8 서 론
분자의학적 암치료(molecular targeted therapy)의 궁극적 인 목표는 특정한 암 환자에게서 나타나는 유전적 또는
생물학적인 이상 소견을 찾아내어 이러한 소견을 바탕으 로 개개인 환자들에게 가장 적합한 치료법을 적용하는 것 이다. 분자의학적 암치료는 기존의 항암 요법과는 달리 특정한 물질이나 신호전달체계를 선택적으로 차단하여 암의 성장을 억제하거나 암세포의 아포토시스를 유발한 다. 최근 수년간 이 분야는 괄목할 만한 발전을 이룩하여 많은 약제들이 개발되어 임상시험 과정을 거치고 있으며 Tratzuzumab, Glivec (STI-571) 등을 비롯한 몇몇 약제들은 임상적인 효능이 이미 입증된 바 있다.
단백질의 합성은 인체 대사 과정의 가장 기본적인 부분 이며 여러 유전자의 발현을 조절하는 가장 중요한 과정이 기도 하다. 최근 세포의 성장과 분열에 중요한 역할을 하 는 물질들이 단백질의 번역 과정(translational level)에서 조 절되고 있음이 밝혀졌고, 이에 따라 단백질의 번역과정에 관여하는 물질들과 경로(pathway)가 암 치료의 새로운 표 적으로 떠오르고 있다. 본 논문에서 저자는 단백질 합성 과정과 암과의 관계에 대한 최근 연구결과들을 간단히 살 펴보고 유방암에서 mTOR 신호전달체계를 표적으로 한 새로운 치료법에 관한 전임상 연구 결과를 간단히 소개하 고자 한다.
본 론 1) 단백질의 합성 과정
mRNA로부터 단백질이 생성되는 과정을 번역(transla- tion)이라 부른다. 단백질의 번역은 크게 시작(initiation), 연장(elongation), 종결(termination)의 3단계로 나눌 수 있으 며 이 중 시작 과정이 단백질의 합성을 조절하는 가장 중 요한 단계가 된다. 단백질 번역의 시작이 일어나기 위해 서는 우선 ribosome, mRNA template, aminiacetyl tRNA 가 서로 적합한 조합으로 복합체를 형성해야 한다. 가장 먼 저 eIF2가 methyl-tRNA 및 GTP와 결합하여 eIF2.GTP.
Met-tRNA의 복합체(tertiary complex)를 만든 후 40S ribo- somal subunit와 결합한다. 이렇게 결합된 물질을 43S pre- initiation complex라 부르며, 이 복합체가 mRNA의 5' termi nal 부위에 부착하여 80S initiation complex를 형성하게 되 는데 이 과정에서 eIF4E가 관여하게 된다. 성숙된 mRNA 의 5' terminal에는 m7GpppN (7-methyl-guanosine-triphospho-
단백질 번역과정의 조절: 유방암 치료의 새로운 표적
원자력의학원 외과
노 우 철․백 남 선
Translational Regulation: A Novel Target for Breast Cancer Therapy
Woo Chul Noh, M.D., Ph.D. and Nam Sun Paik, M.D., Ph.D.
