anti-oxidant en- zyme

(1)

대한임상병리사회지 : 제 24 권 1 호

1992

스파르가눔에 서

Superoxide

Dismutase의 정 제 및 부분 특성

서울보건전문대학 임상병리과 나 동 진

Key words : SOD from sparganum , CU , Zn-SOD type

1 .

서 론

최근 인체 기생층의 숙주 감염경로와 숙주 내 생활기전， 숙주의 면역작용을 조정하는 기전을 밝 히는 일환으로 충체 및 이들의 분비물에서 특정 효소를 분리하고， 그들의 생화학적 특성을 밝히는 연구가 많은 학자들에 의해 진행되고 있다.

기생충이 숙주에 감염될 때 숙주의 방어기전이 발생되는데， 숙주는 기생충의 충체 및 이들이 분비 하는 각종 단백질에 의해 면역계를 형성하여 이들 공격을 방어하게 된다. 한편 이들 기생충들은 숙주 의 방어기전에 대해 여러 가지 단백질과 분비물로 숙주의 방어기전에 대응한다. 그리고 이들은 여러 요인으로 숙주의 면역반응기전에 중요한 역할을 하는데， 그 요인 중 대표적인 것의 하나가 효소 단 백질이다. 이들 효소 단백질 중 단백질 분헤효소 l ， 2)，

단백질 분해효소 억제인자3) 및

anti-oxidant en- zyme

⁴) 등이 숙주의 면역반응 억제인지-로 밝혀진 바 있다.

기생충이 감염되어 숙주의 기관， 조직을 이행하 면 기관과 조직 내에는 각종 형태의 염증과 병변 이 발생되며， 이들 염증세포는

superoxide radical

,

hydrogen peroxide , singlet oxygen , hydroxyl radical

과 같은

oxygen radical

퉁이 생 성 된 다. 이 들

radi-

cal은 기생충의 세포， 막 단백질， 핵산 동에 손상을 주므로 이들 숙주세포는

superoxide dismutase

,

cat- alase , glutahione peroxidase

동과 같은 여 러

anti- oxidant

enzyme을 갖고 있 어

reactive oxygen radi-

cal로부터 보호된다4)，

Anti-oxidant enzyme

중

su- peroxide dismutase(SOD: superoxide , superoxide oxidereductase

,

EC

1. 15. 1. 1) 는 호기 적 대사를 하는 기관에서 생성되는

superoxide

(02 -)를 산소와 과산 화수소로 전환 (202-

+2H+

•

H

2

0

2

+0

2 ) 시킴으로서 superoxide의 독성 을 제 거 하는 효소이 다，

Superox-

ide

radical 은

NADPH

의존성 산화5， 6\ xanthine의 산화7)， 그리고 과립구가 식균작용을 하는 동안8)과

human natural k

il1

er cell

이

cytolytic

초기 과정 ⁹⁾ 퉁 생물학적 반응에 의해 생성된다고 보고하였다. 그 리고 기생부위 및 이행부위의 염증에서 생성된

su- peroxide

radical 은 기생충에서 생성된 SOD에 의해 즉시 제거된다고 보고하였다10)

현 재 몇 종류의 기 생 충에 서

anti-oxidant enzyme

및

oxygen

radical 에 관한 보고가 있는데 lI~14)， 특히 SOD는 원충류 15) ， 선충류 l6， 17)， 흡충류 18， 19) 및 조충류20) 풍에서 SOD는 숙주의 면역반응을 조절함으로서 숙주와 기생충의 상호관계에 중요한 역할을 할 것 으로 생각된다고 보고하였다.

스파르가눔 (sparganum) 이 각종 동물 및 인체 감염은 procercoid가 감염된 물벼룩과

plerocercoid (sparganum)

가 감염 된 양서 류， 파충류， 조류， 포유 류 및 이들 이행숙주 (transport host) 에 의해 이루 어진다. 이들이 포유동물에 경구 감염되면 위나 장 벽을 통하여 기생부위로 이동하여 기생한다. 그런 데 현재까지 이들 스파르가눔 충체에서 SOD를 순 수 정제하고， 이들 효소의 생화학적 특징들을 보고 한 자료는 아직 발견치 못하였다.

