pISSN: 0378-6471 eISSN: 2092-9374
DOI : 10.3341/jkos.2010.51.4.588
= 증례보고 =
콘택트렌즈 착용시 사용하는 인공누액이 인체각막상피세포에 미치는 영향
김수진⋅김경호⋅이지은⋅이종수 부산대학교 의학전문대학원 안과학교실
목적: 임상에서 콘택트렌즈 착용자들에게서 사용되는 인공누액들이 각막상피세포에 미치는 영향을 비교하고자 하였다.
대상과 방법: 배양된 인체의 각막상피세포에 아이리스Ⓡ, 아이리스플러스Ⓡ, 아이미루콘택트퓨어Ⓡ, 아이투오Ⓡ를 각 농도별로 접촉시킨 후 MTT분석법을 사용하여 세포의 대사활동능력을 측정하고, 창상회복능력을 비교하였다. 세포독성을 비교하고자 젖산탈수소효소 (LDH)의 역가를 측정하고, 약제의 구성성분을 분석하였으며, 각막상피세포의 형태학적 변화를 광학 및 전자현미경으로 관찰하였다.
결과: MTT 분석결과 아이리스Ⓡ 에서 세포 대사활성도가 유의하게 감소하였다. LDH 역가는 아이리스Ⓡ의 경우 1시간부터 급격히 증가 하는 양상을 보였으며, 나머지 3 약제는 대조군과 유사하게 낮은 농도를 유지하였다. 아이리스Ⓡ 에서는 세포의 이주현상을 관찰할 수 없었고, 핵막주변부의 핵질 농축과 세포질내 구조물의 확대소견 등 세포의 손상 정도가 심하게 나타났다.
결론: 콘택트렌즈 착용 중에 사용되는 네 가지 인공누액 중 각막상피세포에 미치는 손상의 정도는 아이리스플러스Ⓡ, 아이미루콘택트 퓨어Ⓡ, 아이투오Ⓡ 보다 아이리스Ⓡ가 크게 나타났다.
<대한안과학회지 2010;51(4):588-597>
￭ 접 수 일: 2009년 7월 2일 ￭ 심사통과일: 2010년 2월 4일
￭ 책 임 저 자: 이 종 수
부산광역시 서구 아미동 1-10 부산대학교병원 안과
Tel: 051-240-7323, Fax: 051-242-7341 E-mail: [email protected]
* 이 연구는 2009년도 부산대학교 발전재단 목적기금(삼천당제약)에 의해 이루어졌음.
콘택트렌즈를 착용하면 각막의 저산소증, 눈물양의 감소, BUT 의 감소, 렌즈와 안구표면의 물리학적 관계, 렌즈의 탈수 현상, 혈관 확장에 따른 안구 표면 온도 상승으로 인 하여 안구건조증이 발생할 수 있는데1-4, 연성콘택트렌즈를 착용한 상태에서 안약을 결막낭에 점안하면 안약의 성분이 콘택트렌즈에 흡수되어 안구내로 약물의 운반을 증가시키 고5,6, 원하지 않는 약제 부작용의 유병율이 증가하거나 렌 즈를 변형시킬 수 있다.7따라서, 임상에서는 콘택트렌즈 착 용 시에 인공누액 사용을 권장하지 않고 있는데, 일부 제약 회사에서는 콘택트렌즈를 착용한 상태에서도 사용가능한 인공누액을 제품화하여 시판하고 있는 실정으로 많은 환자 들이 처방 없이 사용하고 있다. 그러나 현재 국내에서 시판 되어 사용되고 있는 약품들이 각막상피세포에 미치는 영향 에 대한 연구는 거의 없다.
이에 저자들은 콘택트렌즈를 착용한 상태에서 사용가능 한 인공누액으로 시판되고 있는 아이리스®(hydroxyprop-
ylmethylcellulose, Samchundang, Seoul, Korea), 아이리 스플러스®(hydroxypropylmethylcellulose, Samchundang, Seoul, Korea), 아이미루콘택트퓨어®(chondroitin sodium sulfate, CJ, Seoul, Korea), 아이투오®(povidone, Samil, Seoul, Korea)의 각막상피세포에 미치는 영향 및 독성 효과를 관 찰하고자 MTT 분석법을 사용한 세포의 대사력 측정, 염증 성 사이토카인의 생성 여부, 젖산탈수소효소 분석법(LDH leakage essay)를 각각 시도하고, 각막상피세포의 형태학 적 변화를 광학현미경 및 전자현미경으로 관찰하였다.
