Studies on the Production of ${beta}$-Galactosidase by Microorganism and its Application (III) -Preparation and properties of Immobilized ${beta}$-Galactosidase from Penicillium sp.-

f(OT, J^‘ Appl. Microbiu{. Bieng

v서

“

微生物에 의한 β- Galactosidase 의 生품 빛 利用에 관한연구 (ill)

-Peηicillium sp. 의 醒素의 固定化 맞 固定化醒素의 ↑生質-

吳平洙， 崔溶鎭， 梁漢喆

i힘麗大學校 農科太學 食品I 學科 1983 년 11 월 19 일수리

S tudies on t he Production of

- Galactosidase by Microorganism and its Application (ill)

- Preparation and properties of Immobilized

β-

Pyong Su 0, Yong Jin ChoÎ, and Han Chul Yang

Department of Food Technology, College of Agriculture, Korea University (Received November 19, 1983)

The ß-galactosidase 01 Penicillium sp^, clescribed in a previous report was immobilized on phenoi lormaidehyde resin (Duolite ES-762). The immobilization was carried out at pH 5.0 and 20 0C using the crude enzyme solution having

the、activity01 18 units/mL For the cross-linking 01 the aàsorbed enzyme to the carrier the coupling reaction using glutaraldehyde as a lunctional reagent was allowed to proceed at 5 0C lor 24 hours^, The immobilized ß-ga!actosidase prepared retained 6.4 'mg 01 protein bound to the one gram 01 dry resin with the 70% yield 01 immobilization^, The im- mobilized enzyme showed a pH optimum 01 5^,0 and a temperature optimum 01 50 0C lor its activity^, The enzyme was lound to be considerably stable in the pH range 01 4,0-6,'), Durability 01 the hydrolytic activity 01 the immobilized ß-galactosidase was examined by continuously running 5 % lactose solution through the enzyme ^packeο co1umn at 50 0C. More than 50% 01 the initial activity was still maintained lor 25 days at pH 4,5,30 days at pH 5.5, and 25 days at pH 6.5

β

구되어 왔다

"

291

ydroìase, EC 3, 2, 1,

23) 는 牛주L 中에서 탄수 화물의 주성분인 lactose 를 단당류인 gluco se와 ga-

固定 化 β

galactosidase 에 는

lactose로

가수분해 하는 효소 로서 牛￥L 중의

tos e 의 분해는 ￥L精不耐핀춤에 알맛는 牛￥L製品을 제공 해주며

몇 j양解↑生을 증가

키 며 또 한 whey 중의 lactose分때논 그 利떠性을 높여 준다.

β Galactosidase 의 固定化는

午￥L 벚 ￥L製낌1 중 으I

산쩍性별統反(，0;、띔폐IJft ， 安定↑主 맞 不純物混人 ßJj 止 등을 목적으로 많이 연

(2,3’‘’5)’ S accharornyces lactis'6.1', A sprgillμs ηiger(8 ，

9) A spergillus oryzae'^lO‘í l) 맞 Scopμlariopsis(12) 등을

起j댄으로 하여 解휩化學的 性質 및 추 IJ 用性:에 관한 연구가 많이 료고되고 있다.

격，; 冊究에서는

固定化 β

산엽 적

cillítιm

의

固定化醒素의 염￥素化學H낀

ctose 의 i重減分얘￥ 맺 反r，e、持純↑主 등을 검 토 하였 다

292

좋용윷Mn 및 方法

M :t과

β - Galactosidase는 前報(1 3~1 ‘)에 서 보고된Penici-

lllium

sp 를 밀기울 固샤培짚 하여 水道水로抽죄1J한 후

l로 20% 에서 70% 시 아 로 fraction된 解素蛋 ËJ 응 aceton 으로 건조하여 將末化된 製品

시

하였 다

res m 인

맞

761 은

社의 製品을 샤용 하였다. β Galactosidase 의 活 셉:ì.則定을 위한

nitrophenyl-β

ranoside

(ONPG) 는

製品을.lac-

分解率의 없IJ 定을 위한

reagent는

製品을 각각 사용 하였

β Galactosidase의 固定化

不 y깜 t1 t다샤로서 多孔性

50g을 이온 교환수로

척 한

buffer 로 平­

f한시 켰다- β-

lctosidase는 料宋製品드로서

을

200ml로 용해한

Kor. J. Appl. Microbiol. Bieng.

