Estimation of Harvest Period and Cultivated Region of Commercial Green Tea by Pattern Recognition

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패턴인식법에 의한 시판 녹차의 산지 및 채엽시기 추정

주 홍매 - 김 정 숙 • 박경래 • 조 정 원 • 김 영 섬 * • 김 정 우 ** • 유시용*'부 • 강종성후 충남대 학교 약학대 학, *한국화학연구원, **배 재 대 학교 생 명 공학과 (Received October 23, 2008; Revised December 20, 2008： Accepted January 20, 2009)

Hongmei Zhu, Jung Sook Kim, Kyung Lae Park, Cheong Weon Cho, Young Sup Kim*, Jung Woo Kim **, Shi Yong Ryu*'^ and Jong Seong Kang^

College of Pharmacy, Chungnam National University, Daejeon 305-764, Korea

"부Korea Research Institute of Chemical Technology, Daejeon 305-606, Korea

**Dept. of Life Science and Technology, Pai Chai University, Daejeon 302-735, Korea

Abstarct — Quantitative analysis of (+)-catechin (C), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin (EC), (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), (-)-epicatechin gallate (ECG) and caffeine in commercial green tea was carried out by HPLC employing gra

dient elution of 0.1% acetic acid and acetonitrile on ODS column. The optimized HPLC method provided satisfactory lin

earity, accuracy and precision. The relationship between the concentration of the components and cultivated region of the commercial green tea was not significant, while the concentration of EGCG, ECG and caffeine decreased significantly in the later harvested green tea samples (pcO.Ol). Multivariate analysis of the components was performed in order to characterize and evaluate the cultivated region and harvest period-related variation. Hierarchical clustering and discriminant analysis were applied to classify the geographical and seasonal origins of the green tea samples. The classification accuracy of the cultivated region and harvest period by discriminant analysis was 95% and 91%, respectively, indicating that this methode could be reliable and convenient for the quality control of herbal products with different origin.

Keywords □ green tea, catechin, discriminant analysis, hierarchical clustering, harvest period

차 나 무 님 / sinensis)는 동백나무과(Camelliaceae or Theaceae)에 속하는 다년생 상록관목으로 우리나라를 비롯한 아 시아를 중심으로 아프러카, 러시아 등 아열대 온대에 걸쳐 광범 위하게 재배되고 있다. 녹차는 차나무의 엎을 말려 가공한 것으 로 국민소득의 향상과 건강 기호음료의 인식전환으로 그 소비가 급증하고 있다. 녹차가 중요한 기호음료로서 발전해 온 가장 큰 이유는 대중적인 기호성을 가지고 있을 뿐 아니라 복잡한 생명 활동의 조절기능을 갖는 기능성 식 품 ^ 서 중요성이 새삼 강조 되고 있기 때문이다. 최근 녹차를 옴용하는 인구가 늘어남에 따 라 녹차의 성분과 효능에 대한 연구가 다밍하게 진행되고 었다.

차의 주요성분은 카페인 성분, 폴러페놀 성분(카테킨, 카테킨

^본 논문에 관한 문의는 저자식I게로 (전화) 042-821-5928 (팩스) 042-823-6566 (E-mail) kangjssC« cnu.ac.kr

산화물, 폴라보놀), 단백질과 그 밖의 질소화합물(아미노산, 아미 드), 탄수화물 성분(섬유소, 전분, 텍스트린, 당, 팩틴), 각중 식물 성 색소(엽록소, 카로■틴, 키산트될, 안트키안), 방향류(정유 성분), 유기산 성분(구연산 사파산, 호박산), 지방산 성분(초산, 길초산), 비타민 성분(비타민 A, B1, B2, C, 니코틴산), 무기 성분(약 5~

6%의 망간, 5 오드) 등이 있으며 특히 폴리페놀류를 많이 함유하 고 있어 강한 항산화력을 나타낸다. 녹차의 폴러페놀류는 카테킨 류로 알려 진 (+)-catechin, (-)-epicatechin, (-)-epigallocatechin gallate, (+)-epigallocatechin, (-)-epicatechin gallate 등어다.® 이 런 화학성분은 차엽의 채엽시기,®^^ 품종,®> 차나무가 자라는 기 상 및 주위환경/ 제다법^ > 등에 따라 차<이가 나는데 채엽시기 가 «B)■론 차일수록 총질소, 카페인 및 아미노산등의 함량이 많고 카테킨류는 늦게 딴 차잎 일수록 함량이 많은 것으로 알려져 있 다.® 카페인은 뿌러와 중자에는 함유되어 있지 않지만, 차잎의 경우 종자의 발아 시에 생성되며, 계절벌로는 봄철보다 여름철

