임상약동학특론#6
형광 검출을 통한 동시 측정을 위한 생물학적 분석법에 의한 레파글리니드와 셀레콕시브 간의
대사 약물 상호 작용의 약동학적 평가
참고문헌: Pharmaceutics 2019, 11, 382;
doi:10.3390/pharmaceutics11080382
부산대학교 약학대학 생물약제학 및 약동학 연구실 윤인수 교수
레파글리니드
세레콕시브
• 메글리티나이드(meglitinide)계열 제2형 당뇨병 치료제
• 주요 소실 경로: CYP2C8 및 CYP3A4에 의한 대사
• BCS class II 약물: 생체막 투과도는 양호하나 용해도가 낮음.
• COX-2 선택적 비스테로이드 항염증제
•주요 소실 경로: CYP3A4 및 CYP2C9에 의한 대사
• 류머티즘 관절염이나 염증을 치료하는데 이용
연구배경 및 이론
S H2N
O O
N
N CF3 Me
• 관절염과 당뇨병은 전 세계적으로 총 3 억 5 천만 명이 넘는 환자들에게 널리 퍼진 질병임
• 관절염과 당뇨병의 가장 흔한 유형은 각각 골관절염 (OA)과 제 2형 당뇨병 (T2DM)이 있음
• 최근 조사에 따르면 OA의 유병률은 T2DM이 없는 사람보다 T2DM이 있는 사람에서 더 높음
• 본 연구에서는 민감하고 간단한 HPLC-FL 방법이 개발되었고 Rat의 혈장에서 REP와 CEL의 동시 정량 할 수 있는 분석법을 개발함
• 이 HPLC-FL 방법의 선형성, 감도, 정밀도, 정확성, 회복, 매트릭스 효과 및 안정성을 결정하였다.
다음으로, REP와 CEL 사이의 약동학 약물 상호 작용에 대한 가능성을 Sprague-Dawley 쥐를 사용 하여 생체 내에서, 및 Rat liver microsome 및 Human liver microsome을 사용하여 생체 외에서 조사 하였음
N NH
O
OEt OH O
S H2N
OO
N N CF3 Me
HPLC 형광분석법 개발
레파글리니드-셀렉콕시브
형광 동시분석법 개발 시험관 내 약물상호작용 평가
단백결합 시험
랫트를 이용한 생체 내 약물상호작용 평가
약물 경구투여 랫트 캐뉼레이션
혈장
혈구
채혈 원심분리
생체시료 제단백 원심분리
상등액 채취 건조
재구축 샘플 제조
샘플 준비 과정 약동학적 약물-약물 간 상호작용
Biological
Sample PB
S
약물 단백질-약물
결합 혈태
마이크로좀간
실험의 개요도
교정 표준 및 품질 관리 샘플
1. REP, CEL 및 IS (DMSO 중 1000 ㎍ / mL)의 스톡 용액을 제조
2. REP 및 CEL 혼합물의 스톡 용액을 이동상으로 희석하여 1 - 200 ㎍/mL 범 위의 표준 용액을 제조
3. IS의 스톡 용액을 ACN으로 희석하여 IS (최종 농도 5 ㎍ / mL의 ACN)의 작 업 용액을 제조하였고, 교정 표준 샘플은 각 작업 용액으로 블랭크 랫트 혈장 을 스파이킹하여 최종 혈장 농도 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 및 2000 ng / mL을 제조
4. 품질 관리 (QC) 샘플은 교정 표준 준비와 동일한 방식으로 REP 및 CEL의 별 도 스톡에서 준비
5. QC 샘플의 농도 수준은 10 (낮은 정량 한계; LLOQ), 30 (낮은; LQC), 120 (중 간; MQC) 및 1200 ng/mL (높은; HQC)
샘플 전처리
1. 제단백을 위해, IS (50 ng/mL)를 함유하는 400 μL 냉장된 ACN을 120 μL 혈장 샘 플에 첨가
2. 생성 된 혼합물을 5 분 동안 볼텍스 혼합 한 후, 5 분 동안 15,000 x g에서 원심 분 리
3. 400 μL의 상청액을 다른 마이크로 튜브로 옮기고 N2 기류에 의해 건조