본 연구는 스파르가눔 충체의 SOD가 그들의 생 리적 기능에 미치는 영향， 숙주의 면역반응에 미치 는 영향 그리고 숙주와 기생충의 상호관계 둥을 규명하는 기초 자료를 제시하고자 우선 스파르가 눔 세포질에서 SOD를 순수 정제하여 그들의 생화 학적 특성을 밝히고자 본 실험을 실시 하였다.

n.

^{재료 및 방법}

1.

실험재료

스파르가눔 충체는 자연 감염된 뱀(유혈목이

(2)

Natrix trigria

lateralis) 의 피히- 및 근육조직에서 적 출하였다. 적출된 충체는 생리 식염수와 증류수로 여러 번 세척한 후 냉동 건조시킨 디-음

-70

⁰

C

냉 동실에 보관하면서 제반실험에 시료로 사용하였다.

2.

효소의 활성도 측정

SOD의 활성 측정 은 hypoxanthine과

xanthine oxidase(Sigma)

의 존재 히-에 생 성 되 는 superoxide에 의 해

neotetrazilium chloride(NTC : Sigma)

^{의 환원}

을 억제하는 반응원리에 따라 측정하였다21) 효소 활성도는 NTC의 환원을

50%

억제히·는 효소의 양 을

1

unit 로 하였다.

3.

단백질 정량

정제괴-정 중 각 분획 및 정제된 효소의 단백질 량은

bovine serum albumin (Sigma)

^{을 표준 단백}^질

로 사용하여

Lowry et a

^l.22)의 방법 에 따라 정 량하 였다.

4.

조효소 정제

1) 세 포질

superoxide

dismutase의 추출 냉동건조된 충체 일정량에 냉각된

50 mM potas- sium phosphate buffer(pH

7.8) 을 소량 첨가하여

teflon pestle

homogenizer로 균질화 한 후 냉동원심 기

(Sorvall RC-5B)

로

4

^U

C

에 서

20 , 000

xg로

1

시 간 원심분리하였다.

이들 상층액을 조효소로 사용하였다.

2) Superoxide

dismutase(SOD) 의 정제 SOD를 정 제 하기 위 해

20 mM Tris-HCl buffer (pH

7.2) 로 조효소를 투석 한 다음 동일 완충용액 으로 평 형 된

DEAE-Trisacryl M column(2.6 x 15 cm :

LKB) 에 통과 시켰다. 이때 유속은 시간 당

60

ml로 하고 분획은

fraction collector(LKB 2212

HELILAC) 를 이 용해

3ml

씩 100 개 의 분획 을 얻었다. 흡착된 단백질의 용출을 위해 30 번부터 100 번 분획 까지 0 ，’--‘--‘-‘‘‘‘~O

각 분획은 파장 280nm로 고정된

spectrophoto-

meter로 단백질 홉광도를 측정하였고， 효소 활성도 를 측정한 후 활성이 높은 분획들을 수집하여 냉 동 건조기

(EYELA Freeze Dryer

FD-1) 로 농축시 킨 다음 정제 단계의 시료로 이용하였다. 이들 부 분 정 제 된 시 료는

10 mM citrate buffer(pH 5.0)

^로

투석한 후 동일 완충용액으로 평형된

CM-Trisa-

cryl M column

(1

.6 x 6 cm :

LKB) 에 흡착시킨 디음 등일 완충용액으로 세척히-여 결합되지 않은 단백 질을 제거하고，

0-0.5

1\1 NaCl 로 농도구배를 주었 다. 이때 유속은 시간 당

40

ml 로 하고， 2ml 씩 분 획을 받아 단백질 흡광도와 효소 활성도를 각각 측정하였다. 활성이 높은 분획을 모아 농축한 후 다읍 정제 단계의 시료로 사용하였다 Ion-ex

change column

chromatography 를 실 시 하여 부분 정 제 된 시 료는

0.2 M

KCl을 함유한

50 mM phos- phate buffer(pH

7.8) 로 평 형 된

Sephacryl S-200HR column(

1.

6 x 75 cm :

Pharmacia) 에 시간 당

20 ml

의 유속으로 통과시켜 1.

4 ml

씩 80 개의 분획을 얻 었다. 그리고 이들 분획의 단백질 흡광도와 효소 활성도를 측정하여 활성이 높게 나타난 분획들을 수집 농축한 후 제만실험에 사용하였다.

5.

