of Penta-O-galloyl-β-D-glucose in Extract of Evening-primrose Seeds as Dietary Supplement by High-Performance Liquid Chromatography

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http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.2.143 ISSN 1225-7117 / eISSN 2288-8268

고성능 액체크로마토그래피를 이용한 식이보충제 달맞이꽃종자 추출물의 펜타갈로일-β-D-글루코스의 검증된 분석법 개발과 응용

박상욱¹, 김광준², 이원재^1,3*

Development and Application of a Validated Determination

of Penta-O-galloyl-β-D-glucose in Extract of Evening-primrose Seeds as Dietary Supplement by High-Performance Liquid Chromatography

Sang-Wook Park¹, Kwang Joon Kim², and Wonjae Lee^1,3*

Received: 5 February 2020 / Revised: 28 February 2020 / Accepted: 3 March 2020

Abstract: The purpose of this study is to develop and apply for determination of penta-O-galloyl-β-D-glucose (PGG), an essential marker compound in extract of evening-primrose seeds used as dietary supplement using by high-performance liquid chromatography (HPLC). Liquid chromatography was performed on a Capcellpak UG 120 column (4.6 mm ID × 250 mm, 5µm) using the gradient elution system developed in this study. According to the guidelines of the Association of Official Analytical Chemists for dietary supplements, the performance characteristics of HPLC were evaluated in terms of selectivity, linearity, precision, accuracy, recovery, limit of detection and limit of quantification. The calibration curve was highly linear (the coefficient of determination: 0.9999) within the concentration range of 0.42~26.88µg/mL for PGG.

The limit of detection and limit of quantitation of PGG in this method were 0.04µg/mL and 0.13 µg/mL, respectively. This

analytical method for determination of PGG as the marker compound was applied for domestic commercially available three extracts of evening-primrose seeds used as dietary supplements. The recoveries for these three fortified concentrations were 96.7~100.6%, 96.5~98.3% and 100.6~104.2%, respectively. It is expected that the validated HPLC analytical method developed in this study will be usefully applicable to determination of PGG in extract of evening-primrose seeds as dietary supplement for its quality control.

Keywords: dietary supplement, extract of evening-primrose seeds, penta-O-galloyl-β-D-glucose, high-performance liquid chromatography

1. INTRODUCTION

달맞이꽃 (Oenothera biennis L.) 종자에는 linoleic acid를 가 장 많이 함유하고 그 외에 γ-linolenic acid, oleic acid 등 불포 화 지방산 뿐만 아니라 플라보노이드류, 폴리페놀 화합물들 도 함유되어 있는 것으로 알려져 있다 [1]. “달맞이꽃 종자 추출물”은 포도당 흡수를 억제하여 식후 혈당상승 억제에 도움을 줄 수 있는 건강기능성 식품의 식이보충제를 위한 기 능성원료로 사용되고 있다. 이를 위해 달맞이꽃의 종자를 압 착하거나 또는 hexane을 이용해 지방을 제거하고 유효성분 을 60% 주정으로 추출한 후, 농축 및 분무건조과정을 거쳐

1조선대학교 대학원 식품의약학과

1Department of Food and Drug, Chosun University Graduate School, Gwangju 61452, Korea

2우석대학교 약학대학 약학과

2College of Pharmacy, Woosuk University, Wanju 55338, Korea

3조선대학교 약학대학 약학과

3College of Pharmacy, Chosun University, Gwangju 61452, Korea Tel: +82-62-230-6376

Fax: +82-62-608-5297 E-mail: [email protected]