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52 주t 메 ■김정숙 ■박경래 • 조정원 ■김영섭 • 김정우 ■유시용 • 강종성

에함량이 증가한다."^> 이런 차의 주요성분둘은여러 가지 생리

활성과약리효과룰 나타내는것^ 보고되고 었다. 카테킨은항

산화작용,""'"® 함함작용/ ' 해득작용/ ^ 혈당저하작용/® > 항균작

용, 층처에방효과, 노화억제작용/®^ 진정작용^®' 등에 효과가있는 것으로 알려져 있으며, 카페인에 의한 중추신경 흥분, 강심, 이 뇨, 항천식 및 대사항진,™ aflatoxin 생성억제 등의 효과가 계속 적^ 밝혀지고 있다. 이러한 녹차의 기능이 밝혀지면서 성분 에 대한분석 방법도여러 방면으로 시도되고있다. 카테킨류의

일반적인분석법으로는비색법이 알려져 있지만잘사용되지 않

고대신자외선분광법,요^ ' 모세관전기영동법, ^ HPLC법* '^

등이 많이 사 §•되고있다. 최근에는 LC-MS룰이용하여 녹차에 서® 뿐아니라녹차률 옴용한사람의 혈액이나 뇨중에서도카

테킨류를분석하는 연구도 진행되고있다.2®"™

차나무는 광범위한분포와오랜 기간을통해품중내에서 형태

적또는 생리 생태적으로특유한형질변이를일으키는것으로 알

려져 있다. 그러므로 녹차는 생산지의 재배환경이나 채엽시기,

제다법 등에따라 맛, 색, 향이 다르고, 이에 따라등급도달라질 수있다. 녹차의 등급관정이나서로 다른 제다법에 대한품질의

관리는그동안 주로 관능시험에 의존하였으나 근래에는 기기나

각중 센서3«를 이용한 패턴인식법을 활용하려는 시도가활발하

다. 패턴인식법은녹차의 미지31"32) 또는기지33'페의 다성분을 번

량으로하여 녹차의 품질이나차종을관정할수있는방법으로주

로주성분분석, 관별분석, 군집분석 등의 통계적 기법을 활용한 다. 국내에서 시관되는 녹차의 경우채엽시기에따라 첫물차, 두 물차, 세물차, 네물차또는 우전, 세작, 중작, 대작등 포 구분

하고 있는데 이것이 차의 등급 및가격을 결정짓는중요한요소

가되고 있다. 본연구에서는시관되는녹차로부터 칸테킨류 및 카페인의 함량을 분석하고, 성분 함량과 생산지 및 채엽시기와

의관계를 패턴인식법으로 검토하였다.

실 험 재 료 및 방법

시약 및 기기

수소및탄소 핵자기공명스펙트럼은 Bruker(NJ, USA)의 AM- 300 및 AMX-500을이용하여 측정하였고 화학적이동처는사용 한 용매의 피크를 기준으로 5(ppm)으로 표시하였다. HPLC는 Futecs HPLC system(NS-3000i integrated HPLC System, AT-4000 Column Oven, Korea) 및 ProntoSIL Eurobond C18 (250 x 4.0 mm, 5 |im)(Bischoff Chromatography, Germany) 컬 럼을사용하였다. HPLC 분석에 사용한 (+)-catechin(C) 표준품 은 AldrichdVn, USA)사에서 구입하였고, 나머지 표준품 (- )-

epigallocatechin(EGC), caffeine, (-)-epicatechin(EC), (-)-epigallocatechin gallate(EGCG), (-)-epicatechin gallate(ECG)는 직접 분러하식 그순도가 99% 이상되는것을사용하였다. 시약은국

내외 특급 및 일급 시약을 사용하였고, 물은 3차 증류수률

0 .2 2 \im 막여과기로여 과 사 용 하 였 다.

