HIV 1형 RNA Viral Load 검출을 위한 두 가지 실시간 핵산증폭법의 비교

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접수일：2008년 12월 23일, 승인일：2008년 12월 25일

HIV 1형 RNA Viral Load 검출을 위한 두 가지 실시간 핵산증폭법의 비교

김수정¹ㆍ이은경¹ㆍ박윤희²ㆍ김현숙¹

연세대학교 의과대학 진단검사의학교실¹, 관동대학교 의과대학 진단검사의학교실²

= Abstract =

Comparison of Two Commercial Real-time Nucleic Acid Amplification Methods for Detecting the Viral Load of Human

Immunodeficiency Virus Type 1

Sue Jung Kim¹, Eunkyung Lee¹, Younhee Park², Hyon-Suk Kim¹

Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine¹, Seoul, Kwandong University College of Medicine², Goyang, Korea

Background: Detection of the viral load of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) RNA is important for clinical decision making and for determining the prognosis of HIV-infected patients. The aim of the study is to compare the performance of real-time RT-PCR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1, CAP/CTM, Roche Diagnostics) and the Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NucliSens EasyQ HIV-1, NucliSens, BioMerieux) methods for testing Korean HIV-infected patients.

Methods: Among the specimens that were requested to undergo HIV-1 RNA viral load detection from 2005 to 2006, 153 specimens were selected based on the status of the specimens. The CAP/CTM and NucliSens tests were performed according to the manufacturer’s instruction.

Results: HIV-1 RNA was detected by both tests in 93 specimens. Among the remainder, CAP/CTM detected HIV-1 RNA in 10 specimens, while the same specimens showed results lower than the detection limit with using the NucliSens. Though the results were appropriately correlated (r=0.85, P＜0.0001), the mean differences between the two test results were −0.1321 log10 IU/mL on the Bland-Altman test.

Conclusion: The methodologic difference or the presence of a HIV subtype may affect the agreement between the two tests. The standardization of methods and the establishment of a linear range for the individual laboratory results may be helpful to obtain accurate test results. (Korean J Blood Transfus 2008;19:216-221)

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Key words: HIV, Viral load, RT-PCR, NASBA

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서 론

1982년 수혈에 의한 Human Immunodeficiency Virus (HIV) 감염이 미국에서 처음 보고된 이후, 전파 위험이 있는 공여자를 제한하는 등 감염을 예방하려는 노력이 시작되었다.^1,2) 이후 여러 가 지 진단기법의 발달로 분자유전학적 방법으로 HIV를 검출하기에 이르렀다. 국내에서는 항체미 형성기의 감염을 줄이기 위해 2005년 2월부터 헌 혈혈액에 대해 핵산증폭검사를 시행하고 있다.^3,4) 일단 HIV 감염이 진단된 환자의 경우, 병의 진 행정도를 확인하여 치료를 결정하고, 치료 반응 을 확인하며, 예후를 파악하는 데에 정확한 HIV RNA 정량이 매우 중요하다.⁵⁾ HIV 1형(HIV-1) RNA를 정량하는 여러 가지 방법들이 있으나 가 장 널리 쓰이는 방법은 3가지로, 실시간 RT-PCR 과 Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), branched DNA (bDNA) 방법이 상업적 으로 개발되어 있다.⁶⁾ 본 연구에서는 한국인 HIV 환자들을 대상으로 하여 real-time PCR법을 이용 한 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 (CAP/CTM, Roche Diagnostics, Meylan, France) 시 험과 NASBA법을 이용한 NucliSens EasyQ HIV-1 (NucliSens, BioMerieux, Lyon, France) 시험을 동 일 검체에서 시행하여 그 결과를 비교하였다.

재료 및 방법

2005년부터 2006년까지 세브란스병원에 HIV-1 RNA 정량검사가 의뢰된 검체 중 검체 상태 등을 고려하여 153개를 선택하여 시험하였다. 동일한 환자에서의 중복검사는 제외하였다. 검체는 EDTA 튜브에 채취한 전혈을 이용하였고, 검체가 검사 실에 도착하면 바로 혈장을 분리하였으며, 분리 한 혈장은 시험할 때까지 −70^oC에 냉동 보관하

였다. 이때 혈장을 바로 분리하기 어려운 경우에 는 냉장보관하였으며 6시간이 경과하지 않도록 하였다.