Department of Surgery, Korea Cancer Center Hospital, Seoul, Korea
Translational initiation is regulated in response to nutrient availabilty and growth stimuli and is coupled with cell cycle progression and cell growth. There is now growing body of evidence which suggests links between translational regula- tion and the disruption of cell behavior that results in the development and progression of cancer. mRNA translation can be overactivated in breast cancer through eIF4E over- expression or abnormal activation of signal transduction pathways. Among them, rapamycin-sensitive signal transduc- tion pathway (mTOR signaling pathway) is now being studied as a novel target for cancer therapy. In this article, the basic principles of translational control, the alterations encountered in cancer and selected therapy targeting mTOR signaling pathway are reviewed and the preclinical study regarding the determinants of rapamycin sensitivity in breast cancer is presented in order to help elucidate new avenues for breast cancer therapy. (Journal of Korean Breast Cancer Soci- ety 2003;6:8-14)
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Breast cancer
중심 단어: 단백질의 번역, mTOR 신호전달체계, 유 방암
책임저자：노우철, 서울시 노원구 공릉동 215-4 ꂕ 139-706, 원자력의학원 외과 Tel: 02-970-1221, Fax: 02-972-3093 E-mail: nohwoo@kcch.re.kr
접수일：2003년 3월 2일, 게재승인일：2003년 3월 7일
5'-ribonucleotide)의 구조를 갖고 있는 5' cap이 씌워지게 되는데 eIF4E는 eIF4A 및 eIF4G와 결합하여 eIF4F 복합 체를 형성하게 되고, eIF4F 복합체는 43S preinitiation com- plex가 mRNA의 5' cap에 결합하여 번역의 시작 codon인 AUG codon을 만날 때까지 5'에서 3'방향으로 mRNA를 검 색(scan)할 수 있게 해 준다. 이렇게 된 후 initiation factor 는 떨어져 나가고 60S ribosomal subunit가 다시 부착하여 80S initiation complex를 형성한 후 단백질의 번역은 시작 된다(Fig. 1).(1,2)
일단 80S initiation complex가 만들어지면 연장 단계에 들어가게 되고 종결 codon을 만날 때까지 단백질의 합성 은 계속되게 된다. 대부분의 진핵생물(eukaryotes)은 이와 같은 과정을 통해 단백질을 합성하게 되는데 이와 같은 과정을 cap 의존성 번역(cap-dependent translation) 이라 부 른다.
2) 단백질 번역과정의 조절
단백질 번역의 시작 과정은 여러 인자들의 발현 정도나 인산화 상태(phosphorylation status)에 따라 조절을 받게 된 다. 그중 가장 중요한 인자들은 다음과 같다.
(1) eIF4E: eIF4A, eIF4G와 함께 eIF4F 복합체를 형성하 는 eIF4E는 initiation factor 중에서 가장 적은 양으로 존재
하며 단백질 합성의 시작을 조절하는 데 가장 중요한 역 할을 하는 물질(rate-limiting component)로 알려져 있다. 일 반적으로 길고 복잡한 2차 구조의 5' UTR (5' untranslated region)을 갖고 있는 mRNA나 5' terminal 위치에 oligo- pyrimidine 구조를 갖고 있는(5'-TOP) mRNA는 정상적인 상황에서 eIF4E와의 결합이 약해 단백질의 번역의 효율이 낮으며 이와 같은 mRNA를 약한 mRNA (weak mRNA)라 부른다. 그러나 어떠한 이유로 eIF4E가 증가하게 되면 이 런 약한 mRNA의 번역의 효율이 상대적으로 증가하게 된 다. 흥미 있는 것은 이와 같은 약한 mRNA가 만드는 단백 질 중에는 세포의 성장과 분열에 매우 중요한 역할을 하 는 물질들이 많이 포함되어 있다는 사실이며, 따라서 eIF4E의 증가는 세포의 비정상적인 분열 및 성장과 관계 가 밀접한 관계가 있을 것이라 예측할 수 있다. Fig. 2는 eIF4E의 양의 변화에 따른 약한 mRNA 및 다른 강한 Fig. 1. Translation initiation in eukaryotes. Initiation factor eIF2
binds GTP and Met-tRNA to form a tertiary complex.
This is then able to bind to 40S ribosomal subunits to produce the 43S initiation complex. mRNA binding to this complex requires the participation of members of the eIF4 family of factors. Joining of the 60S subunit results in the formation of the 80S initiation complex which is then competent for protein synthesis.
