Result : Osteoporosis-rats showed higher concentration of alkaline phoshpatase and more regenerated bone size than nor- mal-rats to a statistically meaningful level.

Dept.of esthetic restorative dentistry, Graduate School of Clinical Dentistry, Korea University

Abstract

Purpose : The purpose of this study is confirming that regeneration capacity of synthetic bone grafted to a skull of osteo- porosis-rats caused by ovariectomy differs from that of normal rats. Additionally, this study shows how a general disease like osteoporosis affects to osteointegration or bone regeneration while implanting or bone grafting.

Material and Method : 20 rats were selected for the experiment. 10 rats out of 20 rats were performed ovariectomy and induced osteoporosis. Seven weeks later, every 20 rats were formed the defect of critical size at calvary and were performed bone grafting of MBCP

synthetic bone. Four weeks later, samples were collected from all 20 rats, observed through an light microscope, and measured the size of newly formed bone in the defected area by Image Pro Plus 5.1(Media Cybernetics, LP, Silver Spring, MD, USA) program. After that, measured data between two groups were statistically com- pared. SPSS Ver. 12.0(SPSS, Chicago, IL, USA) program was used. The concentration of alkaline phosphatase were mea- sured for confirming the induction of osteoporosis.

Result : Osteoporosis-rats showed higher concentration of alkaline phoshpatase and more regenerated bone size than nor- mal-rats to a statistically meaningful level.

Conclusion : Osteoporosis-rats lacked of bone regeneration compared to normal-rats.

Key words :Bone regeneration, MBCP

, Osteoporosis, Ovariectomy

The effect of MBCP ^TM bone regeneration in osteoporosis induced rats

Won Hee Kim, Jeong Kyung Kang, Jae Jun Ryu

골다공증 유발 쥐에서 MBCP ^TM 합성골 이식시 신생골 생성에 미치는 영향

김원희, 강정경, 류재준

고려대학교 임상치의학대학원 심미수복학과

골이식은 치과 임프란트 수복에 있어 필수적인 부분이다.

그러나 이식된 골이 성공적인 이식이 되기 위해서는 많은 요 인들에 영향을 받는다. 그 대표적인 것으로 재료의 선택, 외과 적 숙련도, 숙주의 전신적 또는 부분적 상태와 술후 관리적 요 인들이 있다. 이 중 많은 연구에서 골다공증과 같은 숙주의 전 신 요인은 매우 중요한 요인으로 밝혀졌다

. 그러나 골다공증 이 골이식에 부정적 영향을 줄 것이라는 의견에도 불구하고 아직 명확한 연구가 이루어져 있지는 않다

골다공증은 골량이 감소하고 골의 미세구조가 변형되어 부 서지기 쉬워지게 되면서 결과적으로 골절의 위험성이 증가되 는 질환이다

. 고령의 성인에서 골 흡수율이 골의 재형성율을 초과하여 골량이 감소하면 골다공증을 초래하게 되는데, 고 령의 여성, 특히 초기 폐경기 여성의 약 25%가 매년 5∼8%의 골량 감소를 겪는다는 보고도 있다

. Bae는 30세의 골다공증 여성 환자와 50세 정상적인 여성의 골흡수량이 거의 같고, 이 를 바탕으로 골 흡수량은 연령보다도 난소 기능의 소실 여부 가 더 큰 영향을 미친다고 보고하였다

.

이러한 골다공증은 구강 내에서도 그 증상이 나타나며, 악 골에서 잔존치조골의 골소실과 상관관계가 있다고 보고되기 도 하였고

, Kribbs는 골다공증 환자들이 동일 연령의 정상 인들 보다 초기 치아 상실 위험이 높았다고 보고하였다

.

이처럼 골다공증은 골 재건술이나 임프란트 식립시 골 이식 술의 성공 여부에 영향을 미칠 수 있는 주된 전신적 요인일 뿐 만 아니라 골다공증으로 인해 나쁜 골 조직과 치주조직 상태 를 가진 환자에게 임프란트 시술이나 외과적 처치가 오히려 정상인보다 많이 필요할 것이라 예상되며, 이와 더불어 수반 되는 골 이식술 역시 점점 증가할 것임을 짐작 할 수 있다.

