The Transfection of Cytosine Deaminase Gene and the Cell Killing Effects of Administration of 5-Fluorocytosine in Colon Cancer Cell Lines

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책임저자：장석균, 서울시 영등포구 여의도동 62 ꂕ 150-713, 여의도성모병원 외과 Tel: 02-3779-1175, Fax: 02-786-0802 E-mail: [email protected]

접수일：2003년 10월 8일, 게재승인일：2003년 12월 22일 본 논문의 주요 내용은 2003년 춘계외과학술대회에서 포스터발표 및 구연되었음.

were compared with those in group 1 and 2, and the bystander effects and cell recoveries, after finishing the 5-FC treatment, evaluated until day 20 of the culture.

Results: The calculated survival percentages by from the

MTT tests in the WiDr and LoVo cells revealed 110∼150%

enhancing effects after the administration of 5-FC concentration of 10, 100 and 1000μM (group 1), and 30∼90% after the administration of 5-FU at the same concentrations (group 2), which were shown to be statistically significantly (P＜

0.001). After transfection of pCMV/CD-1 plasmid vector into the WiDr and LoVo cells using the lipofectin method, the transfection rate of the WiDr and LoVo cells were 4.2±0.6%

and 13.8±0.8%, respectively. Also the CD protein, with the polyclonal anti-CD antibody, by western blot, revealed weak expression on day 2, followed by strong expression on day 4, which progressively decreased by days 6 and 8 in the WiDr cells. Conversely, the LoVo cells showed weak expression on day 2, which progressively increased by days 4 and 6, was followed by the strongest expression on day 8 in LoVo cells. About 60∼85% significant growth inhibition effects (P＜0.001) were revealed in group 3, with proportionally different effects, corresponding to the CD gene transfection rate, concentration of 5-FC and duration of the culture. The 60∼85% growth inhibition effects were complex of the response to the transfection rate and the bystander effects of CD expressed cells to the CD non-expressed cells.

Conclusion: From our results, the administration of 5-FC

after CD gene transfection revealed statistically significant growth inhibition effects of 60∼85%, which were complex of the effects of CD expressed cells and the bystander effects to the CD non-expressed cells, and proportionally corresponding to the transfection rate, the duration of the CD protein expression and the concentration of 5-FC. (J

Korean Surg Soc 2004;66:271-280)

Key Words: Cytosine deaminase, Plasmid vector, 5-FC,

5-FU, MTT, Bystander effect

중심 단어: Cytosine deaminase, 플라즈미드 매개체, 5-FC, 5-FU, MTT, 방관자 효과

ꠏDepartment of Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea

The Transfection of Cytosine Deaminase Gene and the Cell Killing Effects of Administration of 5-Fluorocytosine in Colon Cancer Cell Lines

Sun Wook Cha, M.D. and Suk Kyun Chang, M.D.

Purpose: Among cancer gene therapies, the aims to elimi-

nate malignant cells using genes as drugs as substitutes for conventional therapy, the use of bacterial cytosine deaminase (CD) which can convert the nontoxic 5-fluorocytosine (5-FC) to toxic 5-fluorouracil (5-FU), has been reported to provide a useful system for the selective killing of gene- modified mammalian tumor cells. Recently the transfection and expression of the CD gene, and the toxicity of 5-FC in eukaryotic cells, have been reported in colon, prostate and breast cancers, as well as in glioblastomas. To evaluate the growth inhibition effects in WiDr and LoVo colorectal cancer cells, after CD gene transfection and 5-FC administration, for the selective killing of cancer cells.

Methods: WiDr and LoVo colon cancer cell lines were

cultured and the absorbencies for the percentage survival, on days 2, 4, 6, 8, and 10 of the culture, estimated by the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetra-zolium bromide (MTT) test. The experimental subjects were divided as fol- lows; Group 1: administration of 5-FC only, Group 2: administration of 5-FU only, Group 3: administration of 5-FC after CD gene transfection using pCMV/CD-1 plasmid vector.