[eIF2-GTP]
[eIF2-GTP-Met-tRNA ]r
43S preinitiation complex
[43S-mRNA] complex
80S-initiation complex
PROTEIN SYNTHESIS Met-tRNAr
43S 40S 80S
60S eIF1AeIF3
IA40S3 2
mRNAeIF4E eIF4G eIF4A eIF4B IA40S3 2
m GTP7 AUG IIAn
60S subunit
eIF5 eIF3
[eIF2-GDP]
m GTP7 40SAUG IIAn
60S
eIF2B GDP
GTP
Fig. 2. mRNA competition for translation initiation. The product of weak mRNAs become selectively increased with higher eIF4E, and can become a substantial fraction of the total spectrum of protein synthesis.
100
Relative translational efficieny (%)
[eIF-4E]
50
Strong mRNA
Weak mRNA
Growth arrest Normal growth Transformation Apoptosis/genetic instability
Table 1. List of mRNAs that are known to be translationally re- pressed
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Proto-oncogene c-myc
mdm2 c-fos
Growth factor TGF β
FGF-2
Insulin-like growth factor-II PDGF/c-sis
VEGF
Growth promotion gene Ornithine decarboxylase Ribosomal proteins Cyclin D1
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mRNA (strong mRNA)의 번역의 효율성을 그래프로 표현 한 것이다.(3) 지금까지 mRNA가 길고 복잡한 구조의 5' UTR을 갖고 있거나 5' terminal 위치에 oligopyrimidine 구 조를 갖음으로 해서 단백질 번역의 효율이 낮은 것으로 알려진 물질들은 Table 1에 기술한 바와 같다.(3,4) 따라서 eIF4E의 증가는 VEGF, FGF-2, cyclin D1, c-myc과 같은 물 질들의 합성을 증가시키고 이는 세포의 비정상적인 성장 과 분열을 초래하게 된다.
(2) 4E-BP1: 4E-BP1 (eIF4E binding protein, 또는 PHAS-1 으로 불리기도 함)은 eIF4E와 결합하여 eIF4E의 활동을 방 해하는 역할을 한다. 4E-BP1의 eIF4E에 대한 결합력은 4E-BP1의 인산화 정도에 따라 결정된다. 즉, 인산화가 되 지 않은 4E-BP1은 eIF4E와 결합하여 eIF4E의 활동성을 떨 어뜨리는 반면 인산화된 4E-BP1은 eIF4E를 자유롭게 하여 특정한 단백(mRNA가 길고 복잡한 구조의 5' UTR을 갖고 있는)의 합성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.(3,4) (3) p70 S6 kinase: Ribosomal S6 단백의 인산화는 단백 질 번역의 조절에 중요한 역할을 한다. 인산화된 S6 단백 은 5'-oligopyrimidine tract을 갖고 있는 mRNA의 번역과정 을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. p70 S6 kinase는 인 산화에 의해 활성화되며 이는 ribosomal S6 단백의 인산화 를 유발한다. 따라서 p70 S6 kinase의 인산화는 mRNA가 5'-oligopyrimidine tract를 갖고 있는 특정 단백의 번역을 촉진시키게 된다.(5)
3) 단백질 번역과정의 이상과 암
(1) 암세포에서 증가하는 단백질 번역과 관련된 물질들:
지금까지 많은 암세포에서 단백질의 번역과 관련된 물질 들이 증가해 있음이 밝혀졌다.
