8 책임저자：박종권, 경남 마산시 합성2동 50번지
630-723, 마산삼성병원 외과 Tel: 055-290-6586, Fax: 055-290-6586 E-mail: [email protected]
접수일：2007년 3월 5일, 게재승인일：2007년 5월 8일
생쥐의 췌장도세포추출을 위한 콜라겐분해효소 용액 주입 시 쓸개와 총담관 경로의 비교
성균관대학교 의과대학 마산삼성병원 외과학교실 박 종 권
Comparison of Intra-gall Bladder and Intra-com- mon Bile Duct Injection of Collagenase Solution for Mouse Pancreatic Islet Isolation
Jong Kwon Park, M.D.
Purpose: A high yield of viable pancreatic islets is an essen- tial prerequisite for the study of pancreatic islet transplan- tation. The purpose of this study is to compare the yield between intra-gall bladder (intra-GB) and intra-common bile duct (intra-CBD) injection of collagenase solution for isolation of mouse pancreatic islets.
Methods: The mice were divided into two groups, the in- tra-GB and intra-CBD groups, and each group included twelve mice, respectively. Collagenase solution was injected via the gallbladder in the intra-GB group mice, while this was done via the common bile duct in the intra-CBD group. After removal and digestion of the mouse pancreases, the pancre- atic islets were isolated by Ficoll density gradient cen- trifugation and hand picking.
Results: The intra-GB group yielded 121.67±39.86 IEQs, and the intra-CBD group reveled 168.17±29.23 IEQs. There was a statistically significant difference in islet yield between the two groups (P=0.005, Mann-Whitney Test). The purities of the isolated islets were 86.42±3.99% for the intra-GB group and 87.17±4.47% for the intra-CBD group, and there was no difference between the two groups (P=0.755, Mann- Whitney Test).
Conclusion: Both the intra-GB and intra-CBD groups yielded an average of ＞120 IEQs. However, the intra-CBD group revealed a higher yield than the intra-GB group for isolating mouse pancreatic islets. (J Korean Surg Soc 2007;73:8-12) Key Words: Pancreatic islet, Gall bladder, Common bile
duct
중심 단어: 췌장도세포, 쓸개, 총담관
Department of Surgery, Masan Samsung Hospital, Sung- kyunkwan University School of Medicine, Masan, Korea
서 론
인슐린 의존성 당뇨병의 치료를 위하여 활발한 연구가 시행되어 오고 있는 췌장도세포이식 실험을 위해서는 충분 한 숫자의 췌장도세포를 추출하는 것이 연구의 기본이 된 다. 최근 자동화된 기계의 도움을 받아 췌장도세포를 추출 하는 방법이 많이 사용되고 있으나(1,2) 췌장도세포이식 실 험을 위해서는 실험실에서 연구자가 직접 실험동물로부터 췌장도세포를 추출할 수 있는 능력을 갖추는 것이 중요하 다. 췌장도세포의 추출 실험은 실험동물 한 마리당 얼마나 효율적으로 많은 양의 췌장도세포를 추출할 수 있는가가 실험 성공의 척도가 된다. 생쥐는 동물실험에서 많이 이용 되는 실험동물로서 췌장도세포이식에서도 유용하게 사용된 다. 현재까지 콜라겐분해효소 용액을 사용한 생쥐의 췌장도 세포추출에 관한 여러 결과들이 보고되었는데,(3-5) 저자의 실험에서도 콜라겐분해효소를 이용하여 췌장을 소화시키 고, Ficoll 밀도구배원심분리(density gradient centrifugation)와 피펫을 이용하여 손으로 직접 채취하는 방법(hand picking method)을 통해 췌장도세포를 추출하였다. 또한 콜라겐분해 효소를 각기 다른 경로인 쓸개와 총담관으로 주입하였을 때 췌장도세포추출의 효율성을 비교하였으며, 더불어 췌장도 세포의 추출에 관한 구체적인 실험방법도 보고하는 바이다.