정제된

Superoxide

dismutase의 생화학적

^i^~

1) Cyanide의 영 향

Cyanide가 정제된 SOD의 활성에 미치는 영향은

Dryer et a

l. 23) 의 방법 에 따라

cyanide

농도를

O.

1mM에서 5.0mM 까지 변화시키면서 효소 활성도 를 측정하였다.

2)

Azide의 영향

Azide7}

정제된 SOD의 활성에 미치는 영향은

Misra and

Fridovich²⁴) 의 방법에 따라

azide

농도를 1mM 에서 20mM 까지 변화시키면서 활성도를 측 정 하였다.

3)

pH의 영향

완충용액의 pH 가 SOD의 활성에 미치는 영향은

Salin and

McCord³⁵) 의 방법 에 따라

50 mM sodium acetate buffer(pH 4.0) , 50 mM Tris-HCl buffer(pH 6.0-8.0) , 50 mM sodium carbonate buffer(pH 10.0

-1 1.0) 동을 완충용액으로 효소 활성도를 측정하

였다.

4)

훈자량 측정

정제된 효소의 분자량 측정은

Sephacryl S-

200HR

column을 사용하여 측정하였다. 정제된 효

소는

0.2 M

KCl을 함유한

50 mM phosphate buffer (pH

7.8) 으로 평형된

Sephacryl S-200HR column

(1.

6 x 75 cm)

에 시 간당 20ml의 유속으로 통과시 켜

1.

4 ml

씩 80 개의 분획을 얻어 이들의 단백질 흡광

도와 효소 활성도를 각각 측정하였다. 분획 중 활

(3)

성이 가장 높게 나타나 분획의

Kav

값을 산정히

여 효소의 분자량을 산정히-였다. 이때 표준단백질

(standard marker protein: bovine serum albu- min ; 66

,

000

,

ovalbumin ; 43

,

000

,

chymotrypsinogen

; 25

,

000

,

ribonu

cI

ease A ;

13 ，000) 을 사용하였다.

5)

정 제 단계 별

SDS-PAGE

정제 단계별 SOD 의 정제상태를 비교 관찰하기 위 하여 Laemmli³⁶) 의 방법 을 변 형 히 여 전 기 영 꽁히

였다. 조효소와 정제 단계별 효소를 7.5%~12 .5%

polyacrylamide linear gradient

gel 을 사용하여 30mA 로 4 시간 전기 영꽁하였다. 영등이 끝난

gel

은

coomassie brilliant blue

R-250(Sigma) 로 염색하 고， gel 에 나타난 단백질 band로 정제상태를 관찰 하였다. 이때 표준단백질의 상대적 이동거리 (Rf) 를 산출하고， 순수정 제 된

SOD

단백 질 band의 이 꽁거리를 대응시켜 효소의 분자량을 산정하였다.

사용된 표준단백 질은

phosphorylase b (94

,

000) bo- vine serum albumin (67

,

000)

,

ovalbumin (43

,

000)

,

carbonic anhydrase(30 , 000) , soybean trypsine inhib- itor(20

,

100)

, α-lactalbumin

(14

,

400)

등이 다.

ill. 결 과

충체의 세포질에 함유되어 있는 SOD를 정제하 기 위해 조효소륜

DEAE-Trisacryl M

column 에 통 과시켜 단백질 흡광도를 측정한 결과

20 mM Tri-

HCl buffer(pH

7.2) 로 용출시킨 분획에서 한 개의 peak( 분획 10~20) 가 나타났고， 0~0.5

M NaCI

농 도구배를 주어 용출시킨 분획에서는 4711 의

peak

(분획 50~58， 60~69，

71-75

, 79-86) 가 나타났 다. 그리고 이들 분획들에 효소 활성도를 조사한 결과 분획 11 번에서 21 번까지 효소활성이 니-타났 다 (data

not shown).

이들 활성이 나타난 분획을 모아 농축한 후 다음 정제 단계인

CM - Trisacryl M

column에 통과시킨 결과 단백질 흡광도는

10mM citrate buffer(pH

5.이로 용출한 분획에서 한 개의 peak( 분획 5~13) 와

0-0.5M NaCI

농도구배를 주 어 용출시킨 분획에서는 3 개의(분획

36-43

,

55- 59

, 60-65) 가 나타났다. 이들의 효소 활성도를 측 정한 결과 분획 37 번에서 42 번까지 효소 활성이 나타나 이들 분획들을 농축한 후 다음 단계의 시 료로 사용하였다 (data

not shown).