Each experiment, on days 2, 4, 6, 8 and 10 of the culture after the administration of 5-FC or 5-FU concentration of 10, 100 and 1000 uM, was triplicated and calculated the mean with standard deviation. The bacterial CD gene was transfected into each cell lines, using the lipofectin method, and the transfection and expression of the CD protein identified with β-galactosidase immunohistochemical staining and western blotting. The growth inhibition effects in group 3

결장암 세포주에서 Cytosine Deaminase 유전자 이입 및 5-FC (5-fluorocytosine) 투여에 의한 세포사 효과

가톨릭대학교 의과대학 외과학교실 차 선 욱․장 석 균

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ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

서 론

결장-직장암은 식생활의 변화로 인하여 현재 우리나라에 서도 그 유병률과 사망률이 증가하고 있다. 결장-직장암의 치료방법으로 수술, 방사선조사, 전신적 또는 간동맥화학요 법 및 그 외 국소요법을 병행하고 있으나 전 환자의 20%에 서 처음 진단 시 원발부위 이외의 곳에 전이가 발견되고, 나머지 80%의 환자 중 30∼40%에서 5년 이내에 원격전이 가 발생한다. 재발 또는 전이 중 가장 흔한 간전이는 수술적 절제가 가장 좋은 방법이나 수술적응이 되는 경우가 드물 고, 그 외에 화학요법제 투여, 알코올주입법, 냉동요법, 고 주파열치료법, 간동맥화학요법 등을 시행하고 있지만, 결과 가 좋지 않고 특히 화학요법의 경우 약제의 독성에 따른 심각한 부작용을 야기할 수 있다.(6,11,28) 이에 여러 가지 치료 방법 중의 하나로 새로이 시도되는 유전자 치료의 한 방법으로 사용되는 cytosine deaminase (CD)는 포유동물에 는 존재하지 않고, 세균 및 곰팡이에만 존재하는 효소로서 무독성 전구약물인 5-fluorocytosine (5-FC)을 강력한 세포독 성과 방사선 감수성을 갖는 5-fluorouracil로 전환시키는 작 용을 한다. 최근 이러한 CD유전자를 이입시켜 결장암, 다형 신경교모종, 전립선암, 유방암 등에서 CD유전자의 발현과 세포독성 효과가 보고되었다.(3,13,15,19,20,24)

이에 저자는 전이성 결장-직장암의 치료 시 항암제의 전 신적 독성을 줄이고 암세포에만 선택적으로 작용하는 방법 으로 CD유전자의 세포내 이입 및 5-FC 투여 시 세포사 효 과 여부를 알아보기 위하여, 사람의 결장암 세포주인 LoVo 와 WiDr세포에 CD를 포함한 plasmid vector를 이용하여 CD 유전자를 이입하고, 세포사 효과를 비교 분석하고자 본 실 험을 시도하였다.

방 법 1) 세포주 및 세포배양

본 연구에 사용한 세포주는 w-p53 유전자 양성으로 알려 진 LoVo와 WiDr을 Thomas Jefferson University 암센터와 ATCC에서 분주 받아 배양 사용하였다. WiDr 세포는 10%

fetal bovine serum (FBS)과 penicillin, streptomycin이 첨가된 Leibovitz-15 배양액에, LoVo 세포주는 RPMI1640 배양액에 10% FBS와 100μg/ml의 penicillin과 streptomycin을 첨가하 여 37^oC, CO2보온기에서 배양하였다.

2) pCMV/CD-1 plasmid vector

CD유전자 이입을 위한 vector로는 pCMV/CD-1 (Invivo- gen, San Diego, CA., USA)를 사용하였다. 이 vector에는 hygromycin-resistant gene, LacZ 및 CD gene이 모두 포함되 어 있다.

3) CD유전자의 이입 및 확인

대장암 세포 내로 CD유전자를 이입하기 위하여 liposome 을 이용하는 방법으로 lipofectinTM (Gibco Co. Ltd)을 사용 하였다.(2,30) Lipofectin은 cationic lipid의 일종인 DOTMA와 DOPE가 1：1 (w/w)로 혼합되어 있는 liposome의 일종으로 DNA와 complex를 이룰 수 있다. 6μl의 lipofectin을 opti- MEM으로 125μl되게 희석하여 30분간 상온에 두고, 이입 시킬 CD유전자 6μl을 opti-MEM으로 125μl되게 희석시킨 후 두 가지 용액을 혼합하여 15분간 상온에 보온하였다가 배양세포에 투여하고 5시간 배양한 후 완전배지로 바꾸어 1일간 배양하였다.