대상과 방법
세포배양과 처치
각막이식에 필요한 공여각막을 사용하고 남은 주변부의 각막조직을 이용하여 각막상피와 각막실질을 Ca2+, Mg2+
가 함유되지 않은 1 unit/ml Dispase II (Boehringer Ma- nnheim,Germany)에 담그어 37℃배양기에 1시간 처리하 여 각막상피세포를 분리한 다음 5분간 1000 분당 회전수 (revolutions per minute, rpm)에서 원심 분리하였다. 세포 침전물을 배양액으로 부유시켜 세포를 모은 후 35 mm 크 기의 조직배양접시(Corning Incorporated, Corning, NY)로 옮겨 95% air-5% CO2가 공급되는 37℃배양기에서 일차 배양하였다. Dulbecco's modified Eagel's medium (DMEM:
Gibco BRL, Rockville, MD)에 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL, Rockville, MD), 20 ng/ml epidermal growth factor (Gibco BRL, Rockville, MD), 100 units/ml penicillin (Gibco BRL, Rockville, MD) 및 100 μg/ mg streptomycin (Gibco BRL, Rockville, MD)을 첨가한 세포 배양액을 2∼3일 간격으로 교체하여 세포가 합류 (confluent growth)되었을 때 배양배지를 완전히 제거한 후Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS: Gibco BRL, Rockville, MD)로 1회 세척하고 0.25% trypsin- 0.002% EDTA를 처리하여 세포를 분리하였다. 세포가 배 양접시에서 완전히 이탈되면, 새로운 조직배양접시에 분리 된 세포가 포함된 배양액을 약 1 cc 넣고 신선한 배양액을 약 2 cc 첨가시켜 세포를 재 배양시켰다. Coulter counter로 세포수를 측정하여 배양액에 각막상피세포 5×103 cell/ml 이 되도록 부유 시킨 다음, 96 well plate에 200 μL씩 심은 후 37℃, 5% CO2-95% air의 배양기에서 다시 배양시켰는 데, 이때 세포수가 너무 빽빽할 경우 각 약물에 의한 영향 이 적을 수 있으므로 배지에서 각막상피세포가 80∼90%
정도 성장할 때까지 4∼5일 정도 배양시켰다.
MTT 분석법을 사용한 세포의 대사 활성도 측정
세포의 대사능력을 측정하기 위해 calorimetric assay를 이용하여 세포내에 존재하는 formazan 화합물의 흡광도를 측정하여 세포 증식억제력을 비교하였다. 세포의 대사능력을 측정하기 위해 MTT solution (3-[4,5-Dimethylthiazol -2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma, St.
Louis, MO)를 이용한 분석법을 사용하였는데, 노란색의 tetrazolium salt가 세포내 미토콘드리아 효소에 의해 청색 의 formazan 화합물로 바뀌는 원리를 이용한 것으로, 생존 하고 있는 세포 즉 대사작용이 왕성한 세포를 흡광도를 이 용해서 측정하는 방법이다.6
Subconfluence에 도달한 cell을 Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS: Giboco BRL, Rockville, MD)로 1회 세척한 후 인공누액 네 가지를 1시간, 4시간, 12시간 동안 각막상피세포와 접촉시킨 후 다시 D-PBS로 1회 세 척한 다음 배지를 넣어 주었다. 약물처리 후 24시간 정도 세포 배양기에 넣어 배양한 다음 MTT assay를 실시하였 다. 약제의 효능을 비교하기 위해 대조군으로는 Balanced salt solution (BSS)를 사용하였고, Dulbecco's modified Eagles's medium 배지(DMEM: Giboco BRL, Rockville, MD)를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 세포를 배양하여 세포대사능력을 측정하였다.