Research Paper

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제조하고 있으며 폴리페놀 화합물중 하나인 penta-O-galloyl β-D-glucose (PGG)를 이 추출물의 지표성분으로 하도록 되 어있다 [2]. 지표성분인 PGG는 달맞이꽃 종자만이 아니라 개옻나무, 오배자, 작약, 망고씨, 석류잎 등 여러 식물에 함유 되어 있고 다양한 생리활성 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다 [3]. 이들 생리활성 중에서, PGG 화합물이 탄수화물이 대사되어 흡수하는 과정에서 α-glucosidase inhibitor 작용으 로 탄수화물이 올리고당 등으로 분해되는 과정을 방해하여 식후 혈당상승을 완화시키는 효능들에 대해 발표되었다 [3- 5]. 작약 (paeonia lactiflora) 추출물의 PGG도 식후 고혈당증 에 미치는 억제효과를 가져오며 이는 새로운 효능식품으로 이용가치가 있음이 보고되었다 [6]. 혈당이 높은 경계 대상 자에 대한 임상실험에서도, 달맞이꽃종자 주정추출물은 식 후 혈당의 상승속도를 느리게 하고 공복혈당, 당화혈색소를 감소시킴으로 당뇨환자에게도 유용한 것으로 보고되었다 [1]. 이러한 생리활성 외에도 달맞이꽃종자 추출물의 지표성 분으로 사용되는 PGG는 폴리페놀성 화합물로서 항산화활 성, 항암활성, 항바이러스, 항균성, 소염기능, 항돌연변이 및 면역활성 등 매우 다양한 효능이 있는 것으로 연구되었다 [3,7,8]. 이와 같이 PGG를 함유하고 있는 달맞이꽃종자 추출 물이 현재 국내외로 식이보충제로 사용되고 있고, 건강기능 성 원료로서 이를 이용한 식품산업의 잠재적 가능성이 있음 에도 불구하고, 식이보충제 기능성원료로 사용하기 위하여 달맞이꽃종자 추출물의 주요 지표성분인 PGG에 대한 검증 된 분석법에 대하여 보고된 바가 없기에 본 연구에서 이를 개발하고자 하였다.

Gallotannin을 생합성하는 연구에서 합성되는 PGG를 순상 과 역상 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 분 석한 방법이 보고되었지만 그 분석법을 본 연구에 이용하기 는 적합하지 않았다 [9]. Zhao 등은 high-speed counter-current chromatography를 이용하여 만주고로쇠 (Acer truncatum bunge) 추출물로부터 PGG를 순수하게 분취 분리하는데 성공적으 로 보고하였으나, 여러 천연 혼합물중에서 PGG를 분리하는 HPLC 분석법이기에 본 연구의 달맞이꽃종자 추출물을 이용 한 식이보충제에 적용하기는 적절하지 않았다 [10]. 또한 Schinus terebinthifolius 종류인 브라질 후추나무 잎에서 추출 한 PGG를 포함한 여러 혼합물의 항알러지 효과를 위한 동물 실험 연구결과와 함께 사용된 HPLC 분석조건도 여러 천연 혼합물에서의 분석이기에 본 연구에 적용하기는 적절하지 않았다 [11]. Mahajan 등은 phenyl 타입의 역상 HPLC 칼럼을 이용하여 가자나무 (Haritaki churna)에서 추출한 PGG 분석 법을 개발하였고 PGG 분석을 위한 직선성, 회수율, 정확성, 검출한계 및 정량한계를 보고하였다 [12]. 그러나 이 결과도 PGG를 포함한 7개의 phytochemical 물질의 동시분석법에 관 한 것이기에, 본 연구목적인 식이보충제로 사용되는 달맞이 꽃종자 추출물에서 PGG 분석에 사용하기는 적합하지 않았 다. 한편 Lü 그룹에서 tannic acid로부터 PGG를 분리분취를 한 다음, ODS 컬럼상에서 HPLC를 이용한 PGG의 약동력학 적인 동물실험 연구결과와 limit of detection (LOD)와 limit

of quantitation (LOQ) 결과까지 보고하였다 [13].

앞에서 기술한 바와 같이, 건강기능성 원료의 기준과 품질 관리 등을 위하여 달맞이꽃종자 추출물의 주요 지표성분인 PGG를 위한 검증된 분석법을 필요로 하고 있지만, 현재까지 이와 관련된 검증된 분석법이 보고된 바가 없다. 본 연구에 서는 달맞이꽃종자 추출물 기능성 원료를 이용하여 건강기 능식품으로 시판되고 있는 시료를 대상으로 Association of Official Analytical Chemists (AOAC) 가이드라인의 검증절 차에 따라 적합성, 최적성, 안정성을 고려하여 HPLC를 이용 한 최적의 검증된 분석법을 개발하여 식이보충제로 시판되 고 있는 제품에 적용하고자 하였다 [14]. 지난 연구에서 식이 보충제 히알루론산의 검증된 분석시험법을 표준첨가법으로 개발하여 이들에 대한 품질관리의 기초자료로 사용되도록 발표했던 것처럼 [15], 본 연구결과를 식이보충제 달맞이꽃 종자 추출물의 기준 및 규격관리와 관련된 자료로 활용하고 자 하였다.