4. 재구성을 위해, 생성된 잔류물에 60 μL 이동상을 첨가하고, 충분한 소용돌이 혼합 후, 20 μL 최종적으로 제조 된 샘플 용액을 HPLC 시스템에 주입
HPLC 조건
1. 본 연구에서는 형광 검출기 (RF-20A), 컬럼 오븐 (CTO-20A), 오토 샘플러 (SIL- 20AC) 및 펌프 (LC-20AT)가 장착 된 Shimadzu HPLC 시스템 (일본 교토,
Shimadzu Co., Japan)을 사용
2. 40 ℃에서 K18 가드 컬럼 (SecurityGuard HPLC 카트리지 시스템; Phenomenex) 과 Kinetex C18 컬럼 (250 × 4.6 mm, 5 µm, 100 Å; Phenomenex, 미국 캘리포니 아주 토런스)가 크로마토그래피 분리에 사용
3. 10mM 인산염 완충액 (pH 6.0) 및 ACN (53.6 : 46.4, v / v)으로 구성된 이동상의 등 용 매 용출은 1mL / min의 유속으로 수행
4. 주입량과 총 작동 시간은 각각 20 μL와 23 분
5. REP, CEL 및 IS에 대한 형광 및 방출 파장은 각각 240 및 380 nm
밸리데이션 검정
1. REP와 CEL의 동시 측정을 위한 이 새로운 생체 분석 방법은 US-FDA 지침에 따라 검증
2. 블랭크 랫트 혈장에서 REP, CEL 및 IS의 크로마토그램 간의 비교에 기초하여 선택성을 평가
3. 분석물의 크로마토그램에서 내인성 간섭을 조사하였으며, 선형도는 블랭크 생 물학적 매트릭스에 REP 및 CEL의 양을 증가시켜 결정
4. 혈장에서 REP 및 CEL (10-2000 ng/mL) 대 IS (50 ng/mL)의 농도 비율에 대 한 분석물 대 IS (y- 축)의 피크 면적 비율을 플로팅하여 보정 곡선 (n = 5)을 구 성
5. 보정 곡선에서 REP 및 CEL의 정량화 가능한 최저 농도 수준으로 정의 된 LLOQ를 기준으로 감도를 평가
6. LLOQ 수준의 REP 및 CEL 피크는 식별 가능하고 재현 가능해야함
랫트에서의 생체 내 약동학 평가
1. 약동학 실험 전에 랫트를 12 시간 동안 절식시킨 다음, 졸레틸 (근육 내, 20 mg/kg) 로 마취
2. 랫트의 대퇴 동맥 및 정맥을 약물 투여 전 240 분에 폴리에틸렌 튜브로 캐뉼
3. 동일한 용량의 REP 단독 (0.4 mg / kg), CEL 단독 (2 mg / kg), 또는 REP 및 CEL 의 단일 경구 용량을 랫트에 투여 (그룹당 n = 5)
4. 약물은 DMSO, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜 400 및 식염수의 1 : 5 : 30 : 64 (v / v / v / v)의 비율로 투명한 혼합물인 비히클에 용해
5. 경구 투여 후 0, 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360 및 480 분에 대퇴 동맥을 통해 헤파린 전처리된 원심분리 튜브에 약 300 ㎕의 혈액 분취량을 수집
6. 10 분 동안 4 ℃에서 2000 x g에서 혈액 샘플을 원심 분리 한 후, 120 μL의 혈장 분 취 량을 HPLC 분석까지 -80 ℃에서 저장
시험관 내 약물대사 측정
1. REP와 CEL 사이의 대사 상호 작용 가능성을 평가하기 위해, 마이크로좀 반응 혼 합물을 다음과 같이 제조: (총 부피 : 0.2 mL) : RLM 또는 HLM (0.5 mg/mL), 50 mM 인산염 완충액, 1 mM NADPH, 10 mM MgCl2, 1 μM 기질 및 다양한 농도의 억제제 (1–100 μM).