세포의 흡광도를 측정하기 위해 5 mg의 MTT solution
을 PBS 1 mL에 녹인 후 0.2 μL syringe filter로 거른 다음 DMEM 배지로 10배 희석하여 사용하였다. 상층의 배양액 을 140 μL 정도 제거한 후 MTT solution을 100 μL 첨가하 여 알루미늄 호일로 plate를 가린 후 37℃에서 4시간 반응 시켰다. 다시 상층액을 110 μL 제거한 후 DMSO (Dimethyl sulfoxide: Sigma, Cat. D-5869, St. Louis, MO)를 100 μL 넣어 실온에서 20분간 흔들어 혼합시키고 ELISA reader (Moleculae Devices, Sunnyvale, CA)로 570 nm에서 흡광 도를 측정하였다.
이러한 과정들을 3회 반복하여 각 농도와 노출 시간별로 측정된 흡광도의 평균을 구하여 각 세포의 생존율을 구하 였는데, 세포 생존율은 각 칸의 흡광도 수치를 대조군칸의 흡광도 수치로 나눈 백분율 즉, 세포의 생존율(%)=각 칸 의 흡광도/대조군칸의 흡광도 ×100으로 나타냈고, 상기의 실험은 각 농도별로 3번씩 시도하여 각 군과의 통계학적 유 의성을 비교하였다(Student’s t test, p<0.05).
약제에 따른 세포의 창상 회복 정도 검사
인공누액에 노출 시 세포의 창상 회복 정도를 관찰하기 위해서 배양액에 각막상피세포를 각각 5×103 cell/well이 되도록 부유시킨 다음 6 well plate에 500 μL 씩 분seeding 한 후 37℃, 5% CO2-95% air의 배양기에서 4~5일 정도 배양하였다. Subconfluence에 도달한 배지에 pipet tip으로 scartch를 낸 후, 상층의 배지를 제거하고, 네 가지 약제를 20% 비율로 접촉시킨 후 역상 광학 현미경(Inverted phase- contrast light microscope)으로 즉시, 7시간, 24시간 후 세 포가 scratch낸 부분으로 자라 들어오는 정도를 관찰하였다.
젖산탈수효소(lactate dehydrogenase, LDH) 분석법을 이용한 약제의 독성 비교
네 가지 인공누액을 96 well 배지의 전체양 200 μL에서 각각 10, 20, 30% 농도가 되도록 배지액에 넣은 후 각각 1시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 접촉시켰다. 약 물에 노출 된 후 세포질에서 유리된 LDH양을 37˚C 온도의 암순응상태에서 ELISA reader (Moleculae Devices, Sunn- yvale, CA)를 이용하여 측정하였고, 대조군으로는 평형염 액(Balanced salt solution)을 처리하여 490nm의 파장에서 각각의 파장을 측정하여 노출시간에 따른 농도의 차이를 비교하였다. 모든 실험군과 대조군은 각각 10개의 배양된 각막상피세포를 대상으로 실험을 하였으며, 평균 LDH 역 가를 산출하여 대조군과의 통계학적인 비교를 하였다. 유의 수준은 95% 수준이었고, ANOVA 검사법을 사용하였다.
MTT at 1 hour
MTT at 4 hour
MTT at 12 hour
Figure 1.The absorption rate of the water-insolubale formazan dye in corneal epithelial cell exposed in four artificial tear drops by a scanning spectrometer (ELISA reader) (*p<0.05).
인공누액의 구성성분 비교
네 가지 인공누액의 분석은 약제의 성분인 전해질 조성, pH, 삼투압 및 보존제를 각각 조사하여 약물간의 차이를 확 인하고자 하였다. 점안약을 sample tube에 담은 후 전해질 의 조성은 LX-20 (Beckman Coulter, Miami, FL), 삼투압 은 Micro sample Osmometer (Fiske Associates, Norwood, MA)를 이용하여 측정하였으며, pH는 Metrohn 780 (Metrohm Ltd., Herisau, Switzerland)을 사용하였다.