표준품의 분리

건조된 녹차 암XCamellia sinensis) 20 kg을 메탄올로 상온에 서 일주일간 냉침한 후 감iJ" 농축하여 메탄을 추출물 7 kg을: 얻 었다. 추출물을 핵산과 증류수로 현탁시킨 후 물층을 에틸아세 테이트와 부틴을로 추출 능측하셔 에틸아세테이트엑스 622 담과 부탄을엑스 1942 g을 얻었다. 부탄을엑스 760 g을 메틸렌클로라 이드/메탄을 혼합용데률 용출용매로 사 §•하쉬 기울기 용리 방식 으로 실리카젤 컬럼 (70-230 mesh, 3 kg, 15.0x100 cm) 크로마 토그래피룰 실시하여 Fr-1, 2, 3, 4, 5, 6 등 6개의 분획으로 나 누었다. 각각의 분획을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피, RP-18 컬럼 크로마토그래피 및 세파덱스 컬럼 크로마토그래퍼롤 반복 적으로 실시하식 정제한 결과 카페인과 4종의 카테킨을 분리하 였다. 이둘 화합물들의 물러화학적 성상, 'H-NMR, i^C-NMR, MS 및 선광도룰 중함 검토하고 표품과 비교하식 본 결과 각각 caffeine,께 EC,지 ** EGC,체 EGCG^®' ECG3®>로 동정할 수 있

었다.

Caffeme(l)의 분리 -Fr-l(106g)를 메탄을에 수일 방치하여 흰색의 결정을 얻었다(24.7g): ^H-NMR(300MHz, DMSO-dg) 8: 7.97(lH,s), 3.86(3H,s), 3.38(3H,s), 3.19(3H,s) ^^C-NMR (125 MHz, DMSO-dg) 5: 154.5, 151.0, 148.1, 142.8, 106.6, 33.1, 29.3, 27.4.

(-)-epicatechin(2)의 분러 -Fr-2(5g)틀 50% 메틴을을 용fr액 으로 세파텍스 LH-20 컬럼(2.0x80cm) 크로마토그래피롤 실시 하여 세 번째 분획 (Fr-23, 2.7 g )i: 농측하고 다시 RP-18 컬럼 크 로마토그래피룔 실시하여 (2) 1.4g을 분리하였다: [a]D=-41.3 (C; 1.0, in MeOH) ^H-NMR(300 MHz, DMSO-dg) S: 9.11 (IH, 5-OH), 8.90(1H, s, OH-7), 8.81(1H, s, OH-4'), 8.72(1H, s, OH-3'), 6.89C1H, br s, H-2'), 6.66(2H, br s, H-5',6'), 5.89 (IH, d, 7=2.2 Hz, H-8), 5.72(2H, d, /=2.2 Hz, H-6), 4.74(1H, br s, H-2), 4.66(1H, d, OH-3), 4.01(1H, t, /= 3 Hz, H-3), 2.57 (2H, m, H-4) ^'*C-NMR(125MHz, DMSO-dg) 5: 156.6(C-5), 156.3(C-7), 155.8(C-9), 144.5(x2)(C-3',4'), 130.7(C-1'), 118.1 (C-6'X 114.9(C-5'), 114.8(C-2'), 98.6(C-10), 95.KC-6), 94.2(C- 8), 78.KC-2), 65.0(C-3), 28.3(C-4).

(-)-epigallocatechin(3) 및 (-)-epigallocatechin gallate(4) 의 분리 -Fr-4(300g) 중 34 g을 메틸렌클로라의드/메탄을 혼합 용매률 용출용매로 사용하식 기울기 용리 방식으로 실리카겔 컬 럼(70-230 mesh, 980 g, 5.0x100 cm) 크로마토그래피률 설시 S-M 6개의 분획을 얻고 세 번째 분획인 Fr-43(6.5g)을 메탄을/

물 흔합용매를 용출용매로 사 8■하여 기울기 용리 방식으로 MCI 겐 컬럼(1.5x60cm) 크로마토그래피 하쉬 (3) 1.65g, (4) 1.9g

(3)