CAP/CTM 시험은 제조사의 지침에 따라 시행 하였다. 환자 혈장과 정도관리 물질을 각각 분주 하여 COBAS Ampliprep (Roche Diagnostics)에서 핵산을 추출하였다. COBAS Ampliprep에서 얻은 핵산을 이용하여 COBAS TaqMan 48 (Roche Diag- nostics)에서 검사를 시행하였다.

NucliSens 시험도 시약제조원의 지침에 따라 시행하였다. NucliSens lysis buffer (BioMerieux)를 환자의 혈장에 섞고, NucliSens Magnetic Extrat- cion Reagents (BioMerieux)와 NucliSens mini MAG (BioMerieux)을 이용하여 핵산을 추출하고, 이를 튜브에 분주하고, 준비한 시발체 용액을 섞은 후, NucliSens EasyQ Incubator (BioMerieux)에서 65ôC 에서 2분간, 41ôC에서 2분간 배양하였다. 튜브 뚜 껑을 열고 준비한 효소 용액을 섞고, 41ôC에서 2 분간 배양하였다. 원심분리한 후 다시 잘 섞고, 다시 원심분리하여 다시 NucliSens EasyQ Incu- bator에서 41ôC로 가온하였다. 튜브를 41ôC로 미 리 가온한 NucliSens EasyQ Analyzer (BioMerieux) 에 넣고 검사를 시행하였다.

모든 통계학적 분석은 log를 취한 결과값을 이 용하였다. 두 검사 간의 상관성 분석을 위해 Pear- son 검정을 하였고, 선형회귀분석을 시행하였다.

또한, 일치도를 확인하기 위해 Bland-Altman 검정 을 시행하였다. 모든 통계학적 분석은 Analyse-it Standard Edition (Analyse-it Software, Ltd., Leeds, United Kingdom)을 이용하였다.

결 과

총 153 검체 중 93개의 검체가 두 시험에서 모 두 HIV-1 RNA 양성결과를 보였다. 나머지 검체

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Table 1. The results of COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan HIV-1 test and NucliSens EasyQ HIV-1 test

COBAS AmpliPrep/

COBAS TaqMan HIV-1

‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐ Total No. No.

positive negative NucliSens No. positive 93 0 93 EasyQ HIV-1 No. negative 10 50 60

Total 103 50 153

Fig. 1. Scatter plot of log10 CAP/CTM vs. log10

NucliSens with fitted regression line.

Abbreviations: CAP/CTM, COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan HIV-1; NucliSens, NucliSens EasyQ HIV-1.

Fig. 2.The Bland-Altman plot of log10 CAP/CTM and log10 NucliSens. The mean difference (−0.1302 log10 IU/mL, solid line) and limits of agreement (mean±2 standard deviation, −1.3254 to 1.0613 log10 IU/mL, dotted line) are displayed in the plot.

Abbreviations: See Fig. 1.

중 10검체는 CAP/CTM 시험으로 HIV-1 RNA가 검출되었으나 NucliSens 시험으로는 검출한계 이 하의 결과를 보였다(Table 1). 2개의 검체가 분석 가능한 선형범위(linear range) 이상의 결과를 보 여 분석에서 제외하였다.

Pearson 검정 결과 상관계수 r=0.85 (P＜0.0001) 이었고, 산점도(scatter plot)를 Fig. 1에 나타내었 다. 선형회귀분석 시 절편은 0.5707 (95% 신뢰구 간 0.12∼1.02), 기울기는 0.8231 (0.71∼0.93)이었

다. Bland-Altman plot을 통해 두 결과 값의 차이 가 전체 검사범위에 고루 분포되어 있음을 알 수 있었다(Fig. 2). 두 결과 값의 차이의 평균은 −0.1321 log10 IU/mL이었다.