약제에 따른 세포의 형태학적 변화 관찰
인공누액에 노출 시 세포의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해서 배양액에 각막상피세포를 각각 5×103cell/ml이 되 도록 부유시킨 다음 6 well plate에 500 μL씩 분seeding 한 후 37℃, 5% CO2-95% air의 배양기에서 4~5일 정도 배 양하였다. Subconfluence에 도달한 세포를 네 가지 약제로 농도에 따라 약제를 각각 접촉시킨 후 역상 광학 현미경으 로 세포 형태를 관찰하였다.
또한 각막상피세포의 미세구조를 관찰하기 위하여, 위와 동일한 방법으로 처리한 후 24시간 배양 후 배양액을 제거 하고 각 군의 각막실질세포들은 0.1 M sodium cacodylate buffer로 씻어내고, 약 2시간 동안 Karnosky fixative (2%
paraformaldehyde, 2.5% glutaraldehyde, and 0.1M so- dium cacodylate buffer)에 고정시킨 후 0.1 M sodium cacodylate buffer로 3차례에 걸쳐 세척한 후 세포를 os- mium tetroxide로 고정시키고 계열 ethanol용액으로 탈수 한 후 Epon으로 포매하였다. 60~80 nm의 절편을 만들고 uranyl acetate와 lead citrate로 이중 염색시켜 투과전자현 미경(JEOL 1200EX, Tokyo, Japan)으로 세포의 미세구조 를 관찰하였다.
결 과
MTT 분석법을 사용한 세포의 대사력 비교
MTT분석에서의 결과를 보면 아이리스®점안약은 10%
농도로 약제 노출한 경우 4시간, 12시간 후 세포대사력이 의미있게 감소하였고, 20% 농도에서는 약제 노출 1시간째 부터 세포활성도가 감소하여 시간이 지날수록 감소폭이 더 욱 커져 12시간째는 대조군 세포활성도의 20% 정도로 감 소하였으며, 30% 비율로 접촉한 경우에는 약제 노출 1시간 째부터 현저한 세포대사력의 감소를 보였다. 아이리스플러 스®, 아이미루콘택트퓨어®, 아이투오®의 경우 약제 노출 1
시간, 4시간 후에는 10, 20, 30 % 각각에서 대조군과 비슷 한 세포대사활성도를 보였으나, 약제에 노출한 지 12시간 이 지나자 모든 농도에서 세포활성도의 감소를 보였으나, 통계학적인 의미는 없었다(Fig. 1).
약제에 따른 세포의 창상 회복 정도 검사
Scratch assay 결과를 보면 대조군과 아이리스플러스®, 아이미루콘택트퓨어®, 아이투오®의 경우 24시간이 지나면 정상각막상피세포가 창상 부위로 증식, 이주하여 창상회복 이 이루어짐을 알 수 있었고(Fig. 2A, C, D, E), 아이리스®
A1 A2 A3
B1 B2 B3
C1 C2 C3
D1 D2 D3
E1 E2 E3
0 hour 7 hour 24 hour
Figure 2. Scratch assay of corneal epithelial cells after 0-hour exposure to (A1) control (B1) 20% Iris®, (C1) Irisplus®, (D1) Eyemiru contactpure®, (E1) Eye2O®, 7-hour exposure to (A2) control (B2) 20% Iris®, (C2) Irisplus®, (D2) Eyemiru contactpure®, (E2) Eye2O®, 24-hour exposure to (A3) control (B3) 20% Iris®, (C3) Irisplus®, (D3) Eyemiru contactpure®and (E3) Eye2O®. In control group (A), normal corneal epithelial cells were proliferated and moved into scratched scar in the culture medium. After exposure to Iris® (B), corneal epithelial cells were not proliferated and moved into scratched scar in the culture medium.
LDH titer at 1 hour
LDH titer at 4 hour
LDH titer at 24 hour LDH titer at 12 hour
Figure 3.LDH titers of cultured corneal epithelial cells exposed in four artificial tear drops. (*p<0.05).
의 경우 약제 노출 7시간 후 정상각막상피세포가 손상되면 서 세포의 이주 현상을 관찰할 수 없었다(Fig. 2B).