2. CEL의 제외 또는 존재 (억제제)에서 REP (기질)의 소실률이 결정
3. 대사 반응을 시작한 후 0 및 15 분 (REP) 또는 0 및 45 분 (CEL)에서, 50 μL 분액 의 마이크로좀 혼합물을 채취하여 IS (50 ng/mL)를 함유하는 100 μL의 냉장된 ACN을 함유하는 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮김
4. 대사 반응을 중지시키고, 15,000 x g에서 10 분 동안 혼합 및 원심 분리 후, HPLC 분석까지 상청액의 100 μL 분취액을 -80 ℃에 보관
시험관 내 단백결합율 측정
1. 랫트 및 인간 혈장에서 결합되지 않은 REP 및 CEL (fu)의 분율은 투석 (RED) 장 치 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 측정
2. 혈장은 REP 단독, CEL 단독 및 두 약물로 스파이킹되어 최종 농도는 10 μM
3. 0.2mL의 혈장을 '샘플'챔버에 넣고, 0.35mL 인산 완충 식염수를 인접한 '버퍼'
챔버에 주입
4. 비결합 비율은 '버퍼' 구획의 약물 농도와 '샘플' 구획의 약물 농도의 비율 로 계산
데이터 처리
1. REP의 대사 억제를 위한 CEL의 IC50은 다음 힐 방정식에 따라 GraphPad Prism5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA)에 의해 결정
2. LC 데이터를 이용하여 분석 데이터를 수집하고 처리
3. 비-구획 분석은 혈장 농도 하의 시간 영역에서 시간 제로에서 무한대까지의 시 간 곡선 (AUCinf), 혈장 농도 하의 총 면적 대 시간 제로에서 마지막 샘플링 시 간 (AUClast), 및 말단 반감기와 같은 약동학 파라미터를 추정하기 위해 수행 4. WinNonlin 소프트웨어의 NCA200 및 201 모델 (버전 3.1; 미국 뉴저지 주 프린
스턴 소재 CertaraUSA Inc.)을 사용한 반감기 (t1 / 2), 피크 혈장 농도 (Cmax), 및 Cmax (Tmax)에 도달하는 시간은 관찰된 데이터로부터 직접 판독
Y= Min + Max − Min 1+( xIC50)−P
공 칭 농 도 (ng/mL)
정밀도 (%) 정확도(%)
시험 내 시험 간 시험 내 시험 간
레파글리니드
LLOQ (10) 2.69 6.21 112 101
LQC (30) 1.20 3.99 104 99.4
MQC (120) 1.16 0.70 102 101
HQC (1200) 0.79 1.43 99.2 99.8
세레콕시브
LLOQ (10) 4.06 8.30 111 103
LQC (30) 0.79 2.15 104 103
MQC (120) 1.19 2.18 100 102
HQC (1200) 1.55 1.63 98.6 100
밸리데이션 검정
(선택성, 직선성, 민감성, 정밀성, 정확성)
• 개발된 분석법은 분석물의 체류 시간에서 발생하는 내인성물질의 간섭 없이 허용 가능한 선택성을 제공
• Repaglinide 및 Celecoxib에 대한 검량선은 Rat 혈장 샘플에서 10 - 2000 ng/mL에서 선형인 것으로 관찰
• 본 연구에서 두 약물에 대해 최저 정량한계는 10 ng/mL로 결정
• 정밀도는 8.30 % 이하인 것으로 추정되었고 정확도는 98.6 %
• 112 %까지 이러한 값은 일반적으로 허용 가능한 범위 내에 있으며, 본 방법이 정확하고 정확하며 재현 가능하 다는 것을 보임
y = 2.0936x - 0.8791 R² = 1
0 1000 2000 3000 4000 5000
0.0 1000.0 2000.0 3000.0 y = 1.0192x - 3.5741
R² = 1
0 500 1000 1500 2000 2500
0.0 1000.0 2000.0 3000.0 REP