고 찰

본 연구에서는 한국인 HIV 감염 환자들을 대 상으로 두 가지 실시간 핵산 증폭법의 HIV-1 RNA viral load 검사 결과를 비교하였다. 실시간 RT-PCR과 NASBA 시험 결과에 대해 Pearson 상 관 분석을 시행하였을 때, 상관계수가 0.85로 적 절한 상관성을 보였으나, 선형회귀분석을 통해 얻은 기울기(0.8231)가 1보다 낮은 값을 보였으 며, Bland-Altman 검정에서 두 결과값 차이의 평 균값이 −0.1321 log10 IU/mL로 CAP/CTM이 Nu- cliSens에 비해 전체적으로 낮은 값을 보였다.

HIV-1 RNA viral load를 측정하는 분자진단기법

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COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan HIV-1 NucliSens EasyQ HIV-1

Target region gag gag

Method Real-time RT-PCR Nucleic Acid Sequence Based Amplification Linear range 24.4∼5,882,352.9 IU/mL

(40∼10,000,000 cp/mL)

50∼3,000,000 IU/mL

Limit of detection

24.4 IU/mL 25 IU/mL

Specimen EDTA plasma EDTA plasma

Required specimen volume

1 mL 1∼2 mL

Specimen handling

Whole blood (EDTA) can be stored at 2∼25^oC for 6 hours

Whole blood (EDTA) can be stored at room temperature for up to 24 hours

Specimen storage

EDTA plasma can be stored - up to 1 day at room temperature - up to 5 days at 2∼8^oC - for ≥5 days at −20 to −80^oC

EDTA plasma specimens can be stored in NucliSens Lysis Buffer

- up to 1 year at −70^oC

- for a maximum of 14 days at 2∼8^oC

- for a maximum of 24 hours at room temperature (15∼

30^oC)

Table 2. Characteristics of the two methods of real-time nucleic acid amplification 들이 개발되고 있는데, 이 방법들의 상관성 및 일

치도에 대해서 많은 연구가 이루어지고 있다. 연 구자와 연구대상, 검사 방법에 따라 높은 일치도 를 보고한 연구도 있고,⁷⁾ 일치도가 낮았다고 보 고한 문헌도 있다.⁸⁾ 본 연구에서 두 검사간의 일 치도가 그다지 높지 않은 것은 방법상 원리가 다 르다는 것이 가장 큰 원인일 것으로 생각되었다.

두 검사의 특징은 Table 2에 요약하였다. 두 검사 모두 HIV gag 부분에 대한 시발체를 사용하지만 RNA 추출 방법부터 다르고, 증폭 방법에 있어 큰 차이가 있다. 두 시험 결과의 차이는 특히 non-B 아형 검출시 두드러지는데, 현재 출시되고 있는 분자유전학적 검사들은 모두 HIV-1 B 아형을 검 출하는 데에 최적화되어 있는 검사들이다. HIV-1 B 아형은 유럽과 미국에서 검출되는 HIV의 대부 분을 차지하며,^9,10) 국내에서도 B 아형이 주로 검 출된다.¹¹⁾ 그러나 개발도상국에서는 non-B 아형

에 의한 감염이 많은 것으로 보고되고 있으며, 유 럽과 미국에서도 non-B 감염이 증가추세에 있고, 국내에도 2001년 보고에 따르면 해외에서 감염된 환자에 의한 non-B 아형의 전파도 관찰되었다고 하였다.¹²⁾ CAP/CTM의 경우, 제조사에서 자체적 으로 시험한 결과 HIV-1의 모든 non-B 아형에 50 copies/mL 이하의 민감도를 보였고, NucliSens의 경우에도 M 아형의 A부터 J아형까지 모두 검출 가능하였다고 하였다. 그러나 HIV-1 non-B 아형 이 검출되었던 환자로부터 의뢰된 검체를 대상으 로 Versant HIV-1 RNA bDNA v3.0 (Bayer Diag- nostic, Tarrytown, USA), CAP/CTM와 NucliSens, 3 가지 검사를 비교한 연구에서, 38.6%의 검체에서 세 검사 모두 HIV-1 RNA를 검출하였고, 나머지 검체 중 14.6%, 32.7%에서 각각 CAP/CTM과 Nu- cliSens가 HIV-1 RNA를 검출해내었다.¹³⁾ 두 검사 결과간 viral load 차이가 1 log 이상인 경우가