약제의 농도 및 노출시간에 따른 LDH Assay
각막상피세포에서 아이리스®점안액에 10% 비율로 노출 한 경우 4시간째부터 세포외로 유리된 LDH 수치가 급격히 증가하였고, 12시간에 최고조를 보이다가 24시간까지 유지 되는 양상을 보였다. 20%, 30%, 50% 비율로 노출한 경우 1시간 후부터 LDH 수치가 증가하여 4시간째 최고치에 달 하고 24시간까지 지속되는 양상을 보였으며, 100% 비율의 약제에 노출한 경우 1시간째부터 급격히 증가하고4시간까 지 유지되다가 12시간째 최고조를 보였다. 대조군의 LDH 역가에 비해 아이리스 점안액의 농도가 높을수록 노출시간 이 길수록 LDH 역가가 증가하여, 최고 4.0까지 기록되었으 나, 100% 농도는 오히려 50% 보다 LDH 역가가 낮았다 (Fig. 2). 반면 아이리스플러스®, 아이미루콘택트퓨어®, 아 이투오®의 경우 대조군의 LDH 역가와 비슷하게 유지되었 고, 아이리스플러스®의 경우 LDH 역가가 모든 농도에서 2.0 이하로 유지되었고, 아이미루콘택트퓨어®의 경우 2.5 이하로, 아이투오®의 경우 1.5이하로 유지되었다(Fig. 3).
약물간의 구성성분 비교
보존제로는 아이리스®에서는 벤잘코니움클로라이드(be- nazlkonium chloride, BAC)가 0.1 mg/ml로 함유되어 있었 으나, 아이리스플러스®, 아이미루콘택트퓨어®, 아이투오® 에서는 보존제가 첨가되어 있지 않았다. 전해질구성은 아이 투오®가 다른 3 약제에 비해 Na+, Cl-농도가 낮았고, pH는 아이미루콘택트퓨어®의 경우 7.0으로 중성에 가깝게 측정 되었으나, 나머지 세 약제에서는 산성으로 나타났다. 또한 삼투압은 아이리스® 296 mosm/kg, 아이리스플러스® 362 mosm/kg, 아이미루콘택트퓨어® 392 mosm/kg, 아이투오® 324 mosm/kg로 유의한 차이는 없었다(Table 1).
약제의 농도 및 노출시간에 따른 세포의 형태학적 비교
위상차 현미경에 의한 세포의 형태를 살펴보면, 대조군 의 경우 각막상피세포가 배지에 빽빽하게 분포하고 있었으 며(Fig. 4A), 인공누액을 각각 20% 농도로 4시간 접촉한 후 아이리스플러스®와 아이투오®의 경우 각막상피세포의 밀도는 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다(Fig. 4C, E). 반 면 아이미루콘택트퓨어®의 경우 세포의 밀도가 일부 감소 함을 볼 수 있었고(Fig. 4D), 아이리스®점안약의 경우 정
상각막상피세포의 밀도가 현저히 감소함을 알 수 있었다 (Fig. 4B).
대조군에서 각막상피세포의 전자현미경적 소견은 손상 이 없는 원형질막에 미세융모가 있으면서 세포질과 핵질의
A B C
D E
Figure 4. Inverted light micrographs of corneal epithelial cells after 4-hour exposure to (A) control, (B) Iris®, (C) Irisplus®, (D) Eyemiru contactpure®, and (E) Eye2O®.
Table 1.The ingredient, electrolyte composition, pH, osmolarity and preservatives of the commercial four artificial tear drops
Artificial tear Chief ingredient Na+
(mEq/L) K+
(mEq/L) Cl-
(mEq/L) pH Osmolarity (mosm/kg)
Preservative (mg/ml)
Iris® Hydroxypropylmethylcellulose 122.4 15.97 134.1 5.0 296 BAC 0.1
Irisplus® Chondroitin sodium sulfate, hydroxypropylmethylcellulose
91.4 9.19 87.2 6.5 362 0
Eyemiru contactpure®
Potassium 1-aspartate, aminoethyl sulfonic acid, chondroitin sodium sulfate
71.1 25.47 53.9 7.0 392 0
Eye2O® Povidone 28.7 19.36 46.2 5.0 320 0
분포가 균일하고 형태가 뚜렷하게 관찰되었으며, 세포질내 사립체(mitochondria) 나 과립세포질망(rough endoplas- mic reticulum, RER)의 미세한 확대 소견을 보였다(Fig.