따라서 본 연구의 목적은 난소절제술로 인해 골다공증이 유 발 된 쥐의 두개골에 임계 크기의 결함을 형성한 후 이식한 합

에 미치는 영향 및 그 해결 방법에 대한 숙고의 필요성에 대한 이론적 근거를 제시하고자 한다.

1.연구 동물

성장이 왕성한 시기인 생후 2개월 된 체중 250∼300g의 실험용 암컷 쥐 (Sprague-Dawley female rat) 20마리를 준 비 하였다. 이 중 10마리는 폐경 이후의 호르몬 분비 상태로 변화시키기 위해 난소절제술(ovariectomy; OVX)을 시행하 였고, 그로부터 7주가 경과된 후에 골 이식술을 시행하는데 쓰였다. 나머지 10마리는 난소절제술을 시행하지 않고 골 이 식 하였다.

쥐의 두개관 정중부에 직경 8㎜ 원형의 임계 크기 결함 (critical-sized defect; CSD) 을 인위적으로 한 개씩 형성한 후

, 쥐 20마리 모두에 MBCP

(micro- & macro- porous biphasic calcium phosphate: BIOMATLANTE) 를 이식하였다. 이렇게 하여 총 20마리의 쥐를 A, B 두 군으 로 분류하였다. 즉, 난소절제술을 시행하지 않은 정상 쥐에 MBCP

을 이식한 군을 A군으로, 난소절제술을 시행한 쥐에 MBCP

를 이식한 군을 B군으로 각각 정하였다.

2.골 이식재

두개관 골의 임계 크기 결함 부위에는 골 이식재로 MBCP

을 사용하였다. MBCP

는 수산화 인회석 (hydroxyapatite; HA) 60%와 베타-삼칼슘 인산염 (trical-

Ⅱ

original article

cium phosphate beta; β -TCP) 40%의 비율로 혼합된 이상 성 칼슘 인산염 도재 (biphasic calcium phosphate ceram- ics) 로서 직경 10㎛ 미만인 미세다공성 (microporosity)과 300∼600㎛인 거대다공성 (macroporosity)을 모두 가진 비 정형의 (non structural) 골전도성 합성골 이식재이며, 이식 후 장기간에 걸쳐 서서히 흡수되고 신생골로 대치된다. 본 연 구에서는 입자 크기가 0.5∼1.0㎜인 MBCP

를 사용하였다.

3.연구 방법

1) 난소절제술

B군 10마리의 쥐에 난소절제술을 시행하였다. 실험 쥐를 전신 마취시키기 위해서 염산 케타민 (0.4㎖/㎏: Yu-han Co., Korea)과 럼푼 (0.2㎖/㎏: Bayer Co., Korea)을 근육 내로 주입하였다. 전신 마취된 쥐의 복부 좌우 양측에 있는 두 개의 난소를 제거하기 위해 각각 약 2㎝정도의 복부 절개선을 긋고, 복강 내에서 난소를 찾아서 복강 밖으로 노출시켰다. 난 소로 주행하는 혈관을 흡수성 봉합사 (4-0 Vicryl)로 조심스 럽게 결찰하고, 결찰 부위 하방 난소 쪽 혈관을 수술용 가위로 절제, 난소를 제거해 내었다. 한 개체 당 좌우 양측 두 개의 난 소를 모두 제거하였다. 난소 제거 후 결찰된 혈관을 다시 복강 내로 재 위치시킨 후 복부 절개선은 봉합사 주변 피부층의 염 증 유발 가능성을 줄이고자 단일사 (mono-filament)로 된 나일론 (3-0 Nylon) 봉합사로 봉합해서 난소절제술을 완료 하였다. 수술 후 감염 방지를 위해서 젠타마이신 (0.05㎖/㎎:

Daesung Labs Co., Korea)을 근육 내로 주입하였다.

2) 골 이식술

난소절제술 시행 후 7주가 경과한 B군의 쥐 10마리와 난소 절제술을 시행하지 않은 A군의 생후 2개월 된 체중 250∼

300g의 실험용 암컷 쥐 10마리, 총 20마리의 쥐에 골 이식술 을 시행하였다.