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5.4%, 0.5 log 이상인 경우가 29%였으며, 특히 G 아형과 재조합형인 CRF10_CD형인 경우, 이러한 차이가 더욱 두드러졌다고 하였다. 본 연구에서 환자에서 검출된 HIV의 아형은 확인하지 못하였 으나 non-B 아형이 포함되어 있었다면 두 검사결 과가 더욱 차이를 보이도록 하였을 가능성이 있 다. 아형 및 새로이 발견되는 재조합형과 변이들 을 검출하기 위해서는 기존의 검사가 꾸준히 개 선되어야 할 것이며 검사간의 방법적 차이를 극 복하기 위해서는 검사간 표준화가 필요할 것으로 생각된다.

또한, 본 연구에서는 각 검사의 선형성을 평가 하지 않고 제조사에서 제공한 선형 범위, 측정 가 능 범위를 적용하였으나 실제로 검사실의 여러 가지 환경적 요인에 따라 선형 범위가 제조사가 제공한 범위와 다를 경우, 고농도나 저농도 검체 에서 차이를 보일 수도 있다. 별도로 선형 범위를 평가하지 않은 것이 본 연구의 한계점이며, 고농 도 및 저농도 검체에서 정확한 측정을 위해서는 선형 범위를 평가하고 정비하는 것이 필요할 것 으로 생각된다.

CAP/CTM 검사를 통해 NucliSens에서는 검출 한계 이하의 결과를 보였던 10개의 검체에서 HIV-1 RNA viral load를 검출할 수 있었다. 제조 사에서 제공하는 검출한계는 CAP/CTM의 경우, 24.4 IU/mL, NucliSens의 경우 25 IU/mL로 큰 차 이가 없으나 실제로는 CAP/CTM이 더 민감하게 HIV-1 RNA viral load를 검출할 수 있었다. 반면, 직접 실험을 통해 확인하지는 못하였지만, Nu- cliSens의 경우, 검사 전까지 검체가 더 안정한 것 이 장점이라고 하였다(Table 2).

CAP/CTM과 NucliSens는 HIV-1 RNA viral load 검출에 있어서 적절한 상관성을 보였으나 일치도 는 높지 않았다. 이는 두 검사의 방법적 차이나 아형의 존재 등에 의한 것일 가능성이 있다. 따라

서 viral load 검사 방법들 간의 표준화가 필요할 것으로 생각되며, 각 검사실마다 선형 범위에 대 한 평가를 시행하여 검출 한계를 정비하는 것이 고농도 및 저농도 검체의 정확한 측정에 도움이 될 수 있을 것이다.

요 약

배경: HIV RNA viral load 검출은 HIV 감염 환 자의 치료 결정 및 예후에 매우 중요하다. 본 연 구에서는 국내에서 사용되고 있는 실시간 핵산증 폭법 두 가지, 즉 real-time PCR법을 이용한 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 (CAP/CTM, Ro- che Diagnostics) 시험과 Nucleic Acid Sequence Based Amplification법을 이용한 NucliSens EasyQ HIV-1 (NucliSens, BioMerieux) 시험 결과를 비교 하였다.

방법: 2005년부터 2006년까지 세브란스 병원에 HIV-1 RNA viral load 검출이 의뢰된 검체 중 검 체 상태 등을 고려하여 153 검체를 선택하여 제 조사의 지침에 따라 CAP/CTM, NucliSens 검사를 시행하였다.

결과: 두 검사에서 HIV-1 RNA가 모두 검출된 검체는 93개이었고, 나머지 중 10검체는 CAP/

CTM으로 검출되었으나 NucliSens로는 검출한계 이하의 결과를 보였다. 상관성 분석에서 r=0.85 (P＜0.0001)로 적절한 상관성을 보였으나 Bland- Altman 분석에서 두 결과 값의 차이의 평균은 −0.1321 log10 IU/mL로 NucliSens가 높은 값을 보였다.

결론: 두 검사 결과는 그 방법적 차이나 아형의 존재 등에 의한 영향 때문에 차이를 보일 수 있 다. 검사방법의 표준화 및 각 검사실 내 선형범위 의 정비가 정확한 검사에 도움이 될 수 있을 것으 로 생각된다.

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