페턴인식법에 의한 시관 녹차의 산지 및 채엽시기 추정 53

을 분리하였다. (-)-epigallocatechin(3) [a]p=-60.0(C : 1.0, in MeOH) ^H-NMR(300 MHz, DMSO-dg) 5; 9.11(1H, 5-OH), 8.90CLH, s, OH-7), 8.71(2H, s, OH-3',5'), 7.95(1H, s, OH-4'), 6.37(2H, s, H-2'.6'), 5.88(1H, d, /=1.8 Hz, H-8), 5.71(1H, d, /=1.8H z, H-6), 4.66C1H, s, H-2), 4.62(1H, d, OH-3), 4.12 (IH, m, H-3), 2.56(2H, m, H-4) ^^C-NMR(125 MHz, DMSO- d<i) 5: 156.6CC-9), 156.3(C-7), 155.8(C-5), 145.4(x2)(C-3',5'), 132.2(C-4'), 129.8(C-1'), 106.1(x2)(C-2'.6'), 98.6(C-10), 95.1 (C-6), 94.1CC-8), 78.2CC-2), 65.1(C-3), 28.3(C-4). (-)-epigallocatechin gallate(4) [a]p=-179(C : 1.0, in MeOH) ^H- NMR(300 MHz, DMSO-d<；) 5: 6.83(2H, s, H-2".6"), 6.42(2H, s, H-2'.6'), 5.94(1H, d, /=2.0 Hz, H-8), 5.84(1H, d, /=2.0 Hz, H-6), 5.38CLH, m, H-3), 4.97(1H, s, H-2), 2.64~2.98(2H, m, H-4) i3C-NMR(125MHz, DMSO-dg) 8: 165.4(C-7"), 156.6 (x2), 155.8, 145.8(x2), 145.5(x2), 138.7, 132.5, 128.8, 119.4, 108.8, 105.6, 97.5(C-10), 95.6(C-6), 94.5(C-8), 76.6(C- 2), 68.2(C-3), 25.9CC-4).

(-)-epicatechin gallate(5)의 분리 -Fr-5(152g) 중 10 금을 RP-18 컬럼 크로마토그래피를 실시하식 5개의 분획을 얻고, 이 중 Fr-52(2.7g)와 Fr-54(400 mg)을 각각 메틸렌클로라의드/메탄 을 흔합용매를 용출용매로 사용하여 기울기 용리 방식으로 실러 카젤 (70-230 mesh) 컬럼 크로'가토그래피률 설시하여 compound 5(970 mg)을 분리하였다: [a]D=-160.6(C : 1.0, in MeOH) ^H- NMR(300 MHz, DMSO-dg) 5: 6.88(1H, dd, / = 7.2,1.8 Hz, H- 2'), 6.83(2H, s, H-2", 6"), 6.76(1H, dd, /=7.2, 1.8 Hz, H-6'), 6.76CLH, d, /=7.2 Hz, H-5'), 5.95(1H, d, /=2.1 Hz, H-8), 5.84 (IH, d, /=2.1 Hz, H-6), 5.36(1H, m, H-3), 5.03(1H, s, H-2), 2.65~2.98(2H, m, H-4) ^^C-NMR(125 MHz, DMSO-dg) 5:

165.3(C-7"), 156.6(x2)(C-5,7), 155.7(C-9), 145.5(x2)(C-3",5"), 144.8(x2)(C-3',4'), 138.7(C-4"), 129.5(C-1'), 119.3(C-1"), 117.7 (C-6'), 115.2(C-5'), 114.3(C-2'), 108.7(2)(C-2",6"), 97.3(C-10), 95.6CC-6), 94.4CC-8), 76.6(C-2), 68.2(C-3), 25.8(C-4).

카테킨류 및 카페인의 추출 효율

녹차로부터 성분을 추출시 최적의 온도 및 시간을 설정하기 위하늬 추출시간을 3, 6, 9, 12분, 추출온도률 40, 60, 80, 100°C 등으로 변화시키면서 추출하고, 추출된 카테킨류 및 카페인 함 량을 분석하였다.

HPLC를 이용한 녹차 중 카테킨류 및 카페인의 분석

실험에 사용한 녹차는 2004년 1월부터 5월 사이 시중에서 무 작위로 구입하였으며 제주산 9종(S1-S9), 보성산 14종(S10-S23) 등 총 23종이었다. 시료의 확인은 견문가의 자문을 거쳤고, 표본 은 충남대학교 약학대학 약품분석실에 보관하였다.

시관 녹차 3 g i： 80°C의 물 150 m/에 6분간 가온 침출하식 시 료 액을 0.2 nm 막여과기로 여과하여 분석에 사용하였다. 크로 마토그래피를 위하식 ProntoSIL Eurobond C18 컬럼에 이동상 A(0.1% 초산)와 B(아세토니트릴)률 분당 Im /의 속도로 0분 10%B, 12분 15%B, 25분 30%B와 같이 기울기 용리하였다. 이 때 시료 주입량은 30 iJ, 오본온도는 35T, 검출파장은 UV 280 nm 였다. 카테 킨류와 카페 인 표준품을 물에 녹여 EGC 0.1-2 mg/

m/, C 0.01—0.1 ra^vd, EC 0.01—0.5 mg/mi, EGCG 0.1—2 mg/m/, ECG 0.1—1 mg/m/, caffeine 0.1~lmg/m/의 농도로 표 준액을 조제하고 이것을 이용하여 분석법의 타당성을 검증하였다.