이들

ion-ex- change

chromatography를 실 시 하여 부분 정 제 된 시 료는

Sephacryl S-200HR

column 에 통괴-시 킨 결 과 3 개의 단백질 peak( 분획

45-54

,

59-64

,

66-

69) 를 얻었으며， 이들의 효소 활성도를 측정한 결 과 분획 58-64 에서 활성이 나타나 이들 분획들을 농축하여 제반실험의 시료로 사용하였다. 이들 충 체에서 정제된 SOD의 활성도를 측정한 결과 이들 의 활성도는

90

unit/g 이었고， 단백질량은

2

1.

7 mg/

g으로서 비활성도 (specific activity) 는 4.1 이었다.

조효소 및 각 정제 단계별 효소의 정제도를 관찰 한 결과

Table

1 에서 보는 바와 같다.

Table 1. Purification of cytosolic superoxide dismutase from Sparganum Total Total Specific Purifi-

Recovery aC

tI

vlty protem actlvlty cat

lO

n

(units) (mg) (unitfmg) fold (%)

Cytosol 323.8 78.30 4.1

1.

0 100

DEAE-Trisacryl M 156.7

CM-Trisacryl M 70.6

Sephacryl S-200HR 26.9

총단백 질

(total protein)

량에 서 조효소는

78.3

mg 이었으나 최종 정제된 효소에서는

0.05

mg으로 감소되었다. 총활성도 (total activity) 에서 조효소는

323.8

unit 이었으나 최종 정제된 효소는

26.9

unit로 서 역시 감소되었다. 그러나 비활성도 (specific

activity)

는

4.1

unit 에 서

538.0

unit로 증가되 었 다.

이상의 결과 최종 정제된 효소는 조효소에 비해서 13 1.2 배의 정제도 (purification fold) 를 보였다.

정제된 SOD의 생화학적 성상에서

SOD

활성에

9.60 16.2 3.9 48

.4

0

.4

5 156.9 38.3 2

1.

8 0.05 538.0 13

1.

2 8.3

cyanide7}

미치는 영향을 관찰한 결과

Table

2 에서 보는 바와 같이

cyanide

농도가 증가할수록 효소 활성도가 점차 감소하여 3mM 에서 활성도가

100 %

억제됨을 관찰하였다. Azide에 의한 SOD의 억 제효과를 관찰한 결과

Table

3 에서 보는 바와 같이 10mM과

20 mM

azide 에서 각각 13.6% 과

2

1.

5%

로 억제 되었다. 완충용액의 pH가 효소 활성도에 미치는 영향을 관찰한 결괴-

Table

4 에서 보는 바와 같이 pH가 증가할수록 활성도가 점차 증가하디-가

(4)

pH

10 에서 최고 활성을 보여 대조군에 비해 6.2 배 로 증가하였다. 정제된 SOD는 cyanide 에 억제되었 으나 azide에 의해서는 억제되지 않았으며， 완충용 액의 pH가 10.으로 증가하면 효소 활성도가 최대 로 증가하는 것으로 나타났다. 이상의 결과 본 실 험에서 정제된 SOD 가 구리와 아연을 함유한

SOD (Cu ,

Zn-SOD) 로 추축된다.

Table 2. Effect of cyanide on activity of cytosolic superoxide dismutase in Sparganum.

Cyanide

Activity Inhibition concen

tI‘

at

lO

n

(mM) (units/ml) ( %)

Control 30.2 0

(without cyanide)

O.lmM 24.1 20.2

0.3mM 18.8 37.7

0.5mM 14.3 52.6

1.

0mM 1

1.

1 63.2

2.0mM 5.0 83.4

3.0mM 0 100.0

Reaction mixture considered of 0.2 ml of 0.5 M sodi.

um phosphate buffer(pH 7.5) , 0.1 ml of 16% triton X-100 , 0.01 ml of 10 mM EDTA , 0.3 ml of

1.

2 mM neotetrazolium chloride(NTC) , 0.1 ml of 4 mM hypoxanthine , 0.01 ml of xanthine oxidase , cyanide and enzyme in a total volume of 2.0 m

^l.

Table 3. Effect of azide on activity of cytosolic superoxide dismutase in Sparganum.