특히 eIF4E의 과발현은 배양세포의 변형(transformation) 을 유발하는 것이 밝혀진 후 Benedetti 등(3)에 의해 eIF4E 와 암과의 관계에 관한 많은 연구가 이루어졌다. 이들 연 구에 의하면 유방암을 비롯한 많은 고형종양에서 eIF4E가 증가되어 있으며 eIF4E 발현 정도는 유방암의 예후와도 밀접한 관계가 있는 것으로 밝혀졌다.(6,7) 또한 eIF4E는 저산소 상태에서 종양의 혈관신생에도 관여하여 암의 진 행에도 영향을 주는 것으로 나타났다. 또한 eIF4E 발현정 도는 non-Hodgkin's lymphoma나 두경부 종양의 예후와도 밀접한 관계가 있는 것으로 보고되고 있다.(8,9) 이러한 연 구 결과는 eIF4E가 과발현되는 종양의 경우, 보다 적극적 인 치료가 필요하다는 것을 시사한다고 할 수 있다. eIF4E 외에 다른 initiation factor 즉, eIF4G, eIF4A, eIF2-α 등의 물질과 암과의 관계에 관한 연구도 진행 중에 있다.(10) Initiation factor들 외에 암세포에서 증가가 확인된 대표 적인 물질로는 p70 S6 kinase가 있다. MCF-7 및 MB MDA 361과 같은 인체 유방암 세포주에서 p70 S6 kinase가 과 발현 되고 있음이 밝혀졌고 한 보고에 의하면 유방암의
약 10%에서 p70 S6 kinase가 과발현되고 있고 이는 유방 암의 나쁜 예후와 관계가 있는 것으로 나타났다.(11) (2) 신호전달체계의 과도한 활성화: 암 억제 유전자의 이상이나 tyrosine kinase의 과발현 등에 의한 신호전달체 계의 과도한 활성화는 암의 발생과 성장에 밀접한 관계가 있다. 이 중 대표적인 것이 암 억제 유전자 PTEN의 돌연 변이와 이에 따른 PI3-K/Akt 신호전달 체계의 과도한 활 성화이다. PI3-K 및 Akt의 활성화는 4E-BP1과 p70 S6 ki- nase의 인산화를 유발하여 암성장을 촉진시킨다.(12) 그 외에도 platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, HER2/neu 등의 tyrosine kinase 등도 일부의 암에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다.(13) 이러한 tyrosine kinase의 과발현은 하부 신호전달체계의 과도한 활성화를 유발하 며, 따라서 암의 발생 및 성장과 관련된 특정한 단백질의 합성을 촉진하게 된다.
4) mTOR 신호전달 체계
전술한 바와 같이 유방암에서 mRNA의 번역은 eIF4E의 과발현이나 신호전달체계의 과도한 활성화에 의해 증가하 게 된다. mTOR (mammalian target of rapamycin)은 PIKKs (PI3 kinase related kinase)의 일종으로 세포의 성장과 분열 에 주요한 부분을 차지한다. 세포가 외부로부터 성장에 관한 자극을 받게 되면 PI3-K는 세포막의 phosphadidy- inositol을 인산화시키고 이에 따라 Akt kinase가 인산화되 고 활성화된다. mTOR가 PI3-K/Akt 경로에 직접적인 지배 를 받는지 아니면 더욱 복잡한 과정을 통하여 조절되는지 는 아직 확실치 않으나 mTOR는 Akt kinase에 의해 활성 화된 후, 두 가지 경로를 통하여 mRNA의 번역에 관여하 게 된다. 첫째로 mTOR는 eIF4E의 억제물질인 4E-BP1을 인산화시켜 eIF4E의 활동을 자유로게 하고, 따라서 길고 복잡한 구조의 5' UTR을 갖고 있는 cyclin D1이나 ornithin decarboxylase와 같은 물질의 mRNA의 번역을 선택적으로 증가시킨다. 둘째, mTOR는 또한 p70 S6 kinase를 인산화 시킨다. 인산화된 p70 S6 kinase는 전술한 바와 같이 ribosomal S6 단백을 다시 인산화시켜 elongation factor나 insulin-like growth factor II와 같이 5' oligopyrimidine tract 를 갖고 있는 물질의 mRNA를 선택적으로 증가시켜 세포 의 성장과 분열을 촉진시키게 된다(Fig. 3).(14)
정상적인 상황에서 이 PI3-K/Akt/mTOR 신호전달체계는 암 억제 유전자의 산물인 PTEN에 의해 매우 엄격히 통제 되고 있다. PTEN은 세포막의 phosphatidylinositol의 인산화 를 억제하여 PI3-K/Akt/mTOR 신호전달 체계의 과도한 활 성화를 막아 주게 된다. PTEN의 돌연변이는 대표적인 유 전성 유방암인 Cowden씨 증후근을 유발한다. 또한 비유전 성 유방암의 상당수에서도 PTEN의 이상이나 감소가 발 견되고 있다. 따라서 mTOR를 표적으로 하는 PI3-K/Akt 신호전달 체계의 억제는 유방암 치료의 새로운 장을 열
수 있으리라 기대된다.