2. MATERIALS AND METHODS 2.1. 시약 및 기기

표준물질 PGG는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)로부 터 구입하였고, 아세트산은 Kanto Chemical사 (Tokyo, Japan) 에서 구입하였다. 또한 메탄올 (methanol)과 아세토니트릴 (acetonitrile)은 Merck사 (Darmstadt, Germany)로부터 HPLC 급을 구입하여 사용하였다. 초순수는 EASY pure system (Barnstead, Dubuque, IA, USA)에 의해 18.0 MΩ 수준으로 정 제된 물을 사용하였다. 본 연구에서 사용한 달맞이꽃종자 추 출물의 식이보충제 용도의 시료는 국내 대형마트에서 직접 구입했으며, 원료 특성에 따라 시료 I-III으로 구분하여 사용 하였다.

지표성분을 분석하기 위해 PDA(Photo diode array)가 달린 Nanospace SI-2 (Shiseido Co., Japan)를 사용하였으며, 컬럼 은 Capcellpak C18 UG120 (4.6 × 250 mm, 5µm, Shiseido, Japan) 을 사용하였다. 본 연구에서 PGG분석을 위한 분리분석조건 을 위해 기존 연구의 HPLC 분석법을 개선하여 gradient 용리 조건으로 사용하였다 [13]. 이동상으로 0.3% 아세트산 수용 액(A)과 0.3% 아세트산과 5% 물이 들어간 아세토니트릴 수 용액(B)을 사용하였고 분당 1.0 mL의 유속과 측정파장 UV 280 nm로 설정하였으며, 기타 gradient 용리조건을 포함한 HPLC 분석조건은 Table 1과 같다.

2.2. 표준용액과 시험용액의 조제

표준물질 PGG 10 mg을 정밀히 달아 80% 메탄올 100 mL에 녹여 표준원액으로 하고 위 용액을 80% 메탄올로 적절히 희 석하여 표준용액으로 하였다. 시험용액의 조제를 위해 서로 기질 (matrix)이 다른 달맞이꽃종자 추출물의 식이보충제로 시판되고 있는 대표적인 3개 제품의 표본시료를 대상으로 사용하였다. 캡슐을 제거한 후 균질화기로 완전히 균질화시

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킨 후 일정량을 50 mL 용량플라스크에 취하였다. 그리고 80% 메탄올 25 mL를 가하여 10분간 초음파 추출 후 실온에 식혀 80% 메탄올로 정용한다. 추출액을 실린지용 필터 (0.45µm)로 여과하여 시험용액으로 하였다.

2.3. 시험방법의 검증 2.3.1. 적용성 (applicability)

서로 다른 기질의 시판되고 있는 시료에 대하여 최적의 분리 능을 결정하기 위해서 AOAC 가이드라인의 신뢰도 특성 (reliability characteristics)에서 제안하고 있는 정확성, 반복정 밀성, 재현정밀성, 중간 정밀성, 정량한계, 검출한계 등을 제 시하고자 하였다 [14].

2.3.2. 선택성 (selectivity)

표본시료에서 잔존하는 방해물질을 제거함과 동시에 지표 성분을 효과적으로 추출할 수 있는 방법을 제시하며, 크로마 토그래피를 이용하여 최적의 상태로 정량화 할 수 있는 분리 능으로 선택성을 평가하였다.

2.3.3. 직선성(linearity)

표준용액을 이용하여 농도범위를 선정하고 농도와 기기 반 응 시그널간의 함수 관계를 그래프로 나타내었다. 선형성의 적 절성을 판단하기 위해서 결정계수(coefficient of determination)는 AOAC 가이드라인에서 제안하고 있는 결정계수가 0.99 이 상인지를 확인하였다 [14].