여 Lowry등(151 의 방볍에 의해 定量 하였다.

Lactose

分解率의 測定

Lactose로 부터 β

galactosidase 에 의 해 분해 되 어 생 성 된 glucose플 Washko와 Rice(16)의 방법 을 응 용한

reagent 벙 에 따라 測定 하였다.

Packed - 8ed Reactor

연속적흐로 lactose를 分解시키기 위하여

mn은

column을 사용 하였고 일정온도 유지와 기질을 일정하게 주입하기 위 하여

bath와

pump 를 부착하여 샤용 하였다.

실험결과 및 고찰

不溶性 租f本의 i꿇 :tR

β- Galactosidase를

化하기 위해 여러가지 不 溶性 뼈休 중에서 업￥素의 安定

溫度 벚 基質反 IZ、의 流速등을 고려하여

1 과 같이 4 종류의

idase immobilized on the various suppo- rts.

후

불용성

사용 하였、

이 解素波 150mR 에

uffer 로

24 시깐

n及꽉 시 킨

아온교환수호 吸깐되지

醒素를 여 러 벤 새척 하였다 여기에 이온교환수 100뼈를 넣고

5.C

에서 교반하면서

용액을 최

되게 서서히 가하여 24시간반응시킨 후 이온교환수로 반응하지

glutaraldehyde용액

여러번 세척히여 최종

resin에 固定化된 협:素 를

β- Galactosidase 의 活性測定法

7J이容性解素의 i펌↑生벌이立 (unit) 는 ONPG 를 기질로

( unit) 는

에 증류수

pH4.5.0.2M acetate buffer

0

5mR 를← 끼]

에서 5 분간 예열한 후 기질

O . 5mR 를 加하여 15분간 반응시 킨 후

^{2mR플 加}

하여 반응 을 중지시키고 반응에 의해 생성된 。nI­

trophenol을 4lünm 에서 比色定量

이 반응 조건에서

nitrophenol을생

解素 量을 1 펄位로

蛋 B 質 定量

똥白탑유 h(、、，in p. SP rlln :. H、1IrT1 1n욕 煙進판 I여 。'" 승l

activity in enzyme activity supernatant

(units/mJ) (units/g resin)

Duolite A- 7 9.6 1. 88

Duolite A-561 8.4 2.38

Duolite S'-761 16.4 1. 20

Duolite ES-762 6.2 5. 59

Fig. 1. Immobilization procedure of β-gal 앓 tosid-

ase.

Phenol- formaldehyde resin

Eq밍1\꽤 u

fβ

Stirring at 20.C for 24 hr

DecaJt several times with deionized water

~Glutaral아hyde

Decan|t several times wlth deionized water

β galactosidase ìmmobilized on phenol- formaldehyde

r p. ~in 'Wit'h í11nt:l rR 1서 phv서 p

Vol.l1. No. 4

henol

一

re

택

과 같 은 방볍 으로

buff e r 로平 衛 시켜 업￥素;農度

용액에서 吸 i:f 빛 [회 定 化 시 켰 을때

7627~

resin으 로 固定化 率 이 제일 높았디.

β Galactosidase固定化

조건

Duolite ES -

762 에 β

galac tosidase플 固定化

決定

가 위 하야

uffer로

‘ 0은

buffer로 平衝 시 켜 각

에 서

galac to

e를 吸합시 켰

와같

結果를 얻었다 이때 pH5.0 에서 固定 된

galactosidase活↑生 이 제

다-

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8 16 24

Loading level (units/ml) Fig. 3. Adsorption of β galactosidase to Duolite

ES-762.

素

적 pH 는 큰 변

가

었다.

固定化 β

galactosidase 어| 미치는 온도의 영향

β - galac tosidase에 미

여 固定 化解

에서 65

C

지

과 Fig.5 와 같이 固定 化 解 素와 水 깜性解 素의 최적온도는 50

C 로 동일 하였

固定化 β-

安定性에 미치는 pH 으|

영향.