5) mTOR 신호전달체계를 표적으로 한 유방암의 치 료(전임상 연구)
Rapamycin은 streptomyces hygroscopicus에서 1970년대 초에 처음으로 추출되어 주로 장기이식 후의 거부반응을 치료하는 목적으로 개발되었다.(17) 그러나 최근들어 rapa- mycin 및 그 유도체가 항종양 효과가 있음이 밝혀진 후 새로운 항암 치료제 중 가장 촉망받는 물질의 하나로 주 목받고 있다. Rapamycin은 mTOR에 특이적으로 부착하여 p70 S6 kinase 및 4E-BP1의 인산화를 억제하여 세포의 성 장과 분열에 관여하는 단백의 합성을 방해하는 방식으로 암세포의 성장을 억제한다. Rapamycin의 유도체인 CCI-779 (Wyeth-Ayerst Research, Collegeville, RA) 및 RAD001 (No- vartis, Basel, Swizerland)에 대하여 이미 몇 개의 제 1상 임 상연구가 이루어 졌고 그 연구를 통하여 안전성이 입증되 었으며 유방암을 비롯한 고형종양에서 매우 고무적인 치 료효과를 보인 바 있다.(18,19)
PTEN의 변이를 보이는 암세포에서 PI3-K/Akt 신로전달 체계는 비정상적으로 활성화되어 있다. 따라서 일반적으 로 PTEN의 변이를 보이는 암은 rapamycin 치료의 가장 좋 은 적응증이 되리라 생각된다. 그러나 일반적인 유방암에 서 PTEN 단백의 이상소견은 2%에서 30% 정도로 그렇게 높지 않은 것으로 보고되고 있다.(15) 그러나 제 1상 임상 연구 결과와 전임상 연구 결과에 의하면 대부분의 유방암 에서 rapamycin은 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다.(18,19) 따라서 PTEN의 변이 이외에 유방 암에서 rapamycin 치료효과를 예측할 수 있는 인자들에 대한 연구는 아주 시급하다 생각된다. 따라서 저자 등은
유방암 세포주에서 rapamycin 치료효과를 예측할 수 있는 인자들에 관한 연구를 시행하였으며 그 결과를 간단히 소 개하고자 한다.
(1) 대상 및 방법: MCF-7, BT-20, BT-549, SK BR-3, MDA MB-231, MDA MB-361, MDA MB-435, MDA MB- 468 유방암 세포주를 대상으로 하여 1nM 에서 100nM의 rapamycin을 첨가한 후 4일 후 MTT assay를 통해 세포독 성을 측정하였으며 [3H] thymidine incorporation assay를 이 용해 세포의 성장을 측정하였다. Western blot을 이용하여 각각 유방암 세포주에서 mTOR 신호전달 체계의 기본적 인 활동성을 측정하였으며 rapamycin 처치 후 mTOR 신호 전달체계의 물질들의 변화를 측정하여 rapamycin 치료효 과를 예측할 수 있는 인자들을 찾아보고자 하였다.
(2) 결과: 암억제 물질인 PTEN은 BT-549와 MDA MB- 468 세포주에서 나타나지 않았으며 phospho-Akt는 PTEN Fig. 3. Regulation of translation initiation by mTOR signal trans-
duction pathways. Signaling via p38, extracellular signal- related kinase, PI3-K and mTOR can all activate translation initiation.