패턴인식법을 위한 다변량 자료처리

시료의 물 추출액을 각각 HPLC로 분석하고 그 크로마토그램 으로부터 피크의 면적률 구하여 검량선으로부터 각 성분의 농도 를 계산하였다. 현재 표준녹차가 제공되고 있지 않으므로 모든 시료의 성분에 대한 중위수를 표준녹차의 성분함량으로 하였다.

다번량자료는 인터넷으로 제공되는 R 통계 프 로 그 램 으로 처 리하였으며 유의수준fr 0.01로 하였다.

유사도의 평가 - 유클러드 거리 (d), 코사민(C), 면적비 (A), 상관 계수(r) 등의 척도률 이용하여 표준녹차와 각 시료와의 유■사도률 평가하였다.

1/2

면적비 Ai,=

상관계수 r.j=

2 £m in (X ,k ，X,k) k = l

m

X!(Xik + Xrk) k=l

X (X „- ^)(X ,,- X ；) k=l_________________

계층적 군집방법을 이용한 시료의 군집분석 - 산지 또는 채엽 시기의 정보률 무시하고 성분의 처의만으로 각각의 시료가 어떤 군집을 형성하는지를 관찰하였다. 계층적 방법은 사견에 군집수 룰 정하지 않고 단계적으로 군집을 형성하는 방 법 R 램 duster 팩 키 지 의 agnes(agglomerative nesting), hclust (hierarchical clustering), diana(divisive analysis clustering) 둥 을 사용하였다.

Vol. 53, No. 2, 2009

(4)

0.00 3.00 6.00 9.00 12.00 15.00 18.00 21.00 (a)

InV

5B0.LRJU- 490.000 420.000 350.000 280.000 210.000

140.000- 70.000- O.OOO' -70.000'

Fig. 1 - HPLC chromatograms of 5 catechins and caffeine from (a) green tea extract and (b) mixed standards. HPLC: column; Prontosil Eurovond C18, mobile phase： A 0.1% acetic acid in water, B acetonitrile, gradient elution; 0 min 10%B, 12 min 15%B, 25 min 30%B for 1.0 ml/min, detection; UV 280 nm. Peaks: 1. EGC, 2. C, 3. caffeine, 4. EC, 5. EGCG, 6. ECG.

54 주홍매 • 김정숙 • 박경래 • 조정원 • 김영섬 • 김정우 • 유시용 • 강종성

판 별 분 석 에 의 한 시 료 의 채 엽 시 기 및 산 지 평 가 - 산지 또는 채 엽시기의 정보와 성분의 처서률 이용§1식 관벌식을 계산하고 이 로부터 산지 또는 채엽시기률 추정하였다. 관벌분석은 R 프로그 램 MASS 팩키지의 linear discriminant analysis(LDA)를 이용하 였다.

실 험 결 고 ^ 및 고 찰

최 적 분 석 조 건 의 설 정

C, EC, EGCG, EGC, ECG 등 카테킨류 5종 및 카페인에 대 한 최적 분석조건을 설정하기 위하식 이동상의 번화에 따른 분 리능을 검토하였다. 10%B룰 이동상으로한 등용매 용리로 6개의 성분을 모두 분리할 수 있었지만 분리시간이 60분 이상으로 너 무 길었고, 20%B를 이동상으로한 등용매 용리로는 분리가 완전

하지 못하였다. 이상의 조건을 고려하여 이동상 A와 B를 0분 10%B, 12분 15%B, 25분 30%B와 같이 기울기 용리하였을 경 우 6개의 성분을 25분 이내로 완전히 분리할 수 있었다(Fig. 1).

최 적 추 출 시 간 및 온 도 의 설 정

시료로부터 카테킨류와 카페인의 최적 추출조건을 검토하였다 (Fig. 2). 차는 물에 우려서 마시는 것을 김■단 하 H 추출용매는 물 을 이용하였다. 80T에서 3분 정도 추출할 경우 EGCG를 제외 한 대상성분이 대부분 추출 되었다. EGCG도 6분이면 거의 추 출이 되므로 추출시간을 6분^ 하였다. 녹차 중의 대상성분은 수록 잘 추출되었으며 추출시간을 6분으로 하였을 온도가 들

경우 60X 에서 EG C G * 제외한 대상성분이 대부분 추출 되었 다. 온도를 80°C로 하였을 경우 EG C G * 포함한 대상성분이 모 두 6& 이내에 추출되므로 추출조건을 80°C, 6분으로 결정하였다.