먼저 난소절제술시와 같은 방법으로 쥐를 전신마취 시킨 후

두개관의 두정부 중앙 부위를 제모하였다. 지혈을 위해 2%

염산 리도카인(1:100,000 epinephrine: Yu-han Co., Korea)을 두정부에 주입하고 베타딘으로 소독 처리하였다.

절개선은 두정부 중앙에 시상축으로 약 2.5∼3㎝ 길이가 되 게 형성하였다. 골막과 피부가 찢어지지 않도록 조심스럽게 거상하여 견인하였다. 노출된 두개골의 두개관 정중부에 외 경 8㎜짜리 트레파인을 사용하여 생리식염수 주수 하에서 직 경 8㎜ 원형의 결함을 한 개 형성시켰다. 쥐의 두정부 두개관 골을 조심스럽게 핀셋을 사용해서 전층으로 제거하였다. 이 렇게 형성된 임계 결함 부위에 합성골 이식재인 MBCP

약 1.25g을 사용하여 골 이식을 시행하였다.

골 이식이 완료된 후 이식된 이식재 및 골편이 이탈되지 않 도록 주의하면서 각 층별로 골막은 흡수성 봉합사 (4-0 Vicryl)로 피부는 나일론(3-0 Nylon) 봉합사로 봉합하여 마 무리하였다. 수술 후 감염 방지를 위해 젠타마이신을 근육 내 로 주입하였다.

4.조직 형태학적 분석

골 이식 시행 4주 후 쥐를 희생시켜서 조직형태학적 분석을 실시하였다. 골 이식 부위가 손상되지 않도록 주의하면서 골 이식 부위보다 넓게 주변 자가골의 일부까지 포함시켜서 골 표본을 채취하였다(Fig. 1).

이 골 표본을 72시간동안 10% 중성 포르말린 용액에 고정

시키고 4시간 동안 질산으로 탈회 한 후, 통상적인 방법대로

파라핀에 포매시켜 약 4㎛ 두께로 시상축 방향으로 절단하여

절 편 을 얻 었 다 . 이 절 편 을 헤 마 톡 실 린 에 오 신

(Hematoxylin-Eosin; H-E)으로 염색하여 슬라이드 표본

을 만들고 광학 현미경으로 관찰하였다. 광학 현미경상의 이

미지 촬영은 올림푸스 디지털 현미경 카메라 (Olympus,

BX51)를 사용하였고, 컴퓨터 프로그램 Image Pro Plus 6.3

(Media Cybernetics, LP, Silver Spring, MD, USA)과

Office Excel 2007 (Microsoft, Seattle, WA, USA)로 조직

형태학적 분석을 시행하여, 촬영된 이미지 상에서 신생골의 면적을 측정하였다.

5.혈액 검사

난소절제술이 시행된 군에서 골다공증(osteoporosis)이 유 발되었는지를 확인하기 위하여, 쥐를 희생시키는 날에 모든 쥐를 대상으로 각 각 혈액을 약 2㎖씩 채취하여 혈중 알칼리 성 포스파타제 농도(serum ALP level)를 측정하였다.

6.통계분석

통계처리는 SPSS Ver. 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) 프로그램을 사용하였고, 분석방법은 난소 절제술을 시행한 후 MBCP

을 이식한 군과 난소 절제술을 시행하지 않고 MBCP

을 이식한 군의 신생 골 넓이 비교, 알칼리 포스파타 아제의 수치 비교를 위해 Mann-Whitney U-test를 실시 하였으며, 신생골 넓이와 알칼리 포스파타아제의 관련성을 살펴보기 위해 상관분석을 실시하여 측정값 간의 통계학적 차이를 유의수준 p<0.05에서 비교 분석하였다.

혈중 알칼리성 포스파타제 농도 측정값은 난소절제술을 시 행하지 않은 정상 쥐인 A 평균이 58.9U/L였고, 난소절제술 을 시행한 B군 평균은 78.0IU/L로 정상 쥐보다 높게 나타났 으며(Table 1)이는 통계적으로 유의하였다(p=0.005).