CEL
밸리데이션 검정 (회수율, 생체시료 내 효과)
공칭 농도 (ng/mL) 회수율 (%) 생체시료효과 (%)
레파글리니드
LLOQ (10) 98.5 ± 5.3 101 ± 6
LQC (30) 98.6 ± 1.1 102 ± 4
MQC (120) 103 ± 2 95.6 ± 3.0
HQC (1200) 101 ± 1 92.1 ± 2.5
세레콕시브
LLOQ (10) 104 ± 3 97.6 ± 3.0
LQC (30) 102 ± 4 98.5 ± 3.5
MQC (120) 104 ± 2 93.8 ± 1.8
HQC (1200) 103 ± 2 90.7 ± 2.4
내부표준물질 (케토코나졸, 50) 96.7 ± 1.2 99.4 ± 1.3
생체시료 제단백 원심분리
상등액 채취 재구축 샘플 제조 건조
다음과 같은 방법으로 진행
• 4 가지의 다른 QC 샘플농도와 50 ng/mL에서 내부표준물질에 대한 회수율 및 매트릭스 효과를 평가
• 두 약물의 평균 회수율은 CV 값이 ≤ 2.57 %, 범위는 98.5 - 104 %인 것으로 관찰
• 4 가지의 다른 QC 샘플농도 간에 회수율에 유의한 차이가 없었으며, 이는 두 약물의 농도에 따라 독립적인 회 수율을 나타냄
• 두 약물의 평균 매트릭스 효과는 ≤5.25 %의 CV 값에서 92.1-102 % 인 것으로 관찰
• 개발된 약물 분석 방법에 사용된 샘플 전처리는 최소한의 매트릭스 효과로 충분한 추출 회수율을 나타냄
공칭 농도(ng/mL) 실온 보관a 오토샘플러 내b 냉-해동 반복c 장기간 보관d Repaglinide
LLOQ (10) 102 ± 6 106 ± 3 106 ± 6. 96.4 ± 3.4 LQC (30) 92.7 ± 4.2 102 ± 4 98.1 ± 3.7 97.6 ± 3.7 MQC (120) 92.9 ± 1.4 104 ± 0 102 ± 2 95.1 ± 1.8 HQC (1200) 90.6 ± 0.7 101 ± 1 100 ± 1 93.3 ± 0.8 Celecoxib
LLOQ (10) 98.3 ± 2.4 95.2 ± 2.6 90.3 ± 2.4 92.7 ± 3.0 LQC (30) 89.2 ± 2.7 97.8 ± 1.8 97.9 ± 2.1 92.7 ± 3.5 MQC (120) 93.1 ± 2.2 103 ± 1 101 ± 2 92.9 ± 1.2 HQC (1200) 89.6 ± 1.9 101 ± 1 99.6 ± 0.4 91.7 ± 0.7
A: 실온에서 3시간 보관
B: 10 ℃에서 24시간 동안 오토샘플러에 보관 C: 3회 냉-해동 반복 진행
D: -20 ℃에서 30일 동안 보관
실험방법 및 결과
• 생체시료를 다양한 취급 및 저장 조건 하에서 안정성을 평가
• 두 약물의 농도 범위는 표 3에 표시된 것처럼 CV 값이 ≤6.04 %, 범위는 89.2–106 % 인 것으로 관찰
• 두 약물 모두 안정성을 띄고 있다는 것을 확인
밸리데이션 검정 (안정성)
랫트에서의 생체 내 약동학 평가
레파글리니드 세레콕시브
파라미터 단독투여 복합투여 단독투여 복합투여
AUClast(×103ng∙min/mL) 21.1 ± 5.1 25.9 ± 2.8 189 ± 70 333 ± 89*
AUCinf(×103ng∙min/mL) 30.5 ± 5.5 35.4 ± 8.3 ND ND
Cmax(ng/mL) 297 ± 103 224 ± 102 741 ± 299 954 ± 196
Tmax(min) 20 (20–45) 45 (20–60) 180 (30–240) 120 (45–360)
t1/2(min) 374 ± 45 290 ± 123 ND ND
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0 100 200 300 400
REP REP+CEL
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