固定化 β-galactosidase 安定性에 미 치 는 pH의 영 향을 경토하기 위하여 pH3.5 에샤 p

H

uffe r를， pH5.5 에서 pH

pH O.05M phosphate

buff

다

Fig. 2. Effect of pH on adsorption of β-galacto- 素는 0.1"

에 각

의

m~ 를，

0.

각 pH

로

β - Galactosidase 固定化으| 解素漫度

ß - G

al."c to

idase를

n及휩 시 키기 위하여 解素漫度를

unit

R 에서

까지

tosidase 吸줍 力

이 업￥素 r農똥 가 18 uni ts/mR 일때 固定 ft β

sidase는 6 units/g resin_으로， 건조된 Duolite E- S-762 resin

1

에

.4mg 이 吸칩 빚 固

% 가

固定化

gaiac t.osidase어| 미치는 pH 으| 영향

762 에 固定化된 β

에 마 치 는 pH 의 영 향을 검 토하 기 위 하여 固 定化解 素와 水溶{生解素플 각각 pH3.5 에서 pH

.

는

100

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40

여@

20

2 4 6 8 10

acetate

buffer플， pH5.5 에서 pH7.5 까지

hate

buffe r플 사용히

벨

경

였

Fig.

β

Fig.4와 같

이 固 定化解素의 최적 pH 는

0，

。→。 ，

β-galactosidase;

醒素 의 최 적 pH는 4 . 7로서 固定化醒素 와 水 溶性 解

β-

294 Kor. J. Appl. Microbiol. Bieng.

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20 40 60 40 50 60

Temperature ('C) Temperature ('C)

Fig. 5. Effect of temperature on β-galactosidase Fig.7. Effect of temperature on β-galactosidase

activity. stability.

0 - 0, native β-galactosidase; . - . , 0 - 0, native β-galactosidase; • - . , im m- immobilized β-galactosidase. obilized β-galactosidase.

50'C,

24 시 간 처 리 하여 잔존하는 醒素活性을- 測定

과 같이

에서 固定化醒素는 80% 이상， 水 하였다.

과 같이 固定化解素는 pH4.0에서

溶性解素는 60% 이상을 安定性을 나타냈다.

H6.5 까지， 水溶性解素는 pH4.0 에서 pH6.0까지

反파 速度

%이상의 安定性을

으며 固定化醒素가 水침 基質漫度에 따른 反 æ‘速똥는

‘

↑生업￥素 보다 中↑生 pH 뱀위에서 安定性을 나타냈다 p

l 7)에 따라 pH4.5， 40'C 에서 固定化 β-

固定化 β → galactosidase安定性에 미치는 온도의 sidase는

에서， 水溶性 β galactosidase는

영 향

에서 각각

와

l려定

i t:

安定性 에 미치는 온도의

(Vmax) 를 구하였다. Lacto se 플 基합 로 영향을 겁보하기 위하여 固定化解素는 o

에

하였을때 固定化解素의 Km 은

Vmax는 5μm-

3mf 에셔， 水깜性解素

protein 이며 水溶性解素의 Km 은

는 0.2% 滾度의 解素을 함유한

Vmax는 10μmoles/min /mg prote in으로 差뿔를 나타

에 서 온 도

에 서

까지 각각

냈 다.

시간 처리하여 잔존하는 醒素活性을

100

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60

40

20

3 4 5 6 7 8

pH

Fig.6. Effect of pH on β-galactosidase stability.

。-0， native β galaactosidase;

. - . ,

immobilized ^β galactosidase.

업쭈素에 의한 基-質 Lactose 分解에 대한

의 P且좀효과를 검토하기 위하여

40'C 에서

-

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l/s (mM) ^-IX 10-'

Fig.8. Lineweaver-Burl

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galactosidase for lactose as substrate.