두개관의 골 결함 내부에 신생골의 형성은 주로 합성골 이 식재 입자 주변에서 관찰되었다. 이는 난소 절제술을 시행한 후 이식한 군에서도 관찰 되었으나 그 양이 정상 쥐에 비해 적 다는 것을 확인 할 수 있었다.

Table 2는 난소 절제술을 시행한 후 이식한 군과 난소 절제 술을 시행하지 않고 이식한 군과의 신생 골 넓이 결과를 보여 주는 것으로서 난소 절제술을 시행한 군의 평균 넓이가 난소 절제술을 시행하지 않은 군에 비해 적은 것을 확인 할 수 있으 며, 이러한 차이는 통계적으로 유의한 수준의 것으로 나타났 다(p=0.000). 따라서 난소 절제술을 시행한 후 MBCP

을 이 식한 군의 신생골 넓이가 난소 절제술을 시행하지 않고 MBCP

을 이식한 군에 비해 적다는 것을 알 수 있다.

Table 3은 혈중 알칼리 포스파타아제 농도와 신생골 넓이 의 관련성에 대해 상관 분석을 실시한 결과 알칼라인 포스파 타아제 수치가 낮을수록 신생골의 넓이가 큰 상관관계가 있 음을 보여주고 있으며 이는 통계적으로 유의하였다.

Ⅲ

original article

Table 1. ALP 수치 결과

G

GR RO OU UP P A A((n n= =110 0)) G GR RO OU UP P B B((n n= =110 0))

p

p- -v va allu ue e **

평

평균 균 ± ± 표 표준 준편 편차 차 평 평균 균 ± ± 표 표준 준편 편차 차

ALP 농도(IU/L) 58.9±6.7404 78.0±12.8409 0.005

* 통계학적 유의성 평가는 Mann -Whitney U 검증법을 사용함

Won Hee Kim et al: The effect of MBCP

bone regeneration in osteoporosis induced rats. Implantology 2010

Table 2. 형성된 신생골 면적 결과(㎛

) G

GR RO OU UP P A A((n n= =110 0)) G GR RO OU UP P B B((n n= =110 0))

p

p- -v va allu ue e **

평

평균 균 ± ± 표 표준 준편 편차 차 평 평균 균 ± ± 표 표준 준편 편차 차

신생골 면적(㎛

) 49335.85±20739.4 13824.49±8298.45 0.000

* 통계학적 유의성 평가는 Mann -Whitney U 검증법을 사용함.

Won Hee Kim et al: The effect of MBCP

bone regeneration in osteoporosis induced rats. Implantology 2010

Fig. 2. Microscopic view A; Calcified area of new bone around outlines of synthetic alloplas- tic substitute particles in osteoporosis induced rats at 100x magnification. (red dyeing area) B;

Osteoporosis induced rats at 200x magnification. C; Normal rats at 200x magnification. D;

Normal rats at 400x magnification.

Won Hee Kim et al: The effect of MBCP

bone regeneration in osteoporosis induced rats. Implantology 2010

A B

C D

이전 연구에 따르면 골다공증이 치조골에 미치는 영향은 두 가지 방법이 있다

. 하나는 골의 무기성분 감소이며, 다른 하 나는 치조제의 골부피 감소이다. 이러한 변화는 다른 임상연 구에서도 뒷받침 되었다. 하지만 골변화는 전신적인 요인 뿐 아니라 잔존 치아의 유무

나 이식된 골과 임프란트의 재료 등 국소적인 요인에도 영향을 받기 때문에 치조골과 다른 골 (장골이나 척추 등)과는 다르다는 연구도 있다

.

Ö zgür Erdog

an 등은 논문 리뷰에서 골다공증이 골이식편 의 흡수, 비유착, 치유시간 지연 등과 관련이 있을 수 있다고 하였으며, 그럼에도 임프란트 식립 및 골이식의 비적응증은 아니라고 하였다

.

