD 분석결과의 특정 유전자형이 특정 약제내성 결핵균(특히 RFP 내성 결핵균)유형과 연관성을 가질 것인가, 그리고 이런 특정 유 형을 약제내성 지표로 이용할 수 있을 것인가를 조사하여 보았다.

항결핵제 감수성검사 결과, 총 64주의 결핵균에서 한가지 이상의 약제에 내성을 보이는 경우는 35주였으며 이 중 23주가 RFP이 나 다른 약제에 동시 내성을 보였다. 내성 유형은 22가지로 나타 났으나 이들 내에서 dendrogram 상에 나타난 유사도를 기준으 로 하여 검토해본 결과, 약제 내성군에 의의가 있는 RAPD 유형 과 유사도가 상대적으로 높은 하나의 혹은 특정한 subclass가 없 었기에 유의한 연관성을 보이지 않았다. 따라서 본 연구에서 이 용된 RAPD 기법은 균주간의 감별에는 권장할 만한 기법으로 사 료되나, 약제내성유형과 유전자형간에 유의한 연관성을 밝히기에 는 미흡하였다.

요 약

배경 : 결핵은 적절한 치료법의 발전과 예방대책의 수립에도 불구하고 아직도 국내에서는 유병률이 높은 편이며, 유전자변이 에 의한 항결핵제 내성 결핵균의 출현과 다약제 내성 결핵균에 의한 감염으로 이에 대한 신속한 검출에 관심이 고조되고 있다.

이 연구에서는 항결핵제 감수성결과상 다약제 내성이 확인된 결 핵균을 대상으로 RAPD 분석법을 실시하여 분자역학적 특성을 알아보고자 하였다.

방법 : 임상검체에서 분리된

총 64주를 대상 으로 하였고 약제 감수성 표준 균주로는

H38Rv (ATCC 27294)를 사용하였다. 약제 감수성 결과상 한가지 이상 에 내성을 보이는 35주를 대상으로 약제 감수성 유형에 따른 RAPD 유전자형 분석은 10종의 random 시발체(AP-50, RP- 15, MBR, DKU-44, DKU-49, A-1245, B-1245, Leg-1, IS- 986-FP 및 INS-2)를 이용한 8개의 조건에서 실시하였다.

결과 : 총 8가지 조건에서 IS-986-FP, INS-2, DKU-44와 DKU-49, B-1245 및 AP-50의 6종의 시발체를 사용였을 때 다 형성의 분석이 훨씬 용이하였다. 결핵균 64중의 RAPD 양상은 다형성이 다양하게 분석되었다. RAPD 양상에 의해 항결핵제 감 수성과 내성 균주간의 구별은 할 수 없었다.

결론 : RAPD를 이용한 유전자형 분석은 결핵균 형별 분석에 는 유용하나 약제 내성유형과 유전자형 간에 연관성을 찾는데는 적절하지 못하였다.

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