A

KKI1^

i

(b) mV

6 50.000

6 00 .0 0 0

5 50 .0 0 0

5 00 .0 0 0

4 50 .0 0 0

400.000

3 50 000

300.000

25Q.OOO

2 0 0 .0 0 0

1 50.000

100.000

50.000

0 .0 0 0 -50.000

VOF3

g

A

399^11-

2£l-f

.

§

8

■니

(5)

6 8

E x tra c tio n tim e (m in )

10 12

■o~ caffeine -o- E C (

- ^ E G C G - * - E C G

104.3 102.1 99.2 98.3

0.1 4.71 9.01 101.4

ECG 0.25 8.62 7.04 98.2

0.5 2.13 2.58 99.5

1.0 1.70 2.58 97.8

40

직선성, 정확성, 정밀성

각각의 표준물질을 증류수에 녹인 표준용액을 HPLC로 분석 하쉬 각 성분에 해당하는 괴크의 넓이로부터 각 성분의 검량선 을 작성하였다. 검량선의 상관계수는 모두 0.99 이상으로 양호한 직선성을 나타내었다. 각 성분에 대한 정확성과 정밀성은 저농 도, 두 개의 중농도, 고농도에 해당하는 품질관리시료로 평가하 였으며 일내정밀성은 5희의 측정, 일간정밀성은 5일간의 측정으 로 하였다. Table I에서 보는 바와 같이 대상성분에 대하여 일내 정밀성은 9% 이하, 일간정밀성은 10% 이하, 정확성은 98%~

105%로 비교적 양호하식 본 방법은 녹차 중 EGC, C, caffeine, EC, EGCG, ECG 등 6개 성분의 분석에 타당함을 알 수 있었다.

녹차 중 카테킨류 및 카페인 할량 분석

시관 녹차 23중에 대해서 HPLC의 방법으로 분석하고 카테킨 류 및 카페인의 함량을 조사하였다. 총 23개 녹차시료에 대한 EGC, C, EC, EGCG, ECG 및 caffeine의 평균값은 각각 2.20, 0.022, 0.79, 5.03, 1.22 및 2.56?_^ 이미 발표된 자료와 비숫하 였다. 보성산 녹차는 제주산 녹차에 비해 각 성분 함량이 약간 낮은 것으로 나타났으나 통계적 유의성은 없었다(p>0.01). 보성 산 녹차의 경우 함량이 낮게 나온 이유는 채엽시기가 늦은 시료 가 절반 섞여 있었기 때문으로 풀이된다. 녹차의 품질 및 가격은

60 80

E xtra c tio n tem p.(pC)

100

Fig. 2 - Extraction efficient of (a) time at 80®C, and (b) temperature for 6 min on the extraction of catechins and caffeine from green tea samples.

채엽시기에 따라 달라지는데 첫물차인 경우 대체로 5월 초순이 기준이 되고 있다. 시료률 채엽시기에 따라 5월 초순이전과 중 순이후로 나누어 분석하였을 경우 5월 중순이후에 채엽된 녹차 의 EGCG, ECG 및 caffeine 함량이 초순이전에 채엽된 녹차에 비해 유의적_으로 감소하였다(p<0.01). 이 결과는 5월차는 4월차 에 비해 EGCG, ECG 및 caffeine의 함량이 감소한다는 김 등 의 발표와 유사하였다. 하지만 총 카테킨 함량(EGC, C, EC, EGCG, ECG 성분의 합)은 채엽시기가 늦을수록 감소하식 (9.88%

6.91%, p<0.01) 김 등의의 발표와는 다르게 나타났다.

패턴인식범에 의한 다변링분석

시관 녹차 23종에 대해서 조사된 카테킨류 및 카페인의 함량 을 번수로 다변량분석을 실시하였다. 각 성분에 대한 23종 시료의 중위수로부터 표준녹차의 성분함량을 구하고 이률 이용 하여 각 시료의 유사£ 률 평가하였다. 유클리드 거리 , 코사인, 면 적비, 상관계수 등의 유사성 척도는 23개의 시료가 표준녹차와 상당한 동질성을 가지고 있는 것을 보여주었으며 , 산지나 채엽 시기에 따른 특징은 표현되지 않았다(Fig. 3). 성분함량을 기초한

Vol. 53, No. 2, 2009

0.1 2.89 4.87 100.7

0.5 4.26 7.85 101.2

1.0 1.38 5.41 99.1

2.0 1.52 2.90 99.5

EGC

Caffeine

5 1 2 5

5

ILqc^pG^CJO"!