2.3.4. 정확성(accuracy)

시료가 전체 시험법을 거쳐 회수되는 백분율을 확인했으며, 표준물질 첨가법에 따라 단일 분석용액에 대해 측정하고 같 은 수준 및 원래 수준의 2배 또는 3배의 표준분석물을 추가 하여 확인하였다.

Recovery(%) = (C_f− Cu) × 100/C_a

C_f= Concentration of the fortified in test sample C_u= Concentration of the unfortified in test sample

C_a= Calculated(not analyzed) concentration of analyte added to the test sample

2.3.5. 검출한계 (limit of detection, LOD) 및 정량한계 (limit of quantitation, LOQ)

검출한계 및 정량한계는 공시료 (blank)의 측정값에 공시료의 표준편차를 3배를 더한 값을 검출한계로 했으며, 표준편차를 10배를 더한 값을 정량한계로 하고, 그 식은 다음과 같다.

LOD = X_BI+ 3S_BI LOQ = X_BI+ 10S_BI X_BI= Blank value

S_BI= Standard deviation of the blank

2.3.6. 반복정밀성 (repeatability precision)

짧은 시간 내에 분석자, 시약, 장비, 기구 등 조건이 동일하 게 유지하고 서로 다른 기질, 농도, 시간에서 동시 반복을 수 행하였다. 5번의 반복실험을 통해 얻어진 값으로 다양한 반 복 표준편차를 구하고 허용범위 결정은 질량백분율(mass fraction, C)을 RSDr = C^-0.15의 식에 따라 결정하였다. 이로부 터 계산된 값을 측정된 반복성의 RSDr값과 HORRATr 공식 에 의해 비교하여 0.5~2.0 사이에 존재할 경우 동일한 조건에 서의 반복실험에 문제가 없는지를 확인하였다 [14].

3. RESULTS AND DISCUSSION

달맞이꽃종자 추출물 기능성 원료를 이용하여 건강기능식 품으로 시판되고 있는 시료를 대상으로 AOAC 가이드라인 검증절차에 따라 검증된 분석법을 개발하였고 그 실험결과 는 다음과 같다 [14].

3.1. 적용성

현재 국내 유통·판매 중인 달맞이꽃종자 추출물의 식이보충제 에 대하여 서로 다른 속성 (원료특성 등)의 3개 제품 (I, II, III) 을 선정하여 분석법 검증을 수행했으며, 해당회사에서 제공한 각 시료의 PGG 성분량과 부원료의 정보는 Table 2과 같다.

3.2. 선택성

방해물질로부터 효과적인 분리가 이루어졌는지를 확인하기 위하여 표준용액과 시료에서 크로마토그램을 확인하였다.

Fig. 1의 A는 PGG 표준용액을 분석한 크로마토그램이며, B 는 시판되고 있는 식이보충제 I 표본시료를 분석한 크로마토 그램이다. 그 결과 표준용액의 주피크와 시료의 주피크가 동 일시간내 일치했으며, UV 스펙트럼 패턴도 정확히 일치함 을 확인할 수 있었다. 또한 분리능 (resolution, Rs)을 확인하 Table 1. HPLC condition for PGG analysis

Items Conditions

Solvent

A: Acetic acid: Water (0.3:99.7, v/v) B: Acetic acid: Water: MeCN (0.3:5:94.7, v/v/v)

Time(min) A(%) B(%)

0.0 83 17

15.0 75 25

20.0 50 50

25.0 50 50

25.1 83 17

30.0 83 17

Column Capcellpak C₁₈ UG120 (4.6 mm ID × 250 mm, 5µ^m)

Flow 1 mL/min

Injection volume 10μ^L Detector UV 280 nm Temperature 40^oC

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기 위하여 시료용액 중의 두 개의 피크의 머무름시간 t1과 t2

의 분리 시간적 거리와 두 개의 피크 폭 W1과 W2를 조사한 결과 1.4로 나타남으로서 AOAC 가이드라인에서 제시하는 최소 1.0 이상의 분리능을 가짐을 확인할 수 있었다.