ALP는 조골세포의 분화 초기 단계에 나타나는 생물학적 지표이다. 골다공증시 골교체가 증가하게 되면 선행하는 골 흡수와 뒤따르는 골의 재형성이 모두 증가하게 되는데, 이 중 골의 재형성 증가 과정에서 조골세포의 초기 활성도 증가가 그 지표인 ALP의 활성도 증가로 나타나게 되는 것이다. 한 편, 골다공증시 골교체 및 골 활성도는 증가하지만 점점 골량 이나 골질이 저하되는 이유는 전체적으로 볼 때 골흡수가 골 의 재형성보다 훨씬 더 많이 일어나기 때문이다. 이 ALP의 혈중 농도 측정은 손쉬운 혈액검사를 통해 조골세포의 활성 도 및 골교체의 활성화를 알아 볼 수 있어서, 간단하게 골다공 증성 변화를 확인해 보거나 초기 골다공증을 의심해 볼 수 있 는 방법이다

. 본 연구에서도 골 이식을 하는 시점에서 골다

나 자가면역 질환 유발 가능성이 없는 장점을 가지고 있다.

이 중 수산화 인회석과 삼탄산 칼슘염은 이미 여러 실험을 통해 골 이식시 그 유용성이 입증되어 있다. HA와 β -TCP는 둘 다 생체 적합성을 띄고 골전도능이 우수하다. β -TCP가 함 유된 흡수성 이식재는 골 형성에 유리한 환경을 제공하며, 신 생골 전도가 우수하여 이를 사용한 이식 부위에서 이식재가 신생골로 빠르게 재구성됨을 보인 최근 연구도 있었다.

그러나, 한편으로 β -TCP는 biologic fluids나 다른 용액에 예측 불허로 흡수되는 단점이 있고

HA particles은 신생골 형성에 좋은 bone filler이긴 하지만 매우 낮은 흡수율을 보이 고 있다.

이 문제를 해결하고자 hydroxy apatite와 β -TCP를 혼합 한 biphasic calcium phosphate (BCP)가 개발 되었다. 이는 재료의 흡수력을 조정하면서 골 전도 특성을 그대로 유지할 수 있는 혼합물이다. 기존 연구들에 의하면 HA 60%와 β - TCP 40%의 혼합 비율이 골 전도 표면을 형성하는 가장 이상 적인 비율로 밝혀져 있다. 본 연구에서 사용한 MBCP

은 HA와 β -TCP를 6:4의 비율로 혼합한 것이며 20~30%의 미 세공(microporosity)과 70~80%의 다공성(macroporosity) 구조를 가지고 있다. Bohner 등의 연구에 의하면, 흡수성 이 식재를 이식한 후 관찰 했을 때, 이식재의 흡수 속도와 신생골 형성 속도가 비슷하여 이식부위의 안정화에 매우 중요하다고 하였다

. 이런 점에 있어서 본 연구에서도 골 이식재로 MBCP

를 사용하였다.

한편 이전의 연구

에서 골이식 4주 후 woven bone의 형 성을 기대할 수 있고 그 후 8주경에 lamellar bone과 mar- row를 볼 수 있다고 하였다. 따라서 본 연구에서는 골다공증 이 초기 신생골 생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 골이식 4주 후의 시편을 얻어 관찰하였다. 하지만 골다공증이 신생골 형성에 미치는 영향에 관한 좀 더 구체적인 근거를 위해선 골

Ⅳ

* 상관계수는 0.05 수준에서 통계학적으로 유의함

Won Hee Kim et al: The effect of MBCP

bone regeneration in osteoporosis induced

rats. Implantology 2010

original article

이식 후 2주, 8주 후의 골형성량에 관한 추가적인 연구도 필 요할 것으로 사료된다.

그리고 더 나아가서 본 연구와 동일한 조건에서 다른 종류 의 골이식제를 사용했을 때도 이번 연구와 유사한 결과가 나 오는지에 관한 추가적인 비교 연구도 골다공증과 골형성능력 과의 연관성을 규명하는데 중요한 근거될 것으로 사료된다.