Growth factors and other mitogens
Ras P13K
Raf
MEK
ERK
Mnk-1 p38
Akt
mTOR
Nutrients, ATP
4E-BP1 S6K
S6
Translation of 5' TOP mRNAs eIF4E
Cap dendent translation (mRNA with highly structured 5' UTRs)
Fig. 4. The expression of mTOR and its upstream and downstream molecules in a panel of breast cancer cell lines cultured in the presence of 10% fetal bovine serum. The same amounts (50 μg) of total protein were prepared from the indicated cell lines at 60∼70% confluence, loaded onto an SDS- PAGE gel, and immunobltted with antibodies against PTEN, phospho-Akt (Ser473), total mTOR, phospho-mTOR (Ser- 473), phospho-p70 S6K (Thr389), phospho-S6 protein (Ser- 235/236), total 4E-BP1, phospho-4E-BP1 (Thr46, Ser65), total eIF4E, phospho-eIF4E (Ser209) and actin (from top lane to bottom).
mTOR
Phospho– p70 S6 kinase (Thr389) Phospho-S6 protein
(Ser235/236)
Phospho- 4E-BP1 (Thr46)
Phospho- 4E-BP1 (Ser65)
eIF4E Phospho-eIF4E
(Ser209) Phospho-Akt
(Ser473) PTEN
Actin
MDA-MB 231
MCF-7 BT-20 BT-549 SK BR-3
4E-BP1
MDA-MB 361 MDA-MB 435 MDA-MB 468
Phospho-mTOR (Ser473)
mTOR
Phospho– p70 S6 kinase (Thr389) Phospho-S6 protein
(Ser235/236)
Phospho- 4E-BP1 (Thr46)
Phospho- 4E-BP1 (Ser65)
eIF4E Phospho-eIF4E
(Ser209) Phospho-Akt
(Ser473) PTEN
Actin
MDA-MB 231
MCF-7 BT-20 BT-549 SK BR-3
4E-BP1
MDA-MB 361 MDA-MB 435 MDA-MB 468
Phospho-mTOR (Ser473)
음성인 두 세포주를 포함하여 8개 중 4개의 세포주에서 발현되었다. mTOR와 phospho-mTOR는 8개의 세포주 모두 에서 거의 비슷한 양상으로 발견되었다. phospho-p70 S6 kinase는 MCF-7과 MDA MB-361 세포주에서 강하게 발현 되었으나 phospho-S6 단백은 8개 모든 세포주에서 비슷한 양으로 나타났다. p70 S6 kinase와 함께 mTOR의 지배를 받는 4E-BP1은 8개 세포주에서 각각 다른 양상으로 발현 되었지만 phospho-4E-BP1과 4E-BP1의 총량은 거의 비슷 한 양상을 보여, 유방암 세포주에서 4E-BP1의 인산화 정 도는 실험에 사용된 유방암 8개 세포주 모두에서 비슷한 것으로 나타났다. eIF4E는 8개 세포주 모두에서 비슷한 양 상으로 발현되었으나 mRNA에 보다 강하게 부착하는 것 으로 알려진 phospho-eIF4E는 그중 3가지 세포주에서만 관찰되었다(Fig. 4). 요약하면 PTEN은 8개 세포주 중 2개 에서만 음성으로 나타났지만 Akt는 4개의 세포주에서 인 산화되어 있었고 mTOR와 mTOR의 표적이되는 p70 S6 kinase 및 4E-BP1은 8개의 세포주 모두에서 인산화되어 있 어, 실험에 이용한 모든 세포주에서 mTOR 신호전달체계 는 활성화되어 있음을 알 수 있었다.