Azide

Activity Inhibition concentrat

^lO

n

(mM) (units/m

l)

( %)

Control 30.2 0

(without cyanide)

1.

0mM 30.2 0

5.0mM 30.2 0

10.0 mM 26.1 13.6

20.0 mM 23.7 2

1.

5 Reaction mixture considered of 0.2 ml of 0.5 M sodi- um phosphate buffer(pH 7.5) , 0.1 ml of 16% triton X-100 , 0.01 ml of 10 mM EDTA , 0.3 ml of

1.

2 mM neotetrazolium chloride(NTC) , 0.1 ml of 4 mM hypoxanthine , 0.01 ml of xanthine oxidase , cyanide and enzyme in a total volume of 2.0 m

^l.

Table 4. Effect of pH on activity of cytosolic superoxide dismutase in Sparganum.

Activity

Acαti\、va라tion

pH (units/ml) (fold)

Control(pH 7

.5)

30.2

1.

0 4.0 3.0 0.1

6.0 12.1 0

.4

8.0 63

.4

2.1 10.0 187.2 6.2

1

1.

0 75.5 2.5

Same as the standard assay , except that it contains 0

.5

M sodium acetate(pH 4.0) , 0.5 M Tris-HCl(pH 8.0) , 0.5 M sodium carbonate(pH 10.0) as the buff- er.

정 제 된 효소의 분자량을

Sephacryl S-200HR col-

umn 으로 측정한 결과 분획 62 번에서 가장 높은 peak 가 나타나 이 분획의

kav

값을 계산한 결과

native

분자량은 33kDa 이 었 다. 또한

SDS-PAGE

를 실시하여 정제된 효소의 정제도 및 분자량을 확인한 결과 최종 정제된 효소에서 하나의 단백질

band

(l

ane

D) 가 관찰되었다. 이들의 분자량을 측정 한 결과

16

kDa으로 나타나 스파르가눔 세포질에 서 정제된 SOD는 2 개의 동일한 단백질로 구성된 dimer 임을 확인할 수 있었다. 또 조효소가 정제 과 정을 거치면서 순수하게 정제되었음을 확인하였다.

N. 고 찰

현재

superoxide

dismutase(SOD) 가 함유하고 있 는 금속에 따라

Mn-SOD

,

Fe-SOD

,

Cu

,

Zn-SOD

동 으로 구분하는데， 이들 효소는 많은 진핵세포와 원 핵세포에서 정제되고 또 그 특성들에 관하여 여러 연구자들이 보고하였다23 ， 25-33) ^• 이들 중

Cu

,

Zn-

SOD는 고동 동식물의 세포질에 존재하며，

cyanide

에 의해 활성이 억제되며， azide 에는 영향을 받지 않는 것으로 보고되었다34).

여러 종류의 기생충에서 SOD를 정제하고， 그 특 성 이 보고되 었는데， 선충류인

Trichinella spiralis

¹⁶⁾,

홉충류인

Paragonimus

ψestermaπi¹⁸) 과

Fasciola he- patica

^l9) 동의 세포질에서 정제된

Cu

, Zn-SOD가

cyanide

농도(1

mM-3

mM) 에서 효소 활성도가

100%

억제되었다고 보고하였고，

azide

농도 (5mM

-20

mM) 에서 효소 활성이 억제되지 않는다고 보 고하였다. 본 실험에서 스파르가눔 세포질에서 정 제된 SOD는

3 mM

cyanide 에서

100%

억제되었으

(5)

Di, 10mMJ?i- 20mM.9.l azideoJlA-l z.t-4 13.6%, 21.

~<{]-o-1-~.JI, Aafill~ Jt~-c

pH 10oJlA-l 3:ltH.9.J

~

5% Q:)ftl]!iO]<;ct-c.l-. Aaftll-'8

Jt~.9.J ~_~-(]-€:--

pH 10.0oJl

-A(]-~ &~t:j-. 3:.~ *7-}~.g-

34kDao]TJ:1,

o]~.g_

Al

d':lt:Jl~ ~7}(6.21:ll]) -o}-~_9_TJ:1,

pH 1l.OoJ]A1.C 16kDa<{]

%~ t;±~~~ -T-_~-3~

dimer 'll%

'?:[

9-

_2_

if]

2=1 {} ~ ~-g_- 21!_ O:j

T sct t:j-.