방 법 1) 실험동물
췌장도세포의 추출 대상은 C57 BL/6J종의 생후 8주에서 10주 사이의 수컷 생쥐(Jackson laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)였고, 체중은 평균 25 gm이었다. 실험군들은 쓸개나 총담관을 통하여 콜라겐분해효소 용액을 주입하는 두 군으 로 각기 나누어 시행하였고, 실험 도중 쓸개나 총담관이 파
Fig. 1. After suture ligation of distal common bile duct, 5 ml of collagenase solution was injected through gall bladder.
Fig. 2. After suture ligation of distal common bile duct, 5 ml of collagenase solution was injected through proximal com- mon bile duct.
Fig. 3. Mouse pancreatic islets were isolated (×400, light micro- scope).
열되어 콜라겐분해효소 용액이 유출된 예는 실패한 예로 간주하여 실험 대상에서 제외하였다. 두 군은 각각 12예들 로 구성되었다. 동물실험은 University of California Davis의 실험동물 이용과 사육에 관한 위원회의 규정과 승인하에 시행하였다.
2) 췌장도세포의 채취 (1) 용액의 준비:
콜라겐분해효소 용액: 1.5 mg/ml collagenase (collagenase V, Sigma. INC., St Louis, MO, USA) in HBSS (Sigma INC., St. Louis, MO, USA)
A 용액: 500 ml HBSS (containing Ca, Mg)+5 ml of 1 M HEPES+2.5 ml of 1 M Glucose
B 용액: 500 ml HBSS (containing Ca, Mg)+5 ml of 1 M HEPES+2.5 ml of 1 M Glucose+15 ml of 5% Fetal Calf Serum Ficoll (Sigma INC., St. Louis, MO, USA) 용액: 7 ml of 27%, 5 ml of 23%, 5 ml of 20%, 5 ml of 11% in HBSS (containing Ca, Mg)
(2) 실험동물을 경추압박을 통해 희생시킨 후 충분한 양 의 알코올로 복부를 소독한다. 개복 후 해부현미경을 사용 하여 총담관의 말단부가 십이지장으로 들어가는 곳을 찾아 십이지장 부위에 봉합결찰을 시행한다. 콜라겐분해효소 용 액 5 ml를 30 게이지 바늘을 사용하여 각각 쓸개와 총담관 을 통하여 압력을 가하여 주입하고 팽창된 췌장을 적출한 다(Fig. 1, 2).
(3) 적출한 췌장은 5 ml의 콜라겐분해효소 용액을 넣은 Falcon 튜브에 담은 후 얼음물에 담근다.
(4) 튜브 속에서 췌장을 가위로 잘게 썬다.
(5) 잘게 썬 췌장이 담겨 있는 튜브를 37oC 수조에 20∼
25분간 넣어두고 5분 간격으로 흔들어 준다.
(6) 췌장이 용해된 것을 확인한 후 30 ml의 차가운 A 용액 을 튜브에 넣는다.
(7) 튜브를 1,500 rpm에서 10분간 원심분리하고 상청액을 완전히 제거하여 튜브 바닥에 침전물이 형성되어 있는 것 을 확인한다.
(8) 튜브에 27% Ficoll 용액 7 ml를 넣어 침전물과 균질 하게 섞은 후 그 위에 각각 5 ml씩의 23%, 20%, 11%의 Ficoll 용액을 조심스럽게 순서대로 넣어 밀도구배(density gradient)가 생기게 한다.
(9) 3,500 rpm으로 15분간 원심분리를 시행한다.
(10) 11%와 20% Ficoll 용액 사이의 층과 23%와 27% 사이 의 층에 위치한 췌장도세포들을 피펫을 사용하여 수거하고 50 ml 튜브에 옮겨 넣은 후 10 ml의 B 용액을 추가로 넣고 1,500 rpm으로 10분간 원심분리하여 세척한다.
Table 1. Islet equivalent number and purity of intra-gall bladder and intra-common bile duct injection of collagenase solution groups
IEQ* GB† 117, 108, 108, 94, 80, 97, 113, 87, 102, 200, 172, 182
Mean±SD 121.67±39.86
CBD‡ 205, 203, 153, 135, 117, 135, 177, 170, 173, 177, 165, 208
Mean±SD 168.17±29.23
Purity GB (%) 82, 85, 82, 91, 88, 92, 85, 80, 92, 88, 85, 87
Mean±SD (%) 86.42±3.99
CBD (%) 85, 88, 85, 92, 92, 82, 90, 84, 95, 85, 88, 80
Mean±SD (%) 87.17±4.47
*IEQ = islet equivalent number; †GB = intra-gall bladder injection group; ‡CBD = intra-common bile duct injection group.