각각 유방암 세포주의 rapamycin에 대한 민감도를 측정 하기 위한 MTT assay와 [3H] thymidine incorporation assay 에서는 rapamycin이 8개 중 6개의 세포주에서 IC50 100 nM 정도의 농도에서 세포의 성장을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다(Fig. 5). Phospho-Akt양성인 BT-20, BT-549, SK BR-3와 MDA MB-468는 rapamycin에 민감한 반응을 보였 고, 흥미있는 것은 이들 외에도 phospho-p70 S6 kinase가 과발현되고 있는 MCF-7 및 MDA MB-361 세포주도 ra- pamycin에 민감한 반응을 보인다는 사실이다. 반면에 PTEN
양성, phospho-Akt 음성이며 phospho-p70 S6 kinase가 과발 현되지 않는 MDA MB-231과 MDA MB-435 세포주는 rapamycin에 저항성이 있는 것으로 나타났다.
또한 이러한 rapamycin에 의한 세포성장의 억제는 아포 토시스의 증가에 의한 것이 아니라 세포주기의 진행의 억 제(inhibition of cell cycle progression)에 의한 것임이 관찰 되었다(Fig. 6)(Table 2).
다음으로 rapamycin에 대한 민감도와 연관이 있는 약물 역동학적 인자(phamacodynamic parameter)를 찾아보기 위 하여 rapamycin 처치 후 mTOR 경로의 인자들의 변화와 rapamycin 민감도와의 관계를 살펴보았다. Rapamycin 처치 Fig. 5. Inhibition of cell growth and DNA synthesis by rapamycin (A) Breast cancer cell lines were treated with rapamycin in indicated concentration for 4 days and cell viability was determined by a standard MTT assay. (B) Cells were treated with rapamycin for 4 days and incubated for additional 16 hours with [3H]thymidine. The data are presented as the mean of three separate experiments at each treatment dose. The standard deviations were all within 5% of respective means. *P＜0.05 by Student's t test.
Table 2. Cell-cycle analysis of breast cancer cell lines with or without treatment with rapamycin
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Cell line P value
(control) (rapamycin+)
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MCF-7 1.45±0.24 3.51±1.00 0.025†
BT-20 1.60±0.16 2.80±0.29 0.003†
BT-549 1.01±0.27 1.97±0.43 0.042†
SK BR-3 1.95±0.26 3.29±0.69 0.035†
MDA-MB 231 1.64±0.27 1.89±0.09 0.214
MDA-MB 361 1.91±0.34 2.85±0.17 0.013†
MDA-MB 435 1.23±0.59 1.29±0.75 0.915
MDA-MB 468 0.98±0.18 1.47±0.22 0.044†
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*The ratio of number of cells in the G1 phase to those in the S or G2M phase, The data are presented as the mean of three separate experiment the standard deviation; †P＜0.05 by Stu- dents t test.
후 4E-BP1 및 p70 S6 kinase 인산화는 세포의 민감도와는 관계없이 모든 세포주에서 매우 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다. 즉 rapamycin은 유방암의 모든 세포주에서 mTOR 및 mTOR 하부 경로의 물질들의 인산화를 효과적으로 억제 하지만 억제되는 정도와 세포의 약물에 대한 민감도는 연 관성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 phospo-4E-BP1 및 phospho-p70 S6 kinase의 억제 정도는 약물의 민감도를 예 측할 수 있는 인자로는 불충분한 것으로 나타났다(Fig. 7).
반면에 rapamycin에 민감한 세포들에서는 rapamycin 처치
후 cyclin D1의 발현이 억제됨이 관찰되었다(data not shown).
결론적으로 rapamycin은 PTEN 음성인 유방암뿐만 아니 라 phospho-Akt 양성인 유방암, phospho-p70 S6 kinase가 과발현 되는 유방암에서도 효과적으로 암세포의 성장을 억제하는 것으로 나타나, 본 연구는 rapamycin이 보다 많 은 유방암 환자에서 효과적인 치료의 하나가 될 수 있음 을 시사하였다.
결 론
본 논문에서 저자들은 단백질 번역과정의 조절이 암 치 료의 새로운 표적으로 등장한 배경과 유방암에서 mTOR 를 표적으로 한 치료에 관한 연구를 간단히 살펴보았다.