0 100 200 300 400
CEL CEL+REP
랫트에서의 생체 내 약동학 평가
• Rat에 Repaglinide (0.4 mg/kg) 및 Celecoxib (2 mg/kg)를 단독으로 또는 조합하여 경구투여
• Repaglinide의 경구 투약 후, 혈장 농도 수준은 20-45 분 동안 증가한 후 다중 지수 방 식으로 감소
• Repaglinide의 AUClast, AUCinf 및 t1/2는 Celecoxib와의 동시 투여에 의해 크게 변 화되지 않음
• Celecoxib의 경구 투여 후, 혈장 농도 프로파일은 현저하게 변동
• Celecoxib의 혈장 농도 프로파일에서 다중 피크는 느리고 가변적인 위장 흡수에 의해 야기 될 수 있으며특히, Celecoxib 단독 투여 후보다 복합 투여 후 혈중농도가 현저하 게 더 높았음
• Celecoxib는 주로 광범위한 대사에 의해 제거되기 때문에 경구 CEL의 증가된 전신 노 출은 Repaglinide의 동시 투여에 의해 야기된 Celecoxib의 간 1차 통과 또는 전신 대 사의 감소에 기인할 수 있음
시험관 내 약물대사 및 단백결합율 측정
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Rat Plasma Human Plasma REP REP+CEL
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Rat Plasma Human Plasma CEL CEL+REP
50 60 70 80 90 100 110
1 10 100
50 60 70 80 90 100 110 120
1 10 100
시험관 내 약물대사 및 단백결합율 측정
• Rat liver microsome 및 Human liver microsome에서의 대사 연구에서 보면 Celecoxib의 대사는 Rat liver microsome에서 16.1 μM, Human liver micro some 에서 14.4 μM의 IC50 평균값이 각각 산출
• 경구 투여 후 Rat 간에서의 생체 내 농도 수준의 Repaglinide가 Celecoxib의 대사를 억제하기에 충분히 높다고 가정 할 때, 동시 투여에 의한 Celecoxib의 경구 전신 노출 의 증가는 Repaglinide의 억제 활성에 의해 야기되는 Celecoxib의 간 1차 통과 효과 나 간 전신 클리어런스 감소에 기인할 수 있음
• 현재 쥐를 이용한 전 임상시험에서 Celecoxib과 Repaglinide 간의 대사 기반 상호 작 용 가능성을 강조함
• 그 림 에 나 타 나 듯 이 , Repaglinide 는 Rat liver microsome 과 Human liver microsome 사이의 유사한 IC50 값으로 Celecoxib의 대사 반응을 유의하게 억제
결론
• 본 연구는 Rat 혈장에서 Repaglinide와 Celecoxib의 동시 측정을 위한 단순하고 민감 하며 검증된 HPLC-형광분석기를 이용한 방법을 성공적으로 개발
• 새로운 생체시료 내 약물 분석법은 우수한 감도, 높은 추출 회수율, 적은 매트릭스 효 과, 시료 준비 절차의 단순성을 포함하여 몇 가지 장점을 제공
• Repaglinide와 Celecoxib 사이의 약동학적 상호 작용 연구에서 이 방법의 적용은 Celecoxib의 약동학적 파라미터가 Repaglinide와의 복합 투여에 의해 유의하게 변경 되었음을 나타냄
• Human liver microsome 및 Human 혈장을 사용한 시험 관내 대사 및 단백결합 연구 는 임상 환경에서 Celecoxib와 Repaglinide 사이의 대사-기반 상호 작용의 가능성을 강조
• 본 연구에 제안 된 생체 분석 방법은 전임상 약동학 연구를 위한 유망한 방법이 될 수 있고, 또한 부분적으로 변형 및 검증 후 임상 용도로 사용가능