• 검색 결과가 없습니다.

Transmission Electron Microscopic Findings of Lacrimal Gland Acinar Cells Induced by In Vivo Dry Eye

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Transmission Electron Microscopic Findings of Lacrimal Gland Acinar Cells Induced by In Vivo Dry Eye"

Copied!
8
0
0

로드 중.... (전체 텍스트 보기)

전체 글

(1)

pISSN: 0378-6471⋅eISSN: 2092-9374

http://dx.doi.org/10.3341/jkos.2014.55.8.1187

Original Article

투과전자현미경을 이용하여 관찰한 건성안 유발 마우스 눈물샘 선세포의 변화

Transmission Electron Microscopic Findings of Lacrimal Gland Acinar Cells Induced by In Vivo Dry Eye

서유리1⋅여아름1⋅노혜미1⋅정동룡2⋅김태임1,3⋅서경률1,3⋅김응권1,3⋅이형근1,3

Yu Ri Seo, MD1, A Reum Yeo, MD, PhD1, Hye Mi Noh, MD, PhD1, Dong Yong Chung2, Tae Im Kim, MD1,3, Kyoung Yul Seo, MD1,3, Eung Kweon Kim, MD1,3, Hyung Keun Lee, MD1,3

연세대학교 의과대학 안과학교실 시기능개발연구소1, 연세 의생명연구원 형태학연구실2, 연세대학교 의과대학 안과학교실 각막이상증연구소3

Institute of Vision Research, Department of Ophthalmology, Yonsei University College of Medicine1, Seoul, Korea Morphology Lab., Yonsei Biomedical Research Institute2, Seoul, Korea

Institute of Corneal Dystrophy Research, Department of Ophthalmology, Yonsei University College of Medicine3, Seoul, Korea

Purpose: To determine the change in lacrimal gland (LG) acinar cells induced by in vivo dry eye (DE).

Methods: Six to 8-week-old (C57BL/6) mice were placed in a controlled environment chamber at <20% humidity for 2 weeks, and a control group was bred in a normal environment. After these 2 weeks of dry eye (DE) induction, the mice were sacrificed and their LGs were collected. Lacrimal gland acinar cell organelle structures were observed with Transmission Electron Microscopy (TEM). TEM images were analyzed using the Image J program.

Results: The size of the LGs of DE-induced mice decreased compared to those of normal mice. Terminal deoxynucleotidyl trans- ferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) staining was negative in DE-induced LGs. Under the TEM, the endoplasmic reticulum (ER) lumen was dilated and the lumen density increased in DE-induced mice. Additionally, cell organelles were surrounded by elongated ER lumens. The mitochondrial structure was destroyed and the number of vacuoles increased in the LGs of DE-in- duced mice.

Conclusions: Structural changes of the LG developed due to DE induction. This suggests that the detailed mechanisms of these changes were ER stress and autophagy. However, there were no definite signs of apoptosis in the acinar cells of the DE-induced LGs. These findings are regarded as an important clue of the pathogenesis of non-Sjogren-type dry eye.

J Korean Ophthalmol Soc 2014;55(8):1187-1194

Key Words: Autophagy, Dry eye, ER stress, Lacrimal gland

Received: 2013. 12. 28. ■ Revised: 2014. 2. 1.

Accepted: 2014. 7. 12.

Address reprint requests to Hyung Keun Lee, MD

Department of Ophthalmology, Gangnam Severance Hospital,

#211 Eonju-ro, Gangnam-gu, Seoul 135-720, Korea Tel: 82-2-2019-3440, Fax: 82-2-3463-1049 E-mail: shadik@yuhs.ac

* This study was presented as a narration at the 110th Annual Meeting of the Korean Ophthalmological Society 2013.

* This study was supported by a grant the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (Grant no.: HI13C0055).