임상적인 면에서 보면 mTOR를 표적으로 한 rapamycin과 그 유도체들은 새로운 유방암 치료제로 매우 희망적인 것 으로 보인다. 그 이유는 첫째 rapamycin은 기존의 항암제 와는 달리 mTOR 신호전달체계를 선택적으로 겨냥하는 치료제이며 기존의 항암 치료와의 병합치료가 용이한 것 으로 판단되기 때문이다. 둘째는 세포의 성장을 억제하는 성장 억제제(cytostatic agent)이고 지금까지 임상 시험 결 과 부작용이 적어 장기간의 치료가 가능할 것으로 생각되 Fig. 6. Effect of rapamycin on cell-cycle progression and apoptosis.
(A) Rapamycin inhibited cell-cycle progression from G1 phase to S phase in MCF-7 cells. Cells were incubated with or without 100 nM rapamycin for 4 days and then fixed with 75% ethanol and stained with propidium iodide. The histogram showing the relative DNA content was deter- mined by flow cytometry. (B) Cells were incubated with or without 100 nM of rapamycin for 4 days and then prepared and stained described in (A). The histogram shows the percentage of cells in sub-G1 peak, which is believed to indicate apoptotic cells. Each column represents the mean of results of three separate experiment±standard deviation.
12
Apoptosis (%)
0
Rapamycin+
Control
MCF-7 BT-20 BT-549SK BR-3
MDA-MB 231MDA-MB 361MDA-MB 435MDA-MB 468 10
8
6
4
2
B A
0 200 400 600 800 1000 FL2-A
0 4080120180200 M4
M1 M2
Counts M3
070302.002 MCF-7 (Rapamycin+)
G1 79.59 S 6.96 G2M 10.93
0 200 400 600 800 1000 FL2-A
0 4080120180200 M4
M1 M2 Counts M3
070302.001 MCF-7 (Control)
G1 59.73 S 24.29 G2M 15.12
Fig. 7. Effect of rapamycin on mTOR and its downstream mole- cules in a panel of breast cancer cell lines. Cells were treated with 100 nM rapamycin for 24 hours in the pre- sence of 10% fetal bovine serum. Fifty microgram of total protein was prepared from the indicated cell lines and immunoblotted with antibodies against phospho-mTOR (Ser473), phospho-p70 S6K (Thr389), phospho-S6 protein (Ser235/236), phospho-4E-BP1 (Thr46), phospho-4E-BP1 (Ser65), phospho-eIF2α (Ser51) and actin (-, without rapamycin; +, with rapamycin).
Phospho- S6 Protein
Actin Phospho- P70 S6 kinase
Phospho- 4E-BP1 (Thr 46)
MCF-7 BT-20 BT-549 SK BR-3 MDA-MB 231 MBA-MD 361 MDA-MB 435 MDA-MB 468
Phospho- 4E-BP1 (Ser 65) Phospho-mTOR
Rapamycin Phospho- eIF2α
- + - + - + - + - + - + - + - + Phospho-
S6 Protein
Actin Phospho- P70 S6 kinase
Phospho- 4E-BP1 (Thr 46)
MCF-7 BT-20 BT-549 SK BR-3 MDA-MB 231 MBA-MD 361 MDA-MB 435 MDA-MB 468
Phospho- 4E-BP1 (Ser 65) Phospho-mTOR
Rapamycin Phospho- eIF2α
- + - + - + - + - + - + - + - +
기 때문이다. 또한 일반적으로 taxane이나 adriamycin에 내 성을 보이는 유방암 세포에서 PI3-K/Akt/mTOR 신호전달 체계가 과도하게 활성화되어 있는 것이 관찰되었다. 따라 서 이러한 유방암에서 rapamycin과 기존 항암제와의 병합 치료에 의해 내성의 극복을 기대할 수 있으며,(20) 이 부 분은 임상적인 측면에서 볼 때 mTOR를 표적으로 하는 치 료의 가장 촉망받는 부분이라 생각한다.
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