^:1_

c.] .J2 Aj fill-'8

Jl~ ~l

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.C ~Jl~_9.j

1311:ll] AJfil]!iOl<;ct-c.l-. Oj-"J_9.j

~JJl-~.g_

T. spiralis, P. westermani, F. hepatica %oJl Al Aa

A-ll~

SOD9.} l:ll

~~ ⁰d'-"J~- &~-c.]-

. .:E

~ ~7-]-~oJ]A-j T.

spiralis.g- 36 kDa

¹⁶l,

P. westermani.g- 34 kDa

¹⁸l

:l_c.j .J2 F.hepatica.g_ 34 kDa

¹⁹l _9_~

271] .9-j

~-~ ~ t;±~ ~

~

T--Acl

~

dimertl-.JI &.JI

-o]-~

-E t-J],

~

1l

~

oJ]

A~

Aafill~

SOD.9.j native

~7-l-~.g-

33kDaclTJ:1, SDS- P AGE

_~-J

oJ] Al

~

7-l-

~

o l 16 kDa 01] Al

~

71].9-J band 7}- y-E}y- ol

~ ~

J.]

-~~ ~ t;±l1lj ~~

-T--AcJ-'8

dimer~ ~Aj~-c.}.

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oJ] A-j Aa

A-ll~

SO D-e

~.A}~.

cyanide9.} azide7l- Jl

~.9-j ~-Ac}

oJ] u]

~l-E

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Jl~ ~-Ac}

oJ] n]

~1

~-

"Ji>J= -%

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-Ac}-"J-cl 1!%-fr(T. spiralis),

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westermani, F. hepatica)oJ]A-j

Aaftll~

Cu, Zn-SOD31}

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SOD-E azideoJ]-E q3

i>J=~- ~.A] ~o}

o]

~

Aj

fill~

Jl~-E

-T-C-]9-J-

o}~% ?:1-%~

Cu, Zn-SOD

qJ-~

v.

^~

.7-J-'t}

{J-~-'8 B~ojl),l ~J!j-_E!__7}~%

;(l]1J"O}.J2, Ol

~ A-ll.¥.~oJlA-l

superoxide

dismutase(SOD)~

DEAE-, CM-Trisacryl M ion-exchange chromatog- raphy 3J Sepharcryl S-200HR column chromatog-

raphy~

1lJ.]-8-}-0:j €-9-

Aafil]-8-}~t:]-. Aafill~

SOD.9.j

~_~-a£

-i::- Noritaka et al(1982) . .9.j BJ-l:fl Oll .9-j ill]

~

(Cu, Zn-SOD)c]TJ:1,

AJfill~ Jl~.9.j l:l]~-Ac]£-E

538.0 unite]

~_9_TJ:1, ~.7-}~.g-

33 kDao]

~.Jl,

SDS- PAGEoJ] .9-Ji>Jl 16kDa.9.J

t;±~~~ T-_~-a~

dimero]

-Ac}o] 100%

~fil]:s:.]~.JI,

20mM azideoJ];,-j 21.5%

Q:]ftll:s:.J~t:J-. Aafill~ Jt~-c

pH 1o.ooJ1A-1

Jt~ ~_~-a

Purification and Partial Characterization of Superoxide Dismutase from Sparganum

Rha, D. J.

Dept. of Clinical Pathology, Seoul Health Junior College

ABSTRACT

Sparganum of Spirometra plerocercoid were ob- tained from naturally infected snakes(Natrix trigria lateralia) collected in Korea. The superoxide dismutase(SOD) of spargana was purified 131.2 fold using CM, DEAE-Trisacryl M ion-exchange chromatography and Sepharcryl S-200HR molecu- lar sieve chromatography. The enzyme activity was measured(538 unit/mg of specific activity) by meth- od of Noritaka et al.(1982). Molecular weight of the

enzyme was estimated to be 33 kDa by molecular

sieve chromatography and 16 kDa on reducing SDS

-PAGE which indicated a dimer protein. The en-

zyme exhibited the enhanced 6.2 times more than

control(pH 7.5) activity at pH 10.0 The enzyme to-

tally disappeared 100% at 3.0 mM cyanide while it

remained 78.5% even in 20 mM azide. These finding

indicated that the purified enzyme was copper and

zinc containg Cu, Zn-superoxide dismutase(Cu, Zn-

SOD) type.

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