1 2

* L q c 시 -n

L

8 6 6 1

4 7

1 4

4 7 1 4 4^

4^

1^

Jc'sJ

%^0

1*

1.

^

0^ 1*

8 8 7 5

6 4 0 8

1 8 5 9 9 8 8 9

5 7 3 6

5 6 5 1

^

L

7

^

0^

1- 4- 0^

4- 2*

4^ 1*

5-

0^

2*

us2*c^1-500990099oooo11111111

패턴인식법에 의한 시관 녹차의 산지 및 채엽시기 주정 55

Table I - Precision and accuracy for the analysis of 6 standards by HPLC method

Compound Concentration (mg/m/)

Precision (%)

intraday interday Accuracy (%)

(a) _{- E G C} _{- * - C}

- caffeine -<>- E C

- E G C G E C G

c%}JU9?uo:3

9.01 7.04 2.58 2.25

f'J

r i

r - a . 1-

0^ 4^ X

7 1 X 1

0.01 0.05 0.1 0.5 E'

(6)

0.2 0.0

1.0

^ ^ 유/ ■차J> ^ ^ ^

Fig. 3 - (a) Cosine, (b) area ratio, (c) correlation and (d) distance measurements.

<S^ ^

i

^

between standard green tea and green tea samples for similarity

Table II - Changes of catethins and caffeine contents in green tea from different cultivation region and harvest period

EGC C EC EGCG ECG Caffeine

All samples 2.20±0.77 0.022±0.010 0.79±0.27 5.03 ±1.38 1.22 ±0.46 2.56 ±0.45 Cultivated in Jeju 2.62 ±1.04 0.022±0.010 0.92±0.27 5.82 ±0.65 1.30 ±0.46 2.84±0.46 Bosung

Harvested

1.93±0.36 0.021±0.011 0.71±0.23 4.52 ±1.50 1.17±0.47 2.39±0.36

before May 10, 1.91 ±0.53 0.023 ±0.011 0.83±0.21 5.75±0.89* 1.49 ±0.38* 2.76 ±0.40*

after May 10. 1.95±0.39 0.019±0.009 0.57±0.24 3.51 ±1.24 0.87±0.43 2.18±0.38 Values represent mean ± standard deviation (n=3) in %.

*p<0.01 when compared with the data of green tea harvested after May 10.

계층적 군집방법에서는 23개의 녹차시료가 크게 두 개의 군집으 로 나누어졌다. 제 1군집은 S1-S9, S14, S16, S19, S21-S23 등 15 개의 시료로, 제2군집은 나머지 8개의 시료로 구성되었다. 이 군 집 분류에는 주로 성분 EGCG, ECG 및 caffeine 함량의 영함«1 컸으며, Table n 에서 보는 바와 같미 산지보다는 채엽시기가 중 요한 인자로 작용한 것으로 파악된다(Fig. 4). 제1군집에는 다수 의 5월 초순이전 채엽된 시료와 제주산미 포함되는 것으로 나타 났다. S2-S5에 대한 정확한 채엽시기는 알려져 있지 않지만 군 집분석에서 제1군집에 속하는 것^ 보아 5월 초순이전에 채엽 된 것일 가능성이 높은 것으로 관단된다.

알려진 산지 또는 채엽시기 정보와 성분 함량을 이용하여 관

별분석으로부터 산지 또는 채엽시기를 추정하였다. Fig. 5a는 채 엽시기가 불확실한 시료 S2-S5를 제외한 나머지 시료를 기준으 로 채엽시기와 성 분 함 량 로 관별식을 작성하고 이 관벌식을 이 용하식 각 시료의 채엽시기롤 추정한 것이다. 관벌식의 값(Out) 이 양수인 것은 채엽시기가 5월 초순이전이고, 옴수인 것은 5월 중순 이후이다. 이 관벌식을 이용하였을 경우 채엽시기가 5월 초 순이전이었던 시료( 0 ) 는 모두 양수로, 채엽시기가 5월 중순이 후였던 시료(A )는 S21 을 제외하고는 모두 옴수로 분류되어 약 95%의 정확성을 보였다. S21 의 채엽시기는 6월 하순이나 함수 의 값은 앙수로 나타나 채엽시기가 아주 늦어질 경우 관벌식에 또 다른 인자가 영향을 미치는 것으로 생각할 수 있다. 채엽시기