5A). 20% 인공누액에 각각 4시간 접촉한 후에는 원형질막 의 미세융모가 감소하면서 세포질내 소공 형성 및 사립체 나 과립세포질망의 확대가 관찰되었다(Fig. 5B, C, D, E).
특히 아이리스®에서는 세포 손상의 정도가 심하게 관찰되 었고, 핵막주변부로의 핵질 농축과 세포질내 구조물의 심한 확대 소견을 관찰할 수 있었다(Fig. 5B).
고 찰
안구건조증은 눈물생성이 부족하거나 눈물막이 정상보 다 빠르게 소멸되어 눈물막이 불안정하게 되고 이에 따라 이물감이나 따가움 등 여러 가지 증상이 발생하는 증후군 이다. 특히, 콘택트렌즈 착용자의 경우 순목운동의 저하, 렌 즈의 불충분한 움직임, 부족한 눈물, 렌즈의 주변부 두께가 두꺼운 경우, 과도한 렌즈 가장자리들림 등의 이유로 3시,
9시 각막건조가 발생하며, 소프트렌즈의 표면으로부터 수 분이 증발하면서 렌즈 뒤쪽과 각막 사이의 눈물이 렌즈 내 로 흡수되면서 각막 표면이 탈수가 되는 소프트렌즈 건성 안이 발생할 수 있다.8 이 때 기본적으로 1차적인 치료는 인 공누액을 점안하는 것이지만, 콘택트렌즈를 착용한 상태에 서 점안약을 사용할 경우, 안약의 성분이 렌즈에 흡수되어 렌즈를 변형시키거나, 약물의 흡수가 증가되거나 지연될 수 있어,5-7대부분의 인공 누액은 렌즈를 뺀 상태에서 점안할 것을 권유하고 있다. 다만 일부 약물은 콘택트렌즈를 착용 한 상태에서도 안전하게 점안할 수 있도록 개발되어 임상 에서 흔히 사용되고 있는데, 예를 들면 아이리스®, 아이리 스플러스®, 아이미루콘택트퓨어®, 아이투오®가 이에 해당 한다.
인공누액제 자체의 독성과 여러 보존제를 포함한 점안액 에 대한 연구는 다수 보고 되어 있는데, Berdy 등은90.02%
벤잘코니움클로라이드(benazlkonium chloride)가 함유된 인공누액제보다 보존제가 없는 인공 누액제인 Hypotears®, Refresh®에서 각막 상피세포의 독성이 적다고 보고하였고,
Figure 5.Transmission electron micrographs of corneal epithelial cells appeared after 4-hour exposure to (A) control, (B) 20% Iris®, (C) 20% Irisplus®, (D) 20%
Eyemiru contactpure®, and (E) 20% Eye2O®. (bar length 2 um, original magnification, ×2000~4000). In general, the plasma membrane with microvilli (black arrow head), nuclear membrane, and nuclei of conjunctival cells were visible. Iris®had more severe and damaged cellular str- uctures, such as the plasma membranes with microvilli being disrupted (white arrow head), well-developed vacuole formation (black arrow), and chromatin margination of the nucleus (white arrow), rather than IrisPlus®, Eyemiru contactpure®, Eye2O®.
A B
C D
E
본 연구에서도 아이리스®가 아이리스플러스®보다 각막상피 세포의 손상이 심하여 보존제의 영향력을 의심할 수 있었다.
Diebold et al10은 Carbomer gel formulation인 Lacrivisc®, Viscotear®가 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellul- ose)인 Celluvisc®, Cellufresh®보다 각막 세포에 더 많은 독성을 보고하였고, Dutot et al11은 보존제인 Polyhexa- methylene biguanide를 사용하여 시행한 연구에서 산화적 스트레스와 세포자멸사로 인해 세포의 독성을 나타낸다고 하였다.
본 연구에서 MTT 분석법을 통해 세포의 흡광도를 분석 한 결과 아이리스플러스®, 아이미루콘택트퓨어®및 아이투 어®의 경우 세포 대사활성도 감소가 대조군에 비해 적지만, 아이리스®는 노출시간이 길수록 약제의 비율이 높을수록 대사활성도가 점차 감소됨을 알 수 있었다.