Vol.ll.No.4

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20 20 40 60 80

Galactose (mM)

1/s (mM) -1 x 10-² Fig.l1. Graphical determination of Ki for native Fig.9. Lineweaver-Burk plot of native

β-galacto-

sidase for lactose as substrate.

pH 4.5,

pH5.5 인

용액과

plots (l8)에 따라 固定化 β- galactosidase 는

용액을 固定化 β

ig. lO에서 水溶性β- galactosidase는 Fig.11 에서 각 lactosidase 의

volume 이

galact ose 의 灌度는 100mM 과

13 에서와

25 일간， pH5.5 에서는

Ki는

19mM 과

。 se는

inhibitor로 나타났다.

流速과 lactose分解度

固定化 β- galactosidase 에 의해 基質인 lactose 를

기 위해 基質 lactose

V) 를 항유한 pH4.5, 50mM acetate buffer

용액 을

50'C 에서

volume 인

12 에서 나타낸 바와 같이 流速

에서도

分解率이

이상 되었다.

Lactose 훌옳分解 *좋흙性

固定化 β

galactosidase를 j훨純8낀 ~i흐 f훗用하기 위 하여

에서 基質

를 함유한

,’. • ξ，웅

1i{

、E다、×

.... 2

\~

-,

.m잉

。

E ::t 1

- 20 20 40 60

Galactose (mM)

Fig.l0. Graphical determination of Ki foÌ" imm obilized β-galactosidase at pH 4. 5 and 40'C.

요 약

前報(13 ， 1 ‘)에 보고한 Penincillium sp. 의 β - galac-

to sidase를

解素濤度

units/mi 로

에

100

*

.~ 、

~ 60

!〉그、

:I: 40

20

80

20 40 60

Flow rate (ml/hr)

Fig. 12. Effect of f10w of substrate through co- lumns on the β-galactosidase immobilized on Duolite ES- 762. A 5% w /v lactose solution in 50 mM acetate buffer. pH 4.5.

was eluted at various flow rate through a 1. 5 x 10. 5 cm columns maintai ned at 50

。 C containing im mobilized β galactosidase.

296

100

(

~

〉、

。::: 40

g

〉、

I 20

10 20 30 40

Kor. J. Appl. Microbiol. Bieng.

2. Hustad, G.O., Richardson T., and N. F. Olson : Journal 0/ Dairy Science 56 (9), 1111 (1973) 3. Hinberg, I. Korus R., and K. F. 0’driscoll

Biotechnology and Bioengineering, 16, 943 (1974)

4. Wondolowski, M. V., and J. H. Woychik: Bio- technology and Bioengineering, 16, 1633 (1974) 5.

拍川金次郞， 高橋-t:/子:후養 ε 食體，

33 (1975)

Time (days) 6. Kilara, A., Shahani K. M., and Fred W. Wa- Fig. 13. Du.-ability of

β-

ed on D

‘

through a 1. 5X 10. 5 cm water-jacketed 9. Hidekatsu Maeda: Biotechnology

aπd

mobilized

β-

39 (2), 491 (1975)

24시 간 吸춤시 킨 후 glutaralde hyde로

에서 24 시

Biotechπ0- 간 반응시 켜 최 종 적 으로 건조

에 대 해

aηd

4mg 의 解素蛋白이 結合된 固定化 β- galactosida se를

얻었다. 이때 β- galactosidase 의 固定化뼈率은

ermeπt.

，

% 가 되었다 13. 吳平洙， 梁漢喆

효 業微 生物좋승誌， 9,

이 固定化醒素의 最適 pH 는

最適遍度는

。C 이며

범위에서 상당히 높은 안전성

吳平洙， 徐펄源， 梁漢喆

훌業微生物추合誌，

을 나타냈다

한편 이 固定化醒素를 充f톨한 column에

actose용액을 連殺으로 注入. 50.C 에서 連結反파、시

ι

켜 解素의 分解持鏡性을 검토한 결과 pH4. 앤l 서는

25 일， pH5.5 에서는 30 일， pH6.5 에서는 25 일간 反

Cliπ Chem

æ、시 킨 후에도 初期 醒素活性의

이상 유지 하

는 결과를 얻였다 17. Lineweaver.

참고문헌

1. Greenberg, N. A., and R. R. Mahoney: Process Biochemistry, Feb./March 2 (1981)

Soc., 56, 658 (1934)

18. Dixon, M., and E. C. Webb: Enzymes, 3rd. Ed., Academic, New York, 332 (1979)