2014 The Korean Ophthalmological Society

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

대부분 건성안의 증상은 눈물기능단위(Lacrimal func- tional unit)의 만성적인 염증으로 인하여 눈물막(Tear film) 이 유지가 되지 않기 때문에 발생한다.1 그렇기 때문에 기 존 건성안의 치료는 눈물기능단위 중에서도 눈물막이 분포 하는 Ocular surface에 초점이 맞춰져 있다. 하지만 건성안 환자에서 눈물막이 유지되지 않는 근본적인 원인은 눈물분 비가 부족하기 때문이다. 이것은 눈물샘의 기능이상에 기 인하며 이러한 기능이상을 근본적으로 해결할 수 있는 치 료법의 개발이 필요한 상태이다. Hirayama et al2은 이러한

(2)

Figure 1. Dissection of lacrimal gland in mice. (A) After mak-

ing an incision as V-shaped from the inferolateral side of the ear to ramus of mandibule on the skin, we dissected a subcuta- neous tissue along the incision line. W e flipped over the skin and subcutaneous tissue. (B) Then, submandibular gland (3) was noted at just inferolateral side of the ear. W e observed that the lacrimal gland (1) and parotid gland (2) were in front of the submandibular gland (3). The lacrimal and parotid glands were very close to each other. They could be separated along the fissure. (C) After separation, the lacrimal gland was little bit smaller than the parotid gland.

점에 착안하여 최근 연구에서 마우스 모델을 이용한 눈물 샘 이식 후 눈물 분비의 증가를 확인하였다. 이처럼 눈물샘 기능 이상의 회복은 건성안 치료에서 중요시되고 있으나, 그 기전에 대해서는 정확히 연구된 바가 없다.

최근 다른 질병에서 장기(organ) 기능 이상을 설명하는 세 포수준의 변화로 소포체 스트레스(Endoplasmic Reticulum Stress)가 있다. Zhang and Kaufman3에 의하면 소포체는 세 포 내에서 단백질을 정확하게 조립하여 골지체(Golgi appa- ratus)로 보내는 역할을 한다. 그 과정에서 제대로 조립되지 않은 단백질은 골지체로 이동하지 못하고 소포체내강에 머 무르게 된다. 이러한 소포체의 조절 과정은 외부 항상성 변 화에 민감하다. 칼슘 대사의 이상이나 산화-환원 상태이상, 또는 단백질 합성의 증가나 제대로 조립되지 못한 단백질 의 과잉, 포도당 등의 영양분 부족은 소포체강 내에 제대로 조립되지 못한 단백질이 쌓이도록 한다. 이러한 변화에 대 해 소포체는 Unfolded Protein Response (UPR)를 유발하여 소포체강 내에 쌓여 있던 단백질들을 분해하고, 새로운 단 백질이 소포체내로 유입되는 것을 막으며 단백질의 새로운 생성을 억제한다. 이러한 과정에 이어 소포체 스트레스는 자가포식현상(Autophagy)을 유발하며 이것은 세포의 물질 대사 과부하를 줄이는 역할을 한다.4 하지만 외부 스트레스 가 매우 심할 경우에는 소포체 스트레스가 세포자멸사 (apoptosis)를 유발하기도 한다.5 소포체 스트레스, 자가포식 현상, 세포자멸사와 관련된 일련의 과정은 기존의 다른 질 병의 병인으로 각광받고 있다. 당뇨병에서 이자의 β세포의 기능저하는 소포체 스트레스의 증가 및 자가포식현상의 결 핍으로 인한 세포자멸사의 증가에 기인하며, 알츠하이머병 에서 뇌 혈관의 내피세포의 기능저하도 같은 현상에 기인 한다고 알려졌으며 이러한 변화에 대응하는 치료약물 등이 개발되고 있다.6,7 만약 건성안에서 눈물샘 기능저하가 위 현상에 의해 일어난다면 이는 건성안 치료의 목표점이 될 수 있을 것이다. 이에 본 연구에서는 건성안 유발 마우스의 눈물샘 선세포를 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM)을 이용하여 세포수준에서 관찰하고, 정 상군과 비교하여 건성안에서 눈물샘 기능이상의 원인을 밝 히고자 하였다.

