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Expression of ICAM-1 by IFN-γ γ γ and IL-4 in Cultured γ Normal Human Nasal Epithelial Cells

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배양 비점막 상피세포에서 IFN-γ와 IL-4에 의한 ICAM-1의 발현양상

영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실

김용대·박준철·이준혁·조중석·이재억·배창훈·송시연·윤석근

Expression of ICAM-1 by IFN-γ γ γ and IL-4 in Cultured γ Normal Human Nasal Epithelial Cells

Yong-Dae Kim, MD, Jun Chul Park, MD, Joon Hyuk Lee, MD, Jung Suck Cho, MD, Jae Uk Lee, MD, Chang Hoon Bai, MD, Si Youn Song, MD and Seok-Keun Yoon, MD

Departmemt of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Yeungnam University, Taegu, Korea

- -

-- ABSTRACT ----

Background and Objectives:Intercellular adhesion molecule-l (ICAM-1) is an important molecule in im- mune and inflammatory responses. It is regulated by IL-1β, IL-4, TNF-α, and IFN-γ on many cell types. The aim of this study was to investigate the effects of IFN-γ and IL-4 on expression of ICAM-1 in cultured no- rmal human nasal epithelial (NHNE) cells. Materials and Methods:NHNE cells were prepared by primary culture method of monolayer culture of dissociated cells from inferior turbinate mucosa. Primary cultured cells were characterized as an epithelial cell type by immunofluorescence assay and transmission electron micros- copy. We analyzed the quantitative expression of ICAM-1 on cultured NHNE cells by treated with IFN-γ and IL-4 using fluorescence activated cell sorter (FACS). Results:Treatment of cultured NHNE cells with IFN-γ (1ng/ml) for 24 hours induced 4-fold increase of the surface ICAM-1 compared with constitutive expression by mean intensity fluorescence (MIF). However, IL-4 showed no effect even though the concentration of it was increased gradually. IFN-γ induced ICAM-1 expression according to the time course was significantly highest level at 24 hours. There were no significant changes in expression of ICAM-1 by IL-4 according to the time course. Conclusion:These findings suggest that IFN-γ is a potent ICAM-1 inducer, but IL-4 have no effects on expression of ICAM-1 on cultured NHNE cells. ((((J Clinical Otolaryngol 2000;11:261-266)))) KEY WORDS:Human nasal epithelial cells·ICAM-1·IFN-γ·IL-4.

서 론

비점막은 위중층 섬모원주상피세포로 구성된 조직으

로 외부환경으로부터 침입하는 항원이나 미생물 등에 대한 일차적 방어막으로 작용하며, 사이토카인(cyto- kine)이나 염증성 매개물질, 성장인자(growth factor) 등을 분비하여 비점막의 염증반응 및 치유과정에 관여 한다.1)2)

염증반응에서 세포접착분자들에 대한 중요성이 부각 됨에 따라 알레르기성 비염 및 천식의 병리기전에 있어 서 세포접착분자들의 역할에 관한 연구들이 활발히 진행 논문접수일:2000년 9월 25일

심사완료일:2000년 11월 4일

교신저자:김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1 영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 전화:(053) 620-3784・전송:(053) 628-7884 E-mail:ydkim@med.yu.ac.kr

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되고 있다. 접착분자 중 ICAM-1은 세포종류에 따라 IL-1α, IFN-γ, TNF-α 그리고 IL-4등의 사이토카 인에 의한 발현양상이 다르다고 알려져 있다.3)4) 이 중 IFN-γ는 대부분의 경우 ICAM-1의 발현을 증가시킨 다. 한편 IL-4는 혈관내피세포의 vascular cell adhe- sion molecule-1(VCAM-1)의 발현을 촉진시키고 비 만세포나 피부섬유아세포의 표면에서 ICAM-1발현을 증가시킨다.5-7) 그러나 세포의 종류나 보고자에 따라 IL-4 자체는 ICAM-1의 발현을 증가시키거나 혹은 큰 영향이 없다고 한다. 하지만 아직까지 비점막 상피세포 에서 IFN-γ와 IL-4가 ICAM-1의 발현에 끼치는 영 향에 대한 연구 결과는 미비한 실정이다.