CD유전자의 이입 확인은 β-galactosidase 면역조직화학 염색법을 이용하였다. 즉 배양된 암세포를 수거하여 슬라 이드에 도말한 후 0.5% glutaraldehyde로 30분간 고정시킨 후 0.001 M 인산완충용액(pH 7.2)으로 세척하였다. X-Gal 염색용액(Promega, Madison, WI, USA)은 0.05% sodium deoxycholate+0.1% NP-40+10 mM MgCl2 (Sigma, St.

Louise, USA)가 들어 있는 5×buffer 2 ml와 100 × X-Gal (Promega, Madison, WI, USA) 0.1 ml+100×K4Fe(CN)6

(Sigma) 0.1 ml+100×K3Fe(CN)6 (Sigma) 그리고 DPBS 7.7 ml를 잘 혼합하여 제조하였다. X-Gal용액에 슬라이드를 넣 어 30^oC 보온기에서 6시간 동안 보온하였다. 10% 포르말린 에 하루 이상 고정시킨 후 세척하고 70∼100% 알코올에 탈 수시켰다. 다시 xylene 용액에 2분씩 3회 담그고 다시 100∼

70% 알코올에 재수화시켰다. Hematoxylin과 Eosin 염색하 여 100배와 200배 광학현미경으로 관찰하였다.(30) 4) CD유전자의 단백질 발현

세포내 이입된 CD유전자의 단백질 발현을 확인하기 위 하여 세포 배양 2, 4, 6, 8, 10, 12일에 세포를 수거하여 0.001 M 인산완충용액(pH 7.2)으로 2회 세척한 후 lysis buffer (0.01 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 0.001 M EDTA, PMSF 0.1 μg/ml, Aportinin 1μg/ml)를 첨가하여 분쇄한 후 4^oC 12,000 rpm에서 15분간(2회) 원심분리하여 상층액(단백질 추출물) 을 -70^oC에 보관하였다. 10% SDS polyaryil amide gel (0.75 mm)을 준비하여 단백질 추출물 2μg/20 ml을 첨가한 후 120 V에서 2시간 동안 전기영동한 후 PVDF membrane (Santa- cruz, USA)에 1×transfer buffer (25 mM Tris, 192 M Glycine, 20% methanol, 0.1% SDS)를 이용하여 0.2 A에서 1시간 30분 동안 이전(transfer)시키고 막을 TBS-T (0.1% tween20) 20∼

30 ml와 3% 탈지우유(skim milk)로 4시간 이상 차단하였다.

TBS-T로 2회 세척하고 1차 항체로 polyclonal anti-CD antibody (Biogenesis Ltd., USA)를 1：1,000으로 희석하여 처치 한 후 overnight시키고 TBS-T로 2회 세척한 후 다시 1：

5,000으로 희석시킨 2차 항체인 horse radish peroxidase- conjugated anti-rabbit IgG (Millipore, USA)를 반응시킨 다음

(3)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Ammersham ECL kit를 사용하여 필름에 약 5분간 노출시켜

현상하였다.

5) 세포사 효과(생존율) 및 실험군

결장암 세포의 세포사 효과는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphen- yltetrazolium bromide (MTT) 검사를 시행하여 다 음과 같이 계산하여 세포 생존율에 대한 백분율로 표시하 였다.(24) 즉 WiDr과 LoVo세포의 정상배양 제 2, 4, 6, 8, 10 일에 MTT 검사를 하여 각 정상배양 해당일의 흡광도를 분 모로 하고, 실험군(5-FC, 5-FU 및 CD유전자 이입 후 5-FC 첨가배양군)의 각 해당일의 흡광도를 분자로 하여 나눈 후 100을 곱하여 %로 표시하였다.