대상과 방법

실험동물 및 재료

8-10주령의 C57BL/6 마우스(Charles River Laboratory, Wilmington MA) 총 10마리를 대상으로 하였다. 마우스들 은 국립보건원의 지침과 일치하는 연세대학교의 윤리위원 회가 정한 규정에 따라 취급하였다. 평균 몸무게는 20 g이

었고 편차는 2 g 이내였다. 그중 5마리를 20% 미만의 습도 가 유지되는 Dry eye chamber 내에서 2주 동안 사육하였다.

나머지 5마리는 정상 환경에서 습도를 제외한 동일 조건하 에서 사육하였다.

건성안 유도 챔버(Controlled Environmental Chamber) 본 연구에서 건성안 유도를 위해 사용된 Controlled Environ-

A

B

C

(3)

mental Chamber (CEC)는 에어 콤프레셔, 워터 세퍼레이터, 흡착재 필터, 에어 드라이어로 구성된 제습기를 통해 챔버 내의 환경이 습도 10-15%, 온도 23-26℃ 내외로 유지될 수 있도록 설계되었다. CEC에 이용된 제습의 방식은 압축냉 각식과 흡착식을 혼합한 형태이다. 대기 중의 공기를 에어콤 프레셔로 압축하면서 발생하는 수분을 냉동식 에어드라이어 에 지나게 하여 걸러진 수분은 워터 세퍼레이터를 통하여 외 부로 나가게 된다. 이후 압축 압력을 줄 수 있는 흡착재 필터 를 한 번 더 통과하면서 낮은 습도를 유지할 수 있다.

마우스의 눈물샘 적출 및 크기 비교

마우스를 CO2 chamber에 넣어 질식시킨 후 경추 탈골을 시행하였다. 마우스의 옆면이 보이도록 놓은 후, 마우스의 털을 알코올로 충분히 적셔 털을 정리하였다. 귀의 아래 가 쪽에서부터 아래턱뼈 가지(Ramus of mandibule)를 따라 V 자 모양으로 피부 절개를 시행한 후 , 피하조직을 들어올려 가위를 이용해 기구가 들어갈 공간을 만들었다(Fig. 1A).

절개선을 따라 박리를 시행하면 귀의 아래 가쪽 구석의 턱 밑샘(Submandibular gland)이 관찰되며, 그 앞쪽으로 눈물 샘(Lacrimal gland)과 귀밑샘(Parotid gland)이 관찰되었다.

마우스의 눈물샘과 귀밑샘은 서로 인접해 있으며 눈물샘은 귀밑샘의 위 앞쪽에 위치해 있었다(Fig. 1B). 두 기관 사이 에 틈(fissure)이 있어 이 틈을 통해 두 기관을 박리할 수 있 었다. 박리 후 눈물샘이 귀밑샘에 비해 약간 크기가 작은 것이 관찰되었다(Fig. 1C). 적출 후 각 군별로 눈물샘 10개 를 얻을 수 있었고, 광학 현미경(Stemi 2000-CS, Zeiss, German)으로 1 mm 간격의 눈금자와 함께 사진촬영을 하 였다. 사진상에서 눈물샘의 세로 및 가로 길이를 측정하였 고 두 값을 곱한 것을 눈물샘 크기 측정치로 정하였다.

TUNEL 염색

채취한 눈물샘 조직은 10% 포르말린에 고정하고 파라핀 에 포매하여 블록을 제작한 후 약 4 μm로 절편하여 Xylene 에서 탈파라핀화 시킨 후 95%, 90%, 80%, 70%의 에탄올 순으로 각각 3분씩 세척하고 PBS에 5분간 세척하였다. 20 μg/mL의 proteinase K를 슬라이드 위에 떨어뜨리고 37℃에 서 10분간 기다린 후 TBS buffer로 10분간 세척하였다. 10 분간 중화버퍼를 조직 위에 떨어뜨리고 상온에서 10분 동 안 배양 후, Working strength TdT를 37℃에서 2시간 동안 apply 하였다. 20분 동안 상온에서 증류수로 세척한 후 다 시 10분 동안 TBS buffer 세척을 시행하였다. 두 방울의 Anti Digoxigenin-Alkaline Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH.