3.3. 직선성

표준용액을 7개의 농도로 적절히 희석하여 0.42, 0.84, 1.68, 3.36, 6.72, 13.44, 26.88µg/mL에 대한 직선성을 검토했으며, 시험시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도 에 대해서 3회 반복 실험을 수행하였다. 그 결과 결정계수(r²) 는 0.9999로 AOAC 가이드라인에서 요구하는 결정계수 0.95 이상을 만족함을 확인하였다 (Fig. 2).

3.4. 함량측정과 반복정밀성 실험 3.4.1. 검체량 변화에 대한 반복정밀성

검체량의 변화에 대한 반복정밀성을 확인하기 위하여 표본 시료 I을 3개의 농도 (10 mg/g × 1배, 2배 및 3배)로 늘리고 각 각에 대해서 5회 반복 실험하였다. 그 결과, Table 3에서 보여 주고 있는 바와 같이, 표본시료에서 PGG 함량이 1배에서는 1.0%, 2배에서는 1.2%, 3배에서는 1.1%로 나타났으며, 평균 PGG 함량은 1.1%로 확인되었다. 또한, 각각의 증량에 대한 상대표준편차는 1.8%, 1.9%, 2.0%로 나타났으며, 평균 함량 값을 이용하여 AOAC 가이드라인 허용범위를 확인한 결과 0.5~2.0로 확인되었다 [14]. 따라서 시료 검체량의 변화에 따 른 반복정밀성은 시료량의 변화를 10 mg/g×1배, 2배 및 3배 Table 2. Description of the commercially available three extract

formulations of evening-primrose seeds as dietary supplement samples used in this study

Sample Formulation Dosage form Source I 1.0% PGG plus other

ingredients¹⁾ Capsule Korea II 1.2% PGG plus other

ingredients²⁾ Capsule Korea III 1.0% PGG plus other

ingredients³⁾ Capsule Korea

1)Total polyphenol, Flexed-seed oil, Microcrystalline, Fibroin BF-7, Lactic acid bacterial containing powder.

2)Total polyphenol, Resistant maltodextrin, Microcrystalline, cellulose, Kelp meal.

3)Total polyphenol, Brewer's yeast, Microcrystalline cellulose, Kelp meal, Dried yeast, Chicory extract.

Fig. 1. Typical HPLC chromatograms of PGG analysis (A: standard PGG, B: commercially available sample I used as a dietary supplement) with its UV spectrum. See Experimental Section for chromatographic conditions.

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까지 늘리더라도 동일한 조건에서의 반복실험에 문제되지 않음이 확인되었다.

3.4.2. 시료 기질변화에 대한 반복정밀성

시료 기질변화에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위하여 다른 특성을 가지고 있는 표본시료 3개(I, II, III)를 각각 5회 반복 실험하였다. 그 결과 Table 4에서 보여주고 있는 바와 같이, I 시료에서는 PGG 함량이 1.0%, II 시료에서는 1.3%, III 시료 에서는 1.1%로 나타났다. 이러한 결과 값을 이용하여 허용 범위를 확인한 결과, 시료 I과 III은 0.5~2.0%, 시료 II는

0.5~1.9%이였다 [14]. 산출된 허용범위를 이용하여 각 표본 시료의 상대표준편차가 허용범위에 포함되는지를 확인한 결과 시료 I은 1.8%, II는 1.7%, III은 2.0%로 나타남에 따라 서로 다른 기질을 가지고 있는 표본시료의 반복정밀성은 동 일한 조건에서 문제되지 않음이 확인되었다.

3.4.3. 분석시간별 반복정밀성

분석 시간의 변화에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위하여 균 질화시킨 시료 I을 4^oC 냉장실에 보관하면서 0h, 24h, 48h마 다 시험조작을 5회 반복 실험하였다. 그 결과 Table 5에서 보 는 바와 같이, PGG 함량이 0h~48h에서 모두 1.0%로 확인하 였다. 5회 반복 측정을 통해 확인한 함량 측정값을 이용하여 허용범위를 확인한 결과, 시간별 상대표준편차와 intra-day RSD%가 모두 허용범위를 만족함을 알 수 있었다 [14]. 따라 서 동일한 조건에서 분석시간을 달리하더라도 본 실험에서 제시하는 시험방법의 반복정밀성은 문제되지 않음이 확인 되었다.