MTT 검사는 배양 제 2, 4, 6, 8, 10일에 각각 10μl의 MTT reagent (R & D Systems, Inc., Minneapolis, USA)를 넣고 37^oC 에서 2∼4시간 동안 침전물이 보일 때까지 보온시켰다. 보 라색의 침전물이 보이면 100μl의 청정제용액을 첨가하고 18∼24^oC 어두운 곳에서 2시간 이상 보온한 후 각 well은 Bio-Kinetics Reader (Bio-Tak Instrument, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Bo는 매 실험마다 배양액만을 넣은 것을 측정하였다. WiDr 및 LoVo세포를 정상 배양하여 배양 제 2, 4, 6, 8, 10일에 흡광도를 측정하고 이를 바탕으로 각 실험군에서 각 해당일의 흡광도를 정상배양세포의 흡광도 에 대한 백분율로 표시하여 세포 생존율을 계산하였으며 각 실험은 3번씩 시행하여 평균과 오차를 계산하였다.

실험군의 각 해당일의 Absorbance - Bo

세포생존율(%) = ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ × 100 정상배양 각 해당일의

Absorbance - Bo

(Bo=배양액만 있고 세포는 없는 well의 Absorbance) 실험군은 다음과 같이 3군으로 나누었다.

제 1 군: 세포배양 시 5-FC 10μM, 100μM, 1,000μM 투여 후 배양 제 2, 4, 6, 8, 10일의 세포 생존율을 측정한 군 제 2 군: 세포배양 시 5-FU 10μM, 100μM, 1,000μM 투여 후 배양 제 2, 4, 6, 8, 10일의 생존율을 측정한 군 제 3 군: CD유전자를 이입시킨 후 5-FC 10μM, 100μM, 1,000μM 투여 후 제 2, 4, 6, 8, 10일의 생존율과 이후 정상 배양액으로 교환하여 배양 제 12, 14, 16, 18, 20일에 생존율 을 측정한 군

제 3군에서는 세포 회복에 대한 실험을 동시에 시행하였 다.

6) 통계

각 시점에서 각 군의 생존율을 비교하기 위하여 Turkey- Kramer multiple comparison test를 사용하여 P값이 0.05 미만 인 경우 통계적으로 유의한 차이로 보았다.

결 과 1) WiDr 및 LoVo세포의 배양

WiDr세포의 정상세포증식 정도를 보면 2∼3일에 2배 정 도 증식하는 것으로 판단되어 2일마다 배양액을 교환하였 고, LoVo세포는 4∼5일에 2배로 증식하는 것으로 판단되어 4일마다 배양액을 교환하였다.

MTT 검사를 위하여 96 well 배양판에 사용 적합한 세포 수를 결정하기 위하여 예비실험을 시행한바 1×10³개부터 1×10⁴개 사이의 세포를 단계별로 주입하고 MTT 검사를 시행하여 흡광도 판독이 제일 잘 되는 세포 개수를 시험한 결과, MTT 검사는 WiDr 및 LoVo세포 모두 3∼4×10³개에 서 흡광도 측정이 오차가 적게 측정되어 선택 사용하였다.

2) 5-FC의 효과

5-FC 투여가 세포배양에 미치는 효과를 보면 WiDr세포 에서는 5-FC 농도 0.1μM에서부터 100μM까지 정상배양액 투여보다는 높은 100∼110%의 세포 생존율을, 1,000μM에 서는 110∼120%의 생존율을 나타냈으나 통계적 의의는 없 었다. 한편 LoVo세포에서도 10μM, 100μM에서 배양 제 4 일에, 1,000μM에서 배양 제 2일에 110∼150%의 생존율을 나타냈으나 통계적 의의는 없었으며 전반적으로 정상 배양 액보다 높은 생존율을 나타냈다(Table 1).

3) 5-FU의 세포사 효과

5-FU 투여에 의한 세포사 효과를 보면 WiDr세포에서는 0.1μM 농도에서는 제 6일(89.5±2.1%)까지 감소하다가 제 8, 10일에는 증가하는 생존율(93.2±2.7%, 88.2±1.2%)을 보 여 미약한 세포사 효과를 나타냈으며 1μM, 10μM, 100μM 에서는 제 4일부터 그 생존율(71.4±1.4%, 61.6±0.8%, 43.0

±0.8%)이 감소하기 시작하여 제 10일에는 의의 있게 감소 하여(30.8±0.6%, 23.7±0.6%, 8.7±0.4%) 의의 있는 세포사 효과를 나타냈다(P＜0.001). 1,000μM에서는 제 2일부터 그 생존율(70.7±0.9%)이 감소하여 제 10일에는 2.7±0.2%로 매우 의의있는 세포사 효과를 나타냈다(P＜0.001)(Table 1).