Penzberg. Germany, 1:100)를 상온에서 30분 동안 처리한 후 TBS buffer washing을 10분간 시행하였다. NBT/ BCIP

(PIERCE, Illinois, USA)를 이용하여 염색 후 0.1% Nuclear fast red로 대조 염색을 시행하였다. 100-400배 시야에서 양 성으로 염색된 세포들의 수를 광학현미경(Olympus BX51, Japan)으로 계측하였다.

투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy) 촬영 0.1 M Phosphate buffer (pH 7.4)로 조정한 Karnovsky’s fixative로 6시간 이상 전 고정(pre-fixation)한 후 0.1 M Phosphate butter로 2시간 수세(washing)하고, 1% OsO4 (0.1 M phosphate buffer로 만듦)로 2시간 후 고정(post-fixation) 하였다. 고정된 시료는 0.1 M phosphate buffer로 10분간 수 세 후, 탈수과정을 거친 후 Propylene oxide에 10분간 치환 (infiltration)하였다. 이어서 EPON mixture (EPON 812, MNA, DDSA, DMP30)와 Propylene oxide를 1:1 Mix하여 Overnight (약 18시간 정도)한 후 샘플을 포매(Embedding) 하여 EM oven에서 overnight시켰다. Ultra-microtome (Leica ultracut UCT, Austria)을 이용하여 조직을 300-400 nm 두께 로 semi thin section하고, 1% Toluidin blue로 stain하여 광 학현미경으로 관찰하였다. 전자현미경으로 관찰하고자 하 는 부위를 정하고 retrimming과정을 거쳐 Diamond Knife (Diatome)를 이용하여 80 nm 정도 두께로 thin section하였 다. Thin section한 절편을 Copper grid에 올려놓고 6% Uranyl acetate와 Lead citrate로 Double stain을 한 후 Transmission Electron Microscope (TEM: JEM-1011, JEOL, Japan/

MegaviewⅢ) 80 Kv로 관찰하였다.

Image J (NIH, Bethesda, MD, USA)를 통한 분석 투과전자현미경 사진은 흑백으로 촬영되었다. 이에 사진 의 전체적인 명도 및 채도가 어둡게 나와 소포체강 내 밀도 가 증가한 것처럼 보일 수 있는 가능성을 배제하기 위해 Image J를 통한 분석을 시행하였다. 사진에서 핵 내의 가장 어두운 부분의 gray scale을 측정하고, 소포체 내강 내 부위 를 무작위적으로 5군데를 선정하여 gray scale의 평균을 측 정하였다. 측정한 평균값과 핵 내의 gray scale의 비율을 구 하여 비교하였다.

Statistics

측정치 비교는 independent samples t-test를 이용하여 비 교하였고, 모든 통계분석은 SPSS (version 18.0, software for Windows; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였으 며, p<0.05를 통계적으로 의미 있다고 취급하였다.

결 과

(4)

Normal

Dry eye

Figure 2. Comparison of lacrimal gland size between normal and dry eye (DE) induced mice. The size of the lacrimal

gland of DE induced mice was decreased significantly comparing to the normal mouse lacrimal gland (LG). The blood vessels were decreased on surface taking on pallor in the DE induced LG comparing to the normal mouse LG. Width and height were measured for determination of LG size. The width by height was averaged and compared (Table 1).

Normal

Dry eye

Figure 3. Determination of apoptosis in dry eye (DE) induced lacrimal gland (LG) with Terminal deoxynucleotidyl transferase

dUTP Nick End Labeling (TUNEL) staining. TUNEL staining of lacrimal gland in the DE induced mice showing no difference compared to the lacrimal gland of normal mice (left: ×40, right: ×100).

(5)

Normal Dry eye

Figure 4. Comparison of lacrimal gland cellular structure between normal mice and dry eye (DE) induced

mice under Transmission Electron Microscopy (TEM). [Normal (A) (×104), normal (B) (×2 ×104), dry eye (A) (×104), dry eye (B) (×2 ×104)]. Arrow shows normal mitochondrial structure and arrow head shows normal the endoplasmic reticulum (ER) lumen in normal (A) and normal (B). In dry eye induced lacrimal glands, cristae structure of the mitochondria was destructed (arrow) and vacuoles were increased (arrow head) in dry eye (A). In dry eye (B), ER lumen was elongated and surrounding cell organelles (arrow) and ER lumen density was increased and the lumen was dilated (arrow head).