3.5. 정확성

표준물질 첨가법에 따라 3개의 표본시료 (I, II, III)에 대하여 각각의 함량측정값의 전체가 1배, 2배 및 3배가 되도록 일정 량의 PGG 표준용액을 첨가하였고, 5회 반복실험을 통하여 평균 회수율을 측정하였다. 그 결과 Table 6에서 보여주고 있 는 바와 같이, I-III 표본시료에서의 회수율이 각각 96.5~

100.6%, 97.8~104.2%, 98.3~104.1%로 나타났다. 이러한 결 과는 AOAC 가이드라인에서 제시하고 허용범위에 모두 포 함되는 것으로서 동 시험법에 대하여 서로 다른 기질을 가진 시료에 대하여 정확성에 문제되지 않음이 확인되었다 [14].

3.6. 검출한계 및 정량한계

검출한계 및 정량한계를 구하기 위하여 표본시료 I을 분석한 크로마토그램에서 PGG 지표성분이 위치하는 곳의 노이즈 (nosie)값을 10회 측정값으로부터 표준편차를 구하고 3배를 더한 값을 검출한계, 10배를 더한 값을 정량한계로 하였다.

그 결과 검출한계는 0.04 µg/mL이며, 정량한계는 0.13 µg/

mL로 나타났다 (Fig. 3). 본 분석법의 검출한계와 정량한계 결과를 기존에 발표된 가자나무에 함유된 PGG 성분을 Fig. 2. Calibration curve of PGG analysis over the assayed

concentration ranges (0.42~26.88µg/mL) (n = 3).

Table 3. Repeatability precision data for different sample amounts of sample I (n = 5)

Treatment Amount of sample I¹⁾

1× 2× 3×

Mean(ug/g) 10,253.3 11,729.6 11,440.6

Mean(%) 1.0 1.2 1.1

S.D. 183.3 228.5 230.6

RSD(%) 1.8 1.9 2.0

Acceptable values(%)²⁾ - 0.5~2.0 -

1)The known amounts (1-3 times) of sample I were used, respectively.

2)Acceptable values proposed by AOAC guideline [14].

Table 4. Repeatability precision data for different sample matrices of PGGs (n = 5)

Treatment

Several PGG dietary supplement formulations

sample I sample II sample III Mean(ug/g) 10,253.3 13,278.0 11,186.8

Mean(%) 1.0 1.3 1.1

S.D. 183.3 232.1 223.9

RSD(%) 1.8 1.7 2.0

Acceptable values(%)¹⁾ 0.5~2.0 0.5~1.9 0.5~2.0

1) Acceptable precision values proposed by AOAC guideline [14].

Table 5. Repeatability precision data at changed analysis time (n = 5)

Treatment Different analysis times of sample I

0h 24h 48h

Daily Mean(ug/g) 10,253.3 10,134.2 10,337.9

Mean(%) 1.0 1.0 1.0

Inter-day S.D. 183.3 199.0 195.7

Inter-day RSD(%) 1.8 2.0 1.9

Intra-day RSD(%) - 1.0 -

Acceptable values(%)¹⁾ - 0.5~2.0 -

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HPLC로 분석한 Mahajan 그룹의 실험결과나 (검출한계: 0.5 µg/mL, 정량한계: 1.665 µg/mL)[12], 약동력학적인 동물실험 을 위해 Lü 그룹에서 보고한 실험결과와 (검출한계: 0.2 µg/

mL, 정량한계: 0.4 µg/mL) 비교해 볼 때 매우 우수한 결과임 을 보여주고 있다 [13].

앞에서도 언급했던 바와 같이, 혈당상승 억제에 도움이 될 수 있는 달맞이꽃종자 추출물 유래 식이보충제가 국내외로 시판되고 있고 주요 지표성분으로 PGG가 지정되어 있지만,

이와 관련된 검증된 분석법이 아직까지 보고된 바가 없다.