Scratch assay는 배지에 생긴 창상부위로 정상 각막상피 세포가 자라 들어오는 세포의 창상 회복 능력을 보는 것인 데, 아이리스®의 경우 각막상피세포가 손상되면서 세포의 이주 현상을 관찰할 수 없었으나, 나머지 세 가지 약제에서 는 시간이 지나면서 정상각막상피세포가 창상 부위로 증식, 이주되는 모습을 보여, 정상적으로 세포의 손상 없이 창상 회복이 이루어짐을 알 수 있었다.
LDH 역가 분석 결과 아이리스플러스®, 아이미루콘택트 퓨어®, 아이투오®의 경우 대조군의 역가와 큰 차이를 보이 지 않아 세포 손상이 거의 일어나지 않음을 알 수 있었으나, 아이리스®의 경우 LDH 역가는 약제 노출 후 1시간 후부터 급격히 상승하기 시작하여, 12시간 후에는 모든 농도에서 최고값인 4.0으로 측정되었고, 나머지 세 가지 약제에 비해 역가가 유의하게 높았다. 이는 아이리스®의 경우 각막상피 세포의 변성과 손상이 더 심하다는 것을 보여준다.
임상적으로 사용되는 점안약은 장기간 사용하거나 과량 을 사용했을 때 안구 표면에 독성을 야기할 수 있는데, 그 요인으로는 약제의 전해질, pH, 삼투압, 보존제의 성분 등 이 있다. 특히 전해질과 삼투압이 안표면 세포의 기능 이상 을 야기하는 가장 중요한 요인으로 알려져 있다.12일반적 으로 점안약에 포함되어 있는 전해질은 Na+, Cl-, K+, Ca2+
등이 있는데, 본 연구에서 K+은 세포손상에 영향을 일으킬 정도의 차이를 보이지 않았다. Na+, Cl-의 경우 세포외액에 서 적정 농도는 각각 142~152.7 mEq/L, 104.0~117.4 mEq/L 이고13, Lee and Oum14에 의하면 낮은 농도의 Na+, Cl-이 각막실질세포 손상의 원인으로 간주되었다. 본 연구 에서는 아이리스®, 아이리스플러스®, 아이미루콘택트퓨어® 에 비해 아이투오®에서 Na+, Cl-이 낮은 농도를 보였지만 세포의 형태학적 변화는 손상이 적은 편이어서 다른 요인 들도 세포손상에 관여함을 짐작할 수 있어 보다 정밀한 관
찰 및 검사가 필요한 것으로 생각된다.
삼투압의 불균형 또한 세포 기능의 손상을 야기할 수 있 다. 일반적으로 세포에 손상을 주지 않는 삼투압은 260~
320 mosm/kg로 알려져 있는데15, 아이리스®, 아이투오®는 각각 296, 320 mosm/kg로 정상 범위였고, 아이리스플러스®, 아이미루콘택트퓨어®는 362, 392 mosm/kg로 약간 높은 삼투압을 보여 세포 손상에 영향을 줄 수 있을 것으로도 생 각된다. 세포외액의 pH 가 7.0~7.7 범위일 때 세포의 생명 현상이 유지되므로 점안약의 pH 도 세포의 손상에 영향을 미치는 요인으로 볼 수 있다.16 아이미루콘택트퓨어®의 경 우 다른 3가지 약제들과 달리 중성으로 나타나, 세포 손상 이 적은 이유가 되리라 생각한다.
점안약에는 세균의 성장을 억제하기 위해 보존제를 첨가 하는데, Benzalkomium chloride (BAC)가 가장 흔히 사용 되고 있다. BAC 는 세포막에서 친지질성 성분으로 존재하 면서 전해질이 세포내로 들어갈 수 있도록 세포막의 성질 을 바꾸어 세포내의 전해질 농도에 변화를 초래하여 세포 의 손상을 초래하며, 세포막에 작용하여 이온이나 물질의 투과성을 변화시켜 결막이나 각막의 세포조직에 독성을 초 래할 수 있다.17-20본 연구에서는 아이리스플러스®, 아이미 루콘택트퓨어®, 아이투오®의 경우 보존제가 첨가되어 있지 않아 아이리스®에 비해 세포 손상이 적은 이유로 생각된다.