Table 1. Comparison of lacrimal gland size between normal mice and dry eye induced mice

Normal Dry eye p-value

Average of size (mm2) 8.42 ± 2.06 4.70 ± 0.97 <0.001*

Values are presented as mean ± SD.

*Independent samples t-test.

2주간 사육 후 10마리 모두 생존하였으며, 해부 전 측정 한 몸무게는 평균 20 g에서 편차 2 g 내외로 실험 전과 비 교하여 몸무게의 유의한 증감은 없었다. 정상 마우스의 눈 물샘과 건성안 유발 마우스의 눈물샘을 육안상으로 관찰했 을 때, 건성안 유발 마우스의 눈물샘의 크기가 현저히 감소 하였으며 눈물샘 표면의 혈관이 정상에 비해 감소하였다 (Fig. 2). 눈물샘의 크기는 정상에서 8.42 ± 2.06 mm2, 건성 안 유발 마우스에서 4.70 ± 0.97 mm2 (p<0.001)로 두 군 간 에 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(Table 1). TUNEL 염색 시행 시 정상 마우스의 눈물샘 선세포와 비교하여 건 성안 유발 마우스의 눈물샘 선세포에서 TUNEL Staining은

유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 3). 투과전자현미경 촬영 시 건성안 유발 마우스의 눈물샘 선세포에서 정상 대조군 과 비교하였을 때, 소포체 내강 내 밀도가 증가하였고 내강 이 확장되는 것을 관찰할 수 있었다. 정상군에서는 미토콘 드리아의 구조가 유지되며 내막(cristae) 구조가 뚜렷하게 관찰되지만 건성안 유발 마우스에서는 미토콘드리아의 내 막 구조 파괴와 팽창(swelling)이 관찰되었다. 건성안 유발 마우스의 눈물샘 선세포에서 소포체 내강이 연장되어 이중 내강(double lumen) 구조를 형성하며 세포소기관 주변을 둘러싸는 모습이 관찰되며 세포소기관이 탐식되어 생긴 공 포(vacuole)가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 투

A

B

(6)

Table 2. Comparison of gray scale ratio between normal mice and dry eye induced mice with image J

Normal Dry eye p-value

Ratio the endoplasmic reticulum (ER)/Nucleus 7.43 ± 0.64 5.76 ± 0.30 <0.001*

Values are presented as mean ± SD.

*Independent samples t-test.

Normal Dry eye

Figure 5. Comparison of the endoplasmic reticulum (ER) lumen density between normal mice and dry eye

(DE) induced mice using gray scale measure of image J program. Five spots were selected randomly in ER lumen (black stars). The darkest spot was selected in the nucleus (yellow star). Gray scales were measured at each spots by using Image J. Table 2 shows ratio between average ER lumen gray scale and nucleus gray scale.

과전자현미경 사진에서 소포체강 내 밀도를 객관적으로 정 량화하기 위해서 시행한 Image J 분석 결과, 소포체 내강과 핵의 Gray scale 비율을 비교하였을 때 정상군은 7.43 ± 0.64, 건성안 유발군은 5.76 ± 0.30으로 건성안 유발 마우스 의 눈물샘에서 소포체강 내 밀도가 통계적으로 유의하게 (p<0.001) 증가한 것을 알 수 있었다(Fig. 5, Table 2).

고 찰

본 연구에서는 정상군과 비교하여 건성안 유발 마우스의 눈물샘 크기가 감소하며 표면의 혈관이 감소하는 것이 관 찰되었다. TUNEL 염색 결과 건성안의 눈물샘 선세포에서 음성 소견을 보였으며 이것은 건성안 눈물샘 선세포에서 세포자멸사(Apoptosis)가 일어나지 않는다는 것을 의미한 다. 투과전자현미경 관찰 결과 정상군과 비교하여 건성안 유발 마우스에서는 현저하게 소포체내강의 밀도가 증가하 였으며 소포체내강이 확장되는 모습이 관찰되었다. 또한, 소포체뿐만 아니라 미토콘드리아의 내막 구조의 파괴와 팽 창이 관찰되었으며, 세포소기관 주위로 소포체가 연장되어 세포소기관을 둘러싸는 것이 관찰되었으며, 공포(Vacuole) 의 수가 증가하는 것이 관찰되었다.