(11) 상청액을 제거하고 10 ml의 B 용액을 넣어 침전물을 다시 용해시킨다.
(12) 검정색 에나멜페인트를 바깥쪽 바닥에 칠하고 멸균 소독을 하여 미리 준비해 놓은 페트리 접시에 용해시킨 침 전물 용액을 넣고 해부현미경을 통하여 관찰하며 200 micro liter의 피펫을 사용하여 손으로 직접 췌장도세포들을 채취 한다.
(13) 췌장도세포들은 난원형의 분홍색 쌀 모양 입자 형태 를 나타낸다는 점을 숙지하여 채취한다(Fig. 3).
3) 췌장도세포의 순도
췌장도세포를 추출한 후 표본을 채취하여 dithizone을 사 용한 염색에서 양성을 나타낸 입자의 상대적 비율로 순도 를 확인한다.
4) Islet equivalent number (IEQ)
채취한 췌장도세포로 1989년 International Workshop on Islet Assessment에서 확립된 기준을 사용하여 islet equiv- alent number (IEQ)를 계산하여 구한다.(6)
결 과 1) Islet equivalent number (IEQ)
12마리의 쓸개를 통한 주입군에서의 IEQ는 121.67±39.86 이었고, 12마리의 총담관을 통한 주입군에서의 IEQ는168.17±
29.23이었다. 두 군의 IEQ 개수는 통계적으로 유의한 차이 를 보였다(P=0.005, Mann-Whitney Test) (Table 1).
2) 추출한 췌장도세포의 순도
본 실험에서의 췌장도세포의 순도는 쓸개주입군의 경우 86.42±3.99%, 총담관주입군의 경우 87.17±4.47%였으며, 두 군 사이에 유의한 차이는 없었다(P=0.755, Mann-Whitney Test) (Table 1).
고 찰
췌장도세포이식 실험을 위해서는 가능한 한 많은 양의 정상적인 췌장도세포를 효과적으로 추출할 수 있어야 한 다.(7,8) 최근 췌장도세포의 추출에는 자동기계장치의 도움 을 이용한 추출법이 많이 사용되고 있다.(1,2) 그러나 자동 기계장치가 항상 모든 실험에 이용 가능하지는 않기 때문 에, 원활한 췌장도세포이식 실험을 위해서는 실험자 자신 이 실험실에서 직접 췌장도세포를 추출할 수 있는 프로토 콜과 수기를 갖추고 있는 것이 필요하다. 췌장도세포이식 실험에 많이 사용되는 동물로는 생쥐,(3-5) 쥐,(9,10) 개,(11) 돼지,(12-14) 영장류(15-17) 등이 있으며 사람의 췌장도세포 (18,19)를 사용하여서도 실험이 이루어지고 있다. 이 중 생 쥐는 몸체가 작아 조작이 용이하고, 다수의 실험동물을 구 할 수 있으며, 다른 동물들에 비해 비교적 가격이 저렴하여 췌장도세포이식 실험에도 많이 사용된다. 반면, 단점으로는 몸체가 작은 점에 비례하여 췌장과 총담관의 크기도 작아 췌장도세포의 추출을 위한 수기가 타 실험동물들에 비해 용이하지 않다는 점이다. 일반적으로 췌장도세포이식을 위 한 동물실험에는 한 마리당 얼마나 많은 수의 정상적인 췌 장도세포를 추출할 수 있는가가 실험 성공의 관건이 된다 고 하겠다. 보고들에 의하면 췌장으로 콜라겐분해효소 용 액을 주입하는 경로의 차이, 즉 쓸개, 총담관, 췌장실질, 혹 은 문맥 등의 주입하는 통로가 다른 것에 의해 추출할 수 있는 췌장도세포의 양에 차이가 날 수 있다고 하였다.