본 연구결과가 국내 달맞이꽃종자 추출물의 기준과 이를 이 용한 식이보충제로 시판되고 있는 품질관리 등의 분석 모니 터링을 수행하는데 기초적 자료로 유용하리라 기대한다. 식 이보충제로 사용되는 이러한 기능성 원료를 제조하는 경우 에 건강기능성 식품의 개별기준 및 규격에 적합해야 하기 때 문이다.

Table 6. Accuracy data at three fortified concentrations of sample I-III (n = 5)

Treatment¹⁾

Fortified Concentration sample I (µ^g/mL)

Fortified Concentration sample II (µ^g/mL)

Fortified Concentration sample III (µ^g/mL)

2.0 4.0 6.0 2.0 4.0 6.0 2.0 4.0 6.0

mean(%) 96.7 99.6 100.6 96.5 97.8 98.3 100.6 104.2 104.1

S.D. 2.6 3.0 3.3 3.0 4.3 2.9 2.8 1.6 2.1

RSD(%) 2.7 3.0 3.2 3.1 4.4 2.9 2.8 1.5 2.0

Acceptable values(%)²⁾ 92.5~104.6 92.6~104.4 92.5~104.5

1)The known concentrations of standard PGG were added to the corresponding I-III samples for three fortified concentrations, respectively.

Fig. 3. HPLC analysis chromatograms of PGG in commercially available sample I used as a dietary supplement for LOD (0.04 µg/

mL)(A) and LOQ (0.13µg/mL)(B) under UV 280 nm detection.

(7)

4. CONCLUSION

인구 고령화와 함께 당뇨병과 같은 만성질환 보유자가 크게 증가되고 있는 현대사회에서, 혈당상승 억제에 도움이 될 수 있는 달맞이꽃종자 추출물 유래의 건강기능 식품들이 주목 받고 있다. 현재 달맞이꽃종자 추출물을 이용한 물질이 기능 성 원료로 하여 식이보충제로서 사용되고 있는 바, 이들의 주요 지표성분에 대한 품질관리를 위한 분석방법이 요청되 고 있는 상황이다. 본 연구에서 PGG를 달맞이꽃종자 추출물 의 지표물질로 하는 최적의 분석법 개발을 하였고, AOAC 가이드라인에서 제안하는 성능특성으로 HPLC를 이용한 PGG분석의 본 분석법을 검증하였다. 그 검증된 분석법 결과 로, 선택성에서 분리능은 1.4로 가이드라인에서 요구하는 1.0 이상을 만족했으며, 직선성은 7개의 농도범위 0.42~26.88 µg/

mL에서 0.9999으로 확인되었다. 그리고 정확성을 확인하기 위하여 시판되고 있는 대표적인 시료 I-III 에서 산출된 함량 측정값을 이용하여 허용범위를 설정한 후 따로 표준물질 첨 가법에 따라 농도별 회수율을 확인한 결과, I-III 시료에서 각 각 96.7~100.6%, 96.5~98.3%, 100.6~104.1%를 보여줌으로 가이드라인의 허용범위를 모두 만족함을 보여주었다. 또한 반복정밀성을 확인하기 위하여 시판되고 있는 시료 I을 각각 10.0 mg/g × 1배, 2배, 3배로 증량하여 5회 반복측정한 결과, 모두 AOAC 가이드라인 허용범위를 만족하는 것을 확인하 였다. 그리고 기질에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위해 3개 의 표본시료를 대상으로 PGG을 5회 반복측정한 결과 상대 표준편차가 각각 1.8%, 1.7%, 2.0%로 확인되었고 허용범위 인 0.5~2.0%을 모두 만족하였다. 분석시간별 반복정밀성 시 험에서는 시료 I을 대상으로 0h, 24h, 48h 반복측정한 결과, 시간별 상대표준편차와 intra-day 상대표준편차가 모두 허용 범위인 0.5~2.0%로 만족함을 알 수 있었으며, 검출한계와 정 량한계는 각각 0.04 µg/mL와 0.13 µg/mL으로 확인되었다.

본 연구에서 개발되어 검증되어 응용된 분석법은 식이보충 제 달맞이꽃종자 추출물의 기준 및 품질관리에 유용하게 활 용되리라 기대한다.

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