이러한 변화는 기존 연구에서 세포 내에서 소포체 스트 레스와 자가포식현상이 일어난다는 증거로 알려졌다.8-10 이 는 마우스의 눈물샘에서 건성안 자극에 의해 소포체 스트 레스와 자가포식현상이 일어난다는 것을 의미한다. 지금까 지 건성안 연구에서 건성안 자극에 의한 눈물샘의 변화를 세포수준에서 관찰한 연구는 없었으며, 본 연구의 결과가 최초의 보고이다. 이는 건성안의 눈물샘 기능저하의 병인 이 될 수 있으며 이는 건성안 치료의 새로운 목표점이 될 수 있다.

기존 다른 장기 세포에서는 스트레스가 심해질 경우 소 포체 스트레스가 세포자멸사(Apoptosis)를 유발한다고 알 려졌다.4 하지만 건성안 유발 눈물샘에서는 정상에 비하여 세포자멸사의 유의한 증가는 보이지 않았다. 이것은 건성 안에서 눈물샘 크기 감소가 세포 자살로 인한 세포 수 감소 보다는 자가포식현상에 의한 세포 크기의 감소에 의한 것 임을 의미한다. 또한 이것은 기존의 소포체 스트레스-자가 포식현상-세포자멸사의 경로와 차별화되는 점이다. 이는 눈물샘의 밝혀지지 않은 어떤 인자가 눈물샘 선세포에서 세포자멸사가 일어나는 것을 억제하고 있다는 것을 의미한 다. 이 인자는 건성안에서 눈물샘 기능 저하에 중요한 역할 을 할 것이라 생각한다.

(7)

건성안에서 소포체 스트레스를 유발시키는 일차적인 원 인에 대한 고찰이 필요하다. 본 연구에서 건성안 유발 시 눈물샘 표면의 혈관이 줄어드는 점을 고려할 때, 기존에 밝 혀진 요인 중에서 가장 가능성이 높은 것은 산화 스트레스 (Oxidative stress)이다. Uchino et al11에 의하면 연령 관련 되어 생기는 눈물샘의 기능저하의 주 요인은 산화 스트레 스이며 이 점을 이용해 새로운 건성안 마우스 모델을 제시 하였다. 이 연구 결과에 의하면 Mev-1 유전자의 발현을 눈 물샘에서만 억제되도록 조작한 마우스 모델에서 산화 스트 레스로 인하여 눈물샘에 염증세포가 침윤되고 섬유화가 일 어나는 것이 관찰되었다. 또한 이러한 조직학적 변화는 눈 물 분비 저하로 귀결되었다. 하지만 본 연구에서는 눈물샘 의 염증세포 침윤 및 섬유화 등은 관찰되지 않았다. 본 연구 에서는 유전적 조작 없이, 건조한 환경을 통해 건성안을 유 발하였고 이것은 실제로 사람에서 건성안이 유발되는 환경과 더 흡사한 마우스 모델이라고 볼 수 있다. 따라서 본 저자들 은 건성안에서 눈물샘 변화의 원인이 Uchino et al11의 건성 안 마우스 모델에서와 같이 산화 스트레스일 수 있지만, 실 제로 건성안에서 눈물샘 기능이 저하되는 기전은 Uchino et al11이 제시한 것과는 다를 가능성이 높다고 생각하였다.