이에 저자들은 IFN-γ와 IL-4가 분리세포의 단층 배양법으로 배양한 비점막 상피세포에서 세포를 초대 배양한 후 ICAM-1의 발현에 어떠한 작용을 하는지 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

비점막 상피세포의 분리 및 배양

비점막 상피세포를 분리하기 위한 재료로 알레르기성 비염이나 부비동염이 동반되지 않은 단순한 비중격 만곡 증 환자의 점막조직을 비중격성형술시 하비갑개 앞쪽 1/

3부위에서 채취하였다. 채취된 점막 조직을 이미 기술 한 방법대로 처리하고 배양하였다.8)9) 이를 간략히 설명 하면 채취된 점막조직을 즉시 0.01M 인산완충용액에 넣어 냉장보관하에 운반하였다. 점막조직을 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate 및 0.25 μg/ml Fungizone이 첨가된 인산완충용액으로 1회 세 척한 다음 새로운 인산완충용액에 넣어 4℃에서 30분 간 방치 후 점막하 결체조직을 제거하고 5×5 mm의 절편을 만들어 dispase(Boehringer Mannheim, Ma- nnheim, Germany)용액에 넣어 37℃에서 90분간 방 치하였다. 그 후 수술용 칼로 세포를 박리하여 인산완충 용액으로 부유한 다음 200 mesh 그물망을 통과시키고 1500 rpm에서 10분간 원침하였다. 상층액을 제거한 후 침전된 세포들을 배양액에 부유시킨 다음 12 well pl- ate에 심어 배양기(36℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 세 포 배양액으로는 Medium 154(Cascade Biologics,

Portland, OR)에 100U/ml penicillin, 100 μg/ml st- reptomycin sulfate, 0.25 μg/ml Fungizone을 첨가 하여 사용하였다. 18시간 배양 후 배양용기에 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 배양액을 제거하고 새로 운 배지로 갈아 준 후 초대배양 4일째 세포를 실험에 사용하였다.

상피세포 동정

초대 배양된 세포가 상피세포임을 확인하기 위하여 이 미 기술한 방법대로 형태학적 관찰 및 면역학적 방법을 사용하였다.8) 형태학적 동정을 위하여 광학현미경(Ni- kon, Tokyo, Japan)으로 형태를 관찰하였으며, 투과전 자현미경(Hitachi, Naka, Japan)촬영을 실시하여 상피 세포에만 존재하는 미세구조인 교소체(desmosome)와 장세사(tonofilament) 등을 관찰하였다.13)

면역학적 동정을 위하여 세포골격을 구성하는 int- ermediate filament에 대한 항체인 anti-cytokeratin No. 8(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), anti-cytokeratin pan(Boehringer Mannheim, Man- nheim, Germany), anti-vimentin(Sigma, St. Louis, MO)과 혈관내피세포의 지표인 von Willebrand factor 에 대한 항체인 antivon Willebrand factor(Boehrin- ger Mannheim, Mannheim, Germany)를 사용하여 면 역형광체방법으로 확인하였다.7)14)

ICAM-1의 발현 유도 및 정량

비점막 상피세포에 사이토카인을 처리하였을 때 세포 표면의 ICAM-1의 발현 양상을 관찰하기 위하여 IFN- γ와 IL-4를 사용하였다. 초대배양 4일째 되는 세포에 0.01, 0.1 및 1 ng/ml의 recombinant human IFN-γ (Endogen, Woburn, MA)와 0.01, 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml의 recombinant human IL-4(Endogen, Wob- urn, MA)를 24시간 처리하였다. 또한 1 ng/ml의 IFN- γ와 100 ng/ml의 IL-4를 24, 48, 72 및 96시간 동안 처리하여 시간에 따른 ICAM-1의 발현 정도를 비교하 였다.

사이토카인 처리후 배양용기에 부착되어 있는 상피세 포를 트립신으로 처리하여 수거한 뒤 인산완충용액으로 세척하고 anti-ICAM-1 PE(Becton Dickinson, Fr-

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anklin Lakes, NJ)로 4℃에서 40분간 반응시켰다. 반응 이 끝난 후 인산완충용액으로 원심 세척 후 유세포분석 기(fluorescence activated cell sorter, FACS) ELI- TE(Coulter, Harbor Boulevard, PO)를 이용하여 488 nm의 파장에서 평균형광강도(mean intensity fluore- scence, MIF)를 측정하여 형광강도의 단위를 표준곡선 에 따라 농도로 전환하였다.

결과의 분석은 SPSS 및 SAS software를 이용하여 ANOVA와 Repeated Measures ANOVA를 시행하여 통계처리 하였다.

결 과

비점막 상피세포의 형태 관찰

광학현미경으로 관찰한 결과 일정한 다각형 모양의 세포들이 군집을 이루며 단층을 이루는 것이 관찰되었다.

투과현미경으로 배양된 세포를 관찰한 결과 상피세포에 서만 나타나는 교소체와 장세사가 관찰되어 분리배양한 비점막 세포가 상피세포임을 형태학적으로 확인하였다

(Fig. 1).