(7,20) 이 중 총담관을 통한 콜라겐분해효소 용액의 주입 방 법이 가장 효율적이라고 생각되고 있으나, 생쥐의 경우 체 구가 작은 것에 비례하여 총담관의 크기가 매우 작아 실험 자의 수기의 숙달도에 따라 실험의 가능 여부가 결정되는 경우가 많다. 따라서 상대적으로 크기가 커서 주사바늘의 삽관이 용이한, 쓸개를 통한 콜라겐분해효소 용액의 주입 도 생쥐의 췌장도세포 추출에 있어 하나의 방법으로 사용 될 수 있다. 생쥐를 이용한 췌장도세포의 추출에 관한 보고 들에 따르면, 생쥐 한 마리의 췌장으로부터 38.5±3.5 IEQ로
부터 751.6±278.0 IEQ 등의 다양한 추출 결과들이 보고되고 있다.(7,8) 상기 보고에서 38.5±3.5 IEQ의 결과는 생쥐의 췌 장에 어떠한 콜라겐분해효소 용액도 주입하지 않고 그대로 추출한 결과이므로 낮은 추출 양이 예상되는 결과이다. 하 지만 751.6±278.0 IEQ는 생쥐의 총담관에 Liberase RI을 주 입한 후의 결과로서 특이하게 많은 추출 양을 보이고 있다.
이는 저자의 결과인 168.17±29.23 IEQ는 물론, 다른 보고들 에서 주로 나타나는 200 IEQ 내외의 추출 결과(8,20)들에 비해 매우 많은 수치이다. 이러한 결과에 대해 자세한 설명 은 없었으나, 이 실험에서는 Liberase RI이 콜라겐분해효소 로 사용된 점을 보아, 사용된 콜라겐분해효소의 차이에 의 한 효과가 아닐지 추정된다. 저자의 실험에서는 생쥐 한 마 리당 쓸개를 통한 주입의 경우 121.67±39.86 IEQ, 총담관의 경우 168.17±29.23 IEQ를 추출할 수 있어 총담관을 통한 주 입의 경우가 통계적으로 유의한 더 많은 수의 췌장도세포 추출을 나타내었다. 쓸개를 통한 주입군의 췌장도세포의 추출 양이 적은 이유는 아마도 콜라겐분해효소 용액이 췌 장관을 따라 모두 췌장으로 주입되지 않고, 상당 부분이 서 로 연결되어 있는 총담관을 통해 간으로 빠져나가게 되므 로, 같은 양을 주입하여도 총담관을 통한 주입에 비해 상대 적으로 적은 양의 콜라겐분해효소 용액만이 췌장으로 주입 되게 되는 현상에 의할 것으로 생각된다. 그러나 비록 총담 관을 통한 주입의 경우보다 췌장도세포의 추출 양이 적었 으나, 쓸개를 통한 주입도 평균 120 IEQ 이상의 췌장도세포 추출 결과를 나타내어, 실험 수기상 총담관을 통한 콜라겐 분해효소 용액의 주입이 어려울 때는 쓸개를 통한 주입도 췌장도세포 추출 실험을 위한 하나의 대체 방법이 될 수 있다고 생각된다. 췌장도세포이식은 인슐린 의존성 당뇨병 의 근본적인 치료법들 중의 하나이며, 효율적이고 안정적 인 췌장도세포의 추출은 췌장도세포이식 실험을 가능케 하 는 기본 전제이며 바탕이 된다고 할 수 있다. 향후 췌장도세 포이식의 발전을 위해서는 췌장도세포의 추출을 위한 자동 장치의 발전과 더불어, 연구자가 실험실에서 직접 자신의 수기를 통하여 추출하는 방법이 함께 발전해야 될 것으로 생각된다. 이를 통해 췌장도세포를 이용한 실험의 활성화 뿐만 아니라 이식의 가장 큰 문제점인 공여자 부족현상도 상당 부분 극복하게 될 수 있으리라 생각된다.
결 론
본 실험의 결과, 총담관을 통한 콜라겐분해효소 용액의 주입은 쓸개를 통한 방법에 비해 더 많은 수의 췌장도세포 를 추출할 수 있는 효율적인 방법으로 생각되며, 저자는 콜 라겐분해효소를 이용한 췌장의 소화와 밀도구배원심분리 로 췌장도세포를 추출하는 방법에 관한 구체적인 실험방법 을 보고하는 바이다.
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