이 연구에서 주목해야 할 점은 Ocular surface에 대한 건 성안 자극이 눈물샘의 변화를 일으켰다는 것이다. 세포에 서 소포체 스트레스를 일으킬 수 있는 자극은 산소 부족, 영양분의 부족 등 여러 가지 스트레스 요인이 알려졌다.3 위 실험결과로부터 안구표면의 자극을 눈물샘으로 전달하 는 경로가 있어서 눈물샘 선세포에 소포체 스트레스를 일 으킬 수 있는 자극을 유발했다는 것을 알 수 있다. Situ and Simpson12에 의하면 각막 표면에 대한 기계적인 자극이 눈 물 기능 단위(Lacrimal functional unit)의 눈물 분비를 증가 시킬 수 있으며 이는 신경 전달에 의해 이루어진다. 같은 원리로 건성안에서 이러한 신경전달을 통해 눈물샘 선세포 의 소포체 스트레스를 일으켰을 가능성이 크다. 이러한 신 경전달물질의 경로가 밝혀진다면 건성안의 초기에 안구표 면의 자극에 따른 눈물샘의 만성적인 기능저하를 억제하는 데 이용될 수 있고, 따라서 건성안 환자가 느끼는 만성적인 이물감 및 통증을 치료할 수 있을 것이다.

본 연구는 한계점으로는 개체수가 적고, 또한 세포수준에서 일어나는 변화에 대하여 ER stress marker (p-PERK, eIF2α, CHOP 등) 및 Autophagy marker (LC3 등)에 대한 immunoblot 또는 quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 등의 분 자생물학적인 증명이 필요하다는 점 등이 있다. 또한 본 연 구는 동물 모델을 대상으로 하였으며, 임상적으로 실제 건 성안 환자에서도 위와 같은 변화가 일어나는지 여부에 대

해서도 향후 추가 연구가 필요한 부분이다.

건성안은 눈물 기능 단위에 영향을 주는 여러 요인들이 관 련된 복합적인 질병이다. Yun et al13에 의하면 우리나라 대 학생만을 대상으로 한 연구에서도 건성안 유병률은 50.6%

임에도 불구하고 건성안에 대한 근본적인 치료는 현재 어 려운 상태이다. 향후 고령인구가 증가함에 따라 건성안 유 병률은 더욱 증가할 것이며 그에 따라 치료에 대한 수요는 더욱 늘어날 것이라고 전망한다. 이에 건성안을 근본적으 로 해결할 수 있고 만성적인 경과를 예방할 수 있는 병인에 대한 연구가 필요하다.

REFERENCES

1) Stern ME, Gao J, Siemasko KF, et al. The role of the lacrimal func- tional unit in the pathophysiology of dry eye. Exp Eye Res 2004;

78:409-16.

2) Hirayama M, Ogawa M, Oshima M, et al. Functional lacrimal gland regeneration by transplantation of a bioengineered organ germ. Nat Commun 2013;4:2497.

3) Zhang K, Kaufman RJ. The unfolded protein response: a stress sig- naling pathway critical for health and disease. Neurology 2006;

66:S102-9.

4) Cheng Y, Yang JM. Survival and death of endoplasmic-retic- ulum-stressed cells: Role of autophagy. World J Biol Chem 2011;

2:226-31.

5) Xu C, Bailly-Maitre B, Reed JC. Endoplasmic reticulum stress:

cell life and death decisions. J Clin Invest 2005;115:2656-64.

6) Quan W, Jo EK, Lee MS. Role of pancreatic beta-cell death and in- flammation in diabetes. Diabetes Obes Metab 2013;15 Suppl 3:141-51.

7) Fonseca AC, Ferreiro E, Oliveira CR, et al. Activation of the endo- plasmic reticulum stress response by the amyloid-beta 1-40 pep- tide in brain endothelial cells. Biochim Biophys Acta 2013;1832:

2191-203.

8) Deng S, Wang M, Yan Z, et al. Autophagy in retinal ganglion cells in a rhesus monkey chronic hypertensive glaucoma model. PLoS One 2013;8:e77100.

9) Yung HW, Korolchuk S, Tolkovsky AM, et al. Endoplasmic retic- ulum stress exacerbates ischemia-reperfusion-induced apoptosis through attenuation of Akt protein synthesis in human choriocarci- noma cells. FASEB J 2007;21:872-84.