면역형광항체법에 의한 상피세포의 동정

면역항체법으로 상피세포의 동정을 실시한 결과 편평 상피세포의 세포골격인 cytokeratin No. 8과 cytoke- ratin pan에 대한 항체로 염색한 경우 비점막에서 초대 배양한 세포에서는 모두 양성으로 나타났으나, 섬유아세 포인 Mongolian gerbil fibroblasts와 혈관내피세포인 CPAE(calf pulmonary endothelial cell) 세포에서는 음성으로 관찰되어 배양한 세포가 상피세포임을 확인하 였다(Table 1).

사이토카인의 농도별 처리에 따른 ICAM-1의 발현 IFN-γ로 처리하지 않은 비점막 상피세포에서 IC- AM-1의 발현의 평균형광강도는 3.94±1.42였다. IFN- γ를 0.01, 0.1 및 1ng/ml으로 24시간 처리한 세포에 서의 평균형광강도는 4.15±2.26, 7.16±2.65 및 15.

67±7.94로 IFN-γ 농도에 따라 유의하게 증가하였고 (p=0.035), 1 ng/ml의 IFN-γ로 처리한 세포는 처리

Table 1. Characteristics of cultured normal human nasal epithelial (NHNE) cells, mongolian gerbil fibroblast (MGF), and calf pulmonary arterial endothelial cell (CPAE) by immunoflurescence staining

Results Monoclonal antibody Specificity

NHNE MGF CPAE

Anti-cytokeratin pan All epithelial cell + - -

Anti-cytokeratin No. 8 Nonsquamous epithelial cell + - -

Anti-vimentin Cell of mesenchymal origin - + -

Anti-von Willebrand factor Endothelial cell - - +

Table 2. ICAM-1 expression on cultured normal human nasal epithelial cells after treatment of IFN-γand IL-4 for 24 hours

MIF (mean intensity flurescence) Concentration (ng/ml)*

IFN-γ IL-4 0.00† 3.94±1.42 2.73±0.63 0.01 4.15±2.26 2.30±0.42 0.10 7.16±2.65 2.29±0.39 1.00 15.67±7.95 2.28±0.58 10.00 Not tested 2.75±0.78 100.00 Not tested 2.83±0.69

*:concentration of IFN-γ and IL-4

†:Constitutive expression of ICAM-1

Values are the mean±SD of five experiments in IFN-γ and three experiments in IL-4 treatment.

Fig. 1. Photograph of horizontal section of cultured nor- mal human nasal epithelial cells by transmission electron microscopy. Tonofilaments (arrowhead) and desmos- omes (arrow) were observed. Unit of bar scale:10 μm.

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하지 않은 세포에 비하여 평균형광강도가 약 4배 증가 하였다(Table 2 and Fig. 2). IL-4를 0.01, 0.1, 1, 10 및 100 ng/ml으로 24시간 처리한 세포에서의 평균형 광강도는 농도에 따른 변화가 거의 없었고, IL-4로 처 리하지 않은 비점막 상피세포와도 차이가 없었다(Ta- ble 2 and Fig. 2).

사이토카인의 시간별 처리에 따른 ICAM-1의 발현 1 ng/ml의 IFN-γ와 100ng/ml의 IL-4를 상피세 포에 처리하여 24, 48, 72 및 96시간 후에 시간의 변 화에 따른 세포표면에 발현하는 ICAM-1의 발현정도 를 관찰하였다. IFN-γ 처리한 경우 시간에 따른 평균 형광강도는 24시간째 최고 발현을 나타냈으며 96시간 째에는 최고 값의 절반정도로 감소함을 관찰하였다(Ta- ble 3 and Fig. 3). 시간변화에 따른 발현양의 증감 추

이는 통계학적인 의의는 없었다. IL-4의 경우 시간변 화에 따른 차이가 없었다.

고 찰

최근 알레르기 질환의 병태생리에서 세포와 세포사이 및 세포와 세포외 기질과의 상호 관계에 관여하는 접착 분자 발현과 면역 및 알레르기성 염증반응에서 생성되 는 전구염증성 사이토카인의 관계에 관한 연구들이 활발 히 진행되어 ICAM-1의 발현에 관여하는 사이토카인 은 세포의 종류에 따라 다양하다는 것이 밝혀졌다.9-12) 사이토카인 중 IFN-γ와 IL-4는 알레르기성 염증 반응에서 서로 상반되는 역할을 하는 것으로 알려져 있 으며, 여러 보고자들에 의해 다양한 조직에서 ICAM- 1의 발현에 미치는 영향에 대해 보고되고 있다. 예를 들면, IFN-γ는 배양된 흉선 상피세포,15) 내피세포16) 와 변형된 기관지 상피세포17)에서는 ICAM-1의 발현 을 증가시키는 반면, IL-4는 상기 각각의 세포15-17)에 서 ICAM-1의 발현을 억제하거나 영향이 없다고 보고 된다. 한편 IL-4가 비반세포, 단핵구, 대식세포 등에서 는 ICAM-1의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라,6) 진피 섬유아세포에서는 전사(transcription)과정을 조절함으 로써 ICAM-1의 발현을 증가시키고7) 그 외 기관지 상 피세포에서도 ICAM-1의 발현이 증가한다고 하였다.18) 이와 같이 세포의 종류에 따라 IFN-γ는 대부분의 경 우 ICAM-1의 발현을 증가시키나, IL-4는 ICAM-1 Table 3. ICAM-1 expression on cultured normal human