0.2

^ ^Jp '오 육 ^ 아^

0.0

(d)3.0

56 주:I：매 • 김정숙 • 박경래 • 조정원 • 김영섭 • 김정우 • 유시용 • 강중성

(a) 1.0 (b) 10

8UB1S5

uonwlauooJHnsou

(7)

I I M I I I

o o o o o o o o

ss

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I

# X 2 S I O

■ I o n O B

Fig. 4 - The hierarchical clustering analysis of 23 green tea extract, harvested in Jeju (# ) or Bosung (O ). The harvest period was before May 10. (■) or after May 10, (□), or not known (x).

가 불확실하였던 시료(+ )는 모두 함수의 값어 양수로 5월 초순 이전에 채엽된 것으로 추정되며 이것은 군집분석의 결과와도 일 처하였다. 녹차의 6개의 성분 중 EGCG가 채엽시기률 추정하는 판별함수의 값에 가장 큰 영향을 미치고 다옴으로 C, EC, EGC 의 순으도 영향을 머처는 것으로 나타났다. Fig. 5b는 산지와 성 분함량^ 관별식을 작성하고 이 관별식을 이용하여 각 시료의 산지를 추정한 것이다. 관벌식의 값이 양수인 것은 제주산, 음수 인 것은 보성산이다. 이 관벌식을 이용하였을 경우 39를 제외한 제주산(0 > 은 모두 양수로, S23을 제외한 보성산(A )은 모두 옴 수로 분류되어 약 91%의 정확성을 보였다. 무작위로 추출된 S7, S18, S19를 동일한 관별식으로 관별하였을 경우 각각 제주산(S7), 보성산(S18, S19)으로 을바르게 관별되었다. 산지를 추정하는 판 별식에는 채엽시기를 추정한 관별식과는 달리 녹차의 6개 성분 이 고르게 영향을 미친 것으로 나타났다. 이것은 Table II에서 나 타난 바와 같이 산지의 차이에 대해 6개의 성분 모두가 유의한 차이를 보이지 않았다는 것과도 일맥상통한다고 생각된다.

결 론

본 연구에서는 녹차의 성분을 분석하고 성분 함량과 녹차의 산지 및 채엽시기와의 관계률 패턴인식법으로 검토하였으며 다 옴과 같은 결론을 얻었다.

1. 녹차의 주요성분인 C, EC, EGCG, EGC, ECG 등 카테킨 류 5종 및 카페인을 HPLC로 분석하였다. 이 때 역상컬럼에서 용메 A(0.1% 초산)와 B(아세토니트릴)률 0분 10%B, 12분

Index

Fig. 5 - Results of linear discnminant analysis of the 23 green tea extract for the estimation of (a) harvest period and (b) cultivated region. Harvest period: O before May 10, A after May 10, + estimated. Cultivated region; O Jeju, A Bosung, + estimated.

15%B, 25분 30%B로 기울기 용리하였고, 검출파장은 280 nm 였다.

2. 산지 처서에 대해 녹차의 각 성분은 유의적인 치의를 보이 지 않았으나, 채엽시기에 대하여 EGCG, ECG 및 caffeine 함량 은 채엽시기가 늦어짐에 따라 유 의 적 감 소 하 였 다 (pcO.Ol)

3. 유사성 척도로 관단할 경우 23개의 시료는 성분상으로 표 준녹차와 상당한 동질성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 관별 식을 이용츠^ i 채엽시기 및 산지률 추정하였을 경우 채엽시기는 약 95%, 산지는 약 91%의 정확성을 보여 본 방법은 녹차의 산 지 및 채엽시기를 어느 정도 추정할 수 있을 것으로 판단된다.

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패턴인식법에 의한 시관 녹차의 산지 및 채엽시기 주정 57

CU9

SISH

(8)

58 주홍매 • 김정숙 • 박경래 • 조정원 ■김영섬 ■김정우 • 유시용 • 강종성

감사의 말씀

본 연구결과는 보건복지부의 한의학연구개발사업 (B070044)의 지원에 의하여 수행되었으며 이에 감사드린다. 또한 기기 측정 에 도움을 주신 기초과학지원연구원에 감사드린다.

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