10) Akamatsu K, Shibata MA, Ito Y, et al. Riluzole induces apoptotic cell death in human prostate cancer cells via endoplasmic retic- ulum stress. Anticancer Res 2009;29:2195-204.

11) Uchino Y, Kawakita T, Ishii T, et al. A new mouse model of dry eye disease: oxidative stress affects functional decline in the lacrimal gland. Cornea 2012;31 Suppl 1:S63-7.

12) Situ P, Simpson TL. Interaction of corneal nociceptive stimulation and lacrimal secretion. Invest Ophthalmol Vis Sci 2010;51:5640-5.

13) Yun CM, Kang SY, Kim HM, Song JS. Prevalence of dry eye dis- ease among university students. J Korean Ophthalmol Soc 2012;

53:505-9.

(8)

= 국문초록 =

투과전자현미경을 이용하여 관찰한 건성안 유발 마우스 눈물샘 선세포의 변화

목적: 건성안 유발 마우스에서 일어나는 눈물샘 선세포의 변화를 투과전자현미경을 이용하여 관찰함으로써 건성안의 병인을 규명하고 자 하였다.

대상과 방법: 습도 20% 이하의 controlled environment chamber에서 2주간 키운 5마리의 C57BL/6 마우스의 눈물샘 조직을 채취하였 다. 육안적 조직의 크기 및 투과전자현미경을 이용한 세포단위의 변화를 정상군과 비교하였으며, 추출한 이미지를 Image J 프로그램 을 이용하여 분석하였다.

결과: 정상군에 비해 건성안 유발 마우스 눈물샘의 육안적 크기가 유의하게 감소하였다. 눈물샘 조직을 고정하여 TUNEL염색을 시행 한 결과, 음성 소견을 보였다. 투과전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 소포체 내강 확장 및 내부 밀도 증가, 미토콘드리아 구조 파괴, 세포소기관을 감싸는 이중내강구조, 액포의 증가 등이 관찰되었다.

결론: 안구 표면의 건성 자극으로 인하여 마우스 모델의 눈물샘 선세포에서 소포체 스트레스(ER stress) 및 자가포식현상(Autophagy) 이 일어남을 확인하였다. 하지만 이는 세포자멸사의 과정으로까지 진행되지는 않았다. 이러한 세포단위의 변화는 만성적인 눈물분비 감소를 호소하는 실제 비쇼그렌증후군 건성안 환자의 중요한 병인으로 생각한다.

<대한안과학회지 2014;55(8):1187-1194>

수치

Figure 1. Dissection of lacrimal gland in mice. (A) After mak- mak-ing an incision as V-shaped from the inferolateral side of the  ear to ramus of mandibule on the skin, we dissected a  subcuta-neous tissue along the incision line
Figure 2. Comparison of lacrimal gland size between normal and dry eye (DE) induced mice
Figure 4. Comparison of lacrimal gland cellular structure between normal mice and dry eye (DE) induced  mice under Transmission Electron Microscopy (TEM)
Table 2. Comparison of gray scale ratio between normal mice and dry eye induced mice with image J

참조

관련 문서

1 John Owen, Justification by Faith Alone, in The Works of John Owen, ed. John Bolt, trans. Scott Clark, &#34;Do This and Live: Christ's Active Obedience as the

That is, the dry powder of the sludge wastes, generated during the decommissioning of nuclear power plants, were compacted, and a study, focused on

At P10, electron microscopic observations of BDNF-IR Purkinje cells revealed numerous short segments of rough endoplasmic reticulum (rER), many of which showed

Comparison of pain scale between the conventional and 2-step needle insertion technique according to the injection area ··· 11... The combination of pain scale and

The present study was designed to investigate the role in intracellular calcium mobilization of two representative endoplasmic reticulum (ER) proteins, STIM1

Glutamate excitotoxicity induced by excessive activation of NMDA receptor causes various damage to cells, which leads to cell death.. In previous studies, increased ROS

The object of this paper is to examine resistance against the ruling ideology as a means of true survival in the novel Cat’s Eye by the iconic

Chapter IV describes the cases of using classical Korean literature and their problems. The five present textbooks for Korean education were selected and