nasal epithelial cells according to the time course after treatment of IFN-γ and IL-4

MIF (mean intensity flurescence) Time (hours)

IFN-γ IL-4

0* 2.65±0.11 2.60±0.44 24 8.77±2.73 2.68±0.56 48 6.53±2.38 2.44±0.57 72 7.60±1.58 2.65±0.69 96 4.49±1.21 2.61±0.82

*:Constitutive expression of ICAM-1

Values are the mean±SD of three experiments, respe- ctively

Fig. 2. Mean intensity fluorescence (MIF) of ICAM-1 on cultured normal human nasal epithelial cells according to the concentration of IFN-γ and IL-4. IFN-γ signific- antly increases ICAM-1 expression in a dose dependent pattern (p<0.05), but IL-4 shows no effect.

Fig. 3. ICAM-1 expression on cultured normal human nasal epithelial cells according to the time course after the treatment of 1 ng/ml of IFN-γ and 100 ng/ml of IL- 4. Expression of ICAM-1 by IFN-γ is a highest level at 24 hours, but there is no changes in expression of ICAM-1 by IL-4. MIF:mean intensity fluerescence.

(5)

의 발현을 증가 혹은 감소시키거나 영향이 없는 경우도 있었다. 그러나, 이러한 연구들은 항원에 가장 먼저 노 출되어 알레르기성 혹은 비알레르기성 비염을 일으키는 비점막 상피세포에서 전구염증성 사이토카인인 IFN-γ 와 IL-4가 ICAM-1의 발현에 미치는 영향을 관찰할 수 없었다.

한편 최근 Kim 등9)은 비점막 상피세포에서 IFN-γ 는 ICAM-1의 발현을 증가시키고, IL-1α는 ICAM- 1의 발현에 영향이 없는 것으로 보고하였으나, 이 또한 IL-4에 대한 결과는 없었다. 따라서 저자들은 인체 비 점막 조직으로부터 상피세포를 배양하고 IFN-γ와 IL- 4를 처리한 후 ICAM-1의 발현 정도와 시간 경과에 따른 ICAM-1의 발현 변화를 관찰하였다.

본 연구에서는 배양된 인체 비점막 세포에서 IFN-γ 는 대부분의 다른 조직에서와 같이 ICAM-1의 발현을 증가시켰다. 그러나 IL-4의 경우 다른 보고에 의하면 세포의 종류에 따라 ICAM-1의 발현 양상이 다양하게 나타나나 저자들의 경우 배양된 인체 비점막에서는 IL- 4가 ICAM-1의 발현에는 특별한 영향이 없었다. 한편 배양된 인체 비점막 상피세포를 IFN-γ로 자극하였을 때 ICAM-1의 발현 양상이 어느 정도 시간이 경과한 후 에 유도, 증가되는 것으로 보아 ICAM-1은 염증반응 에서 초기 반응보다는 후기 염증반응에 관여하여 염증 세포의 상피하 침윤, 염증세포의 비강내로의 배출시 염 증세포의 접착을 통한 경상피이주(transepithelial mi- gration)과정에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

결 론

인체 비점막 상피세포를 분리세포의 단층배양법으로 배양하여 전구염증성 사이토카인인 IFN-γ와 IL-4로 처치하여 ICAM-1의 발현 양상을 관찰한 결과 IFN- γ는 ICAM-1의 발현을 증가시켰고, 처치후 24시간에 서 최고 발현이 나타났으나, IL-4는 ICAM-1의 발현 에 영향이 없었다. 이러한 결과로 보아 인체 비점막 상 피세포에서 IFN-γ가 ICAM-1의 발현에 중요한 역할 을 하는 것을 알 수 있었다.

중심 단어:비점막 상피세포・ICAM-1・IFN-γ・IL-4.

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수치

Fig. 1. Photograph of horizontal section of cultured nor- nor-mal human nasal epithelial cells by transmission electron microscopy
Fig. 2. Mean intensity fluorescence (MIF) of ICAM-1 on cultured normal human nasal epithelial cells according to the concentration of IFN-γ and IL-4

참조

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