아이미루콘택트퓨어®의 경우 방부제는 첨가되어 있지 않으 나, 아이리스플러스®, 아이투오®에 비해 비교적 높은 LDH 수치와 세포형태학적 손상이 많이 관찰되어, 높은 삼투압이 영향을 미쳤을 것으로 생각된다.
위상차현미경 상에서 대조군의 각막상피세포는 배지에 빽빽하게 밀집되어 있었다. 그러나 인공누액 점안약에 LDH 역가가 증가한 경우 많은 각막상피세포들이 배지에서 떨어져 나와 부풀고 둥근 모양으로 변해있었다. LDH 역가 가 높을수록 투시전자현미경상 많은 각막상피세포들이 손 상을 받아 세포막이 파괴되고 과립세포질망이 확장되며, 미 토콘드리아가 비대해진 모습을 보였으며, 미세융모가 소실 되고 크로마틴이 핵의 주변부로 몰리는 변화가 더욱 현저 하게 관찰되었다. 대조군에 비해 네 가지 약제 중에서 아이 리스®는 LDH 역가가 높을 뿐만 아니라 세포부종과 세포질 의 손상 및 핵의 변성 등이 보다 심하게 관찰되었으나, 아 이리스플러스®, 아이미루콘택트퓨어®, 아이투오®의 경우 각막상피세포의 손상이 경미하였다. 본 연구에서 살펴본 것 과 같이 현재 임상에서 콘택트렌즈 착용환자에서 사용되고 있는 인공누액 중에서 아이리스플러스®, 아이미루콘택트퓨 어®, 아이투오®는 각막상피세포에 미치는 독성이 적어 안전 하게 사용할 수 있을 것으로 생각되며, 이는 무방부제로 인 한 효과로 생각된다. 향후 방부제가 포함되지 않은 약제들
만을 대상으로 추가 연구가 필요할 것으로 생각되며, 안건 조증의 증상 개선에 대한 임상적 연구나 약제의 주성분 자 체의 약동학적 연구조사가 필요할 것이다. 또한 콘택트렌즈 착용이 약물의 흡수에 미치는 영향에 대한 연구가 시행되 어야 할 것으로 생각된다.
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=ABSTRACT=
Effect of Artificial Tears Used in Contact Lens-wearing Eyes on Human Corneal Epithelial Cells in Vitro
Su Jin Kim, MD, Kyong Ho Kim, MD, Ji Eun Lee, MD, PhD, Jong Soo Lee, MD, PhD
Department of Ophthalmology, Medical Research Institute, Pusan National University College of Medicine, Busan, Korea
Purpose: To investigate the biologic effects of topical ocular artificial tears used in patients wearing contact lens on in vitro corneal epithelial cells.
Methods: The efficacies of the topical artificial tears IrisⓇ, IrisplusⓇ, Eyemiru contact pureⓇ, and Eye2OⓇ were evaluated using the MTT and wound healing assays. Cell damage was determined using lactate dehydrogenase (LDH), and the solution in- gredients were analyzed. Cellular morphologies were examined by inverted light microscopy and transmission electromicroscopy.
Results: Metabolic activity of corneal epithelial cells, as determined by the MTT assay, decreased in the IrisⓇ eye drop group, but those of the other groups were similar to that of the control. The LDH titers increased up to one hour after IrisⓇ eye drop use, and the increased level was maintained for 24 hours. The other three artificial tears showed similar low LDH titers to that of the control. Cellular migration was not observed, although cellular damage to the corneal epithelial cells, such as chromatin margination and cytoplasmic organelle swelling, was prominent with IrisⓇ use.
Conclusions: Among four brands of topical artificial tear drops used among patients wearing contact lens, IrisⓇ caused mark- edly more severe damage to cultured human corneal epithelial cells than did IrisplusⓇ, Eyemiru contact pureⓇ, or Eye2OⓇ. J Korean Ophthalmol Soc 2010;51(4):588-597
Key Words: Artificial tear, Corneal epithelial cell toxicity, LDH, MTT
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