정상 쥐 10마리와 난소절제술이 시행된 골다공증 유발 쥐 10마리에 골전도성 합성골 이식재 (MBCP

)을 사용하여 골 이식을 실시한 본 연구에서는 두개관 골의 8mm 임계 크기 결함 내부에 새로 침착된 신생골의 면적을 측정 비교한 결과 정상 쥐에 비해 난소절제술을 시행한 쥐에서 유의한 차이를 보일 정도로 골 생성량이 적음을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 골다공증이 유발되면 골이식후 초기의 골형성능 력이 감소하므로 골다공증은 골이식시 분명히 고려되어야 할 전신질환이라는 사실을 알 수 있다.

1. Özgür Erdog

an DDS, David M. Shafer DMD, Pamela Taxel MA, MDand Martin A. Freilich DDS’A Review of the association between osteoporosis and alveolar ridge augmentation. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2007 Dec;104(6):738.e1-13. Epub 2007 Jul 26.

2. Eddy DM, Johnston CC, Cummings SR, Dawson-Hughes B, Lindsay R, Melton LJ, Slemenda CW. Osteoporosis: Review of the evidence for prevention, diagnosis, treatment and cost-effectiveness analysis. Status report. Osteoporos Int 1998;4:1-80.

3. Nilas L, Christiansen C. The pathophysiology of peri and post- menopausal bone loss. Br J Obstet Gynaecol 1989;96:580-7.

4. Bae CS. Osteoporotic changes after ovariectomy in rats. Korean J Vent Clin Med 2000;17:212.

5. von Wowern N, Klausen B, Kollerup G. Osteoporosis: A risk factor in periodontal disease. J Periodontol 1994;65:1134-8.

6. Hohlweg-Majert B, Schmelzeisen R, Pfeiffer BM, Schneider E.

Significance of osteoporosis in craniomaxillofacial surgery: A review of the literature. Osteoporos Int 2006;17(2):167-79.

7. White SC. Oral radiographic predictors of osteoporosis.

Dentomaxillofac Radiol 2002;31(2):84-92.

8. Kribbs PJ. Comparison of mandibular bone in normal and osteoporotic women. J Prosthet Dent 1990;63:218-22.

9. Acarturk TO, Hollinger JO. Commercially available demineralized bone matrix compositions to regenerate calvarial critical-sized bone defects. Plast Reconstr Surg 2006 Sep 15;118(4):862-73.

10. Schmitz JP, Hollinger JO. The critical size defect as an experimental model for craniomandibular nonunion. Clin Orthop Relat Res 1986;205:299-308.

11. E.S. Elsubeihi, M.D. Grynpas, A.M. Cheung, G.A. Zarb and J.N.M.

Heerche, The effect of ovariectomy on bone loss in the edentulous mandible and dentate mandible, Bone 28 (5) 2001;217.

12. Shui C, Scutt A. Mild heat shock induces proliferation alkaline phos- phatase activity and mineralization in human bone marrow stromal cells and Mg-63 cells in vivo. J Bone Miner Res 2001;16:731-41.

13. R. Z. LeGeros E. Nery and K. Lynch Kerebel Transformation of bipha- sic calcium phosphate ceramics in vivo: Ultrastructural and physico- chemical characterization Journal of Biomedical Materials Research, 1989;Vol. 23, 883-894.

14. R. Z.legeros, S. Lin, R. Rohanieadeh, D. mijares, J.P legeros. Biphasic calcium phosphate bioceramics: preparation, properties, and application Journal of materials science: materials in medicine 14 2003;201-209.

15. Bohner M, Gbureck U. & Barralet J. E. Technological issues for the development of more efficient calcium phosphate bone cements: a criti- cal assessment. Biomaterials 2005;26:6423-6429.

16. Tahsin O.A.,Jeffery O.H. Commercially available demineralixed bone matrix compositions to regenerate calvarial critical-sixed bone defect.

Plast. Reconstr. Surg.2006 Sep 15;118(4):862-73.

Ⅴ

교신저자: 류재준

주소: 경기도 안산시 단원구 고잔동 516 고려대학교 안산병원 치과

Tel: 031-412-5370 Fax: 031-485-5373 e-mail: [email protected]

원고접수일: 2009. 11. 23

1차수정일: 2010. 2. 4