LoVo세포에서도 비슷한 소견을 보였는데 0.1μM에서는 제 6일부터 생존율(79.6±4.1%)이 감소하여 제 8일에는 46.3±

2.5%로 의의 있게 감소하였다가(P＜0.001), 제 10일에는 80.4±1.0%로 증가하는 생존율을 나타냈으며 1μM에서는 제 6일부터 감소하여 제 10일에는 41.3±2.3%의 낮은 생존 율을 나타냈다(P＜0.001). 10μM, 100μM, 1,000μM에서는 제 2일부터 감소하여(89.2±3.7%, 59.4±6.2%, 61.3±3.1%) 제 10일에는 매우 의의 있게 낮은 생존율(25.7±1.1%, 7.1±

0.3%, 6.5±0.8%)(P＜0.001)을 나타냈다(Table 2). 5-FC와 5-FU에 대한 결과를 종합하여 실험군에서는 10μM, 100μM, 1,000μM의 농도를 선택하여 실험하였다.

(4)

Fig. 1. Normal growth pattern of the WiDr & Lovo cell lines.

2 4 6 8 10

0.8

Absorbance

Day 0

LoVo 0.7 WiDr

0.5

0.3 0.6

0.4

0.2 0.1

4) CD유전자의 이입 및 단백질 발현

CD유전자의 세포내 이입은 β-galactosidase 면역염색법 으로 확인하였다. 낮은 퍼센트이기는 하지만 WiDr 및 LoVo 세포 모두에서 성공적으로 이루어졌으며 제 2일에 미약한 발현으로 시작하여 제 6일에 비교적 강한 발현을 보였다.

현미경하에서 제 6일 표본슬라이드의 6곳을 세어 계산한 WiDr세포의 이입률은 4.2±0.6%였으며 LoVo세포의 이입 률은 13.8±0.8%이었다(Fig. 2).

단백질 발현을 보기 위하여 시행한 western blot 결과를 보면 52 Kd에서 단백질 발현 띠를 볼 수 있었으며 WiDr세 포에서는 2일에는 미약하게 보이다가 제 4일에는 강하게 나타났다가 점차 감소하였다. 반면 LoVo세포에서는 제 2일 부터 미약한 단백질 발현 띠를 보이다가 점차 강하게 나타 Table 2. The cell survival rate of WiDr & Lovo cell to 5-FU administration on each concentration (단위 %)

ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ Days after culture

5-FU conc. Cell line ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

2 4 6 8 10

0.1μM WiDr 106.7±0.7 113.3±1.9 89.5±2.1 93.2±2.7 88.2±1.2

LoVo 102.9±7.7 114.5±3.1 79.6±4.1 46.3±2.5* 80.4±1.0

1μM WiDr 106.3±0.4 71.4±1.4 46.7±0.9 31.8±0.5 30.8±0.6*

LoVo 101.3±3.1 101.9±3.3 58.0±2.2 62.9±0.7 41.3±2.3*

10μM WiDr 105.7±3.7 61.6±0.8 31.6±0.4 20.5±0.9 23.7±0.6*

LoVo 89.2±3.7 68.9±2.0 56.7±0.2 27.0±5.1 25.7±1.1*

100μM WiDr 101.6±3.1 43.0±0.8 20.6±0.5 7.3±0.3 8.7±0.4*

LoVo 59.4±6.2 50.0±2.7 36.1±2.6 10.0±0.7 7.1±0.3*

1000μM WiDr 70.7±0.9 17.3±0.6 1.7±0.3 1.3±0.1 2.7±0.2*

LoVo 61.3±3.1 56.4±3.9 20.6±2.1 10.3±1.2 6.5±0.8*

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ P＜0.001*

Table 1. The cell survival rate of WiDr & Lovo cell to 5-FC administration on each concentration (단위 %)

ꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚꠚ Days after culture

5-FC conc. Cell line ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

2 4 6 8 10

0.1μM WiDr 121.6±7.1 114.9±2.3 108.1±4.8 101.8±2.0 109.0±2.2

LoVo 86.7±4.2 149.4±6.5 105.9±1.4 105.5±4.8 106.0±0.5

1μM WiDr 137.1±2.0 119.2±4.4 102.2±4.1 107.1±1.8 105.5±1.7

LoVo 102.5±11.0 140.6±3.9 112.8±3.8 109.2±1.4 101.5±0.2

10μM WiDr 119.7±6.2 129.1±2.0 101.7±4.5 103.1±2.6 115.0±2.1

LoVo 107.1±4.1 125.8±0.5 101.3±3.9 131.4±3.8 109.3±0.9

100μM WiDr 121.6±6.3 105.2±4.3 108.3±0.2 101.4±3.8 110.3±1.8

LoVo 110.4±2.1 139.0±7.3 145.9±1.6 131.9±3.6 108.4±1.3

1,000μM WiDr 112.4±2.4 113.7±2.1 117.8±1.0 112.8±0.7 119.3±0.9

LoVo 136.3±5.3 158.2±5.4 133.5±2.3 128.4±2.2 114.8±0.6

(5)

나 제 8일에는 매우 강한 발현 띠를 나타냈다(Fig. 3).

5) CD유전자 이입 후 5-FC 투여에 따른 세포사 효과 먼저 WiDr세포에서 보면 10μM 농도에서는 제 2일부터 제 1, 2군보다 현저하게 감소한 생존율(42.5±0.4%)을 나타 냈으며(P＜0.001), 제 4일에도 42.9±1.0%의 낮은 생존율을 보이다가 제 6일(50.0±0.7%)부터 증가하기 시작하였으나 제 10일에도 제 1군보다는 낮으나 제 2군보다는 높은 69.1

±2.1%의 낮은(P＜0.001) 생존율을 나타내어 제 2군의 5-FU 0.5μM 농도의 효과와 비슷한 결과를 나타냈다(Table 2, Fig.

4A). 100μM 농도에서도 제 2일부터 제 1, 2군에 비하여 현 저하게 낮은 생존율(45.1±1.6%)을 보이다가 제 8, 10 일에 약간 증가하였으나(54.3±0.9%) 제 1군보다는 낮고 제 2군 보다는 높은 생존율을 나타내어(P＜0.001) 제 2군의 5-FU 5μM의 효과와 비슷한 결과를 보였다(Table 2, Fig. 4B).

1,000μM 농도에서는 제 2일부터 현저하게 낮은 생존율 (41.7±2.4%)을 나타냈고 시간이 지날수록 감소하여 제 10 일에는 13.8±0.3%의 생존율을 보여(P＜0.001) 제 2군의 5-FU 50μM 농도의 효과를 나타냈다(Table 2 & Fig. 4C).

한편 LoVo세포에서 보면 10μM 농도에서 제 2일에 70.1

±2.1%의 약간 감소한 생존율(P＜0.01)을 보이다가 제 4, 6, 8일에도 약간 감소하여 제 10일에는 63.2±4.8%, 12일에는 58.5±1.6%의 생존율을 나타내어(P＜0.001), 제 2군의 5-FU

1μM 농도의 효과를 나타냈다(Fig. 5A). 100μM 농도에서도 제 2일에는 약간 감소한 75.2±1.2%의 생존율을 보이다가 제 4, 6, 8, 10일에 점차 감소하여 제 12일에는 44.2±1.9%, 14일에는 가장 낮은 32.7±3.2%의 생존율을 나타내어(P＜

0.001) 제 2군의 5-FU 10μM 농도의 효과를 나타냈다(Fig.

5B). 1,000μM 농도에서 또한 제 2일에는 약간 감소한 76.4

±1.2%의 생존율을 보이다가 점차 약간씩 감소하여 12일에 는 36.5±0.2%의, 14일에는 가장 낮은 17.2±1.3%의 생존율 을 나타내어(P＜0.001) 제 2군의 5-FU 100 μM 농도의 효과 를 나타냈다(Fig. 5C).

6) 방관자 효과(bystander effect) 및 세포 회복률(cell recovery)

CD유전자가 이입된 세포는 5-FC를 독성이 강한 5-FU로 전환하므로 세포가 사멸하는 것은 당연하다. WiDr세포의 경우 CD유전자 이입률은 4.2%이므로 95%의 생존율을 나 타내어야 하지만 실제로는 5-FC 농도에 따라 40∼20%의 생 존율을 나타냈고, LoVo세포에서 역시 이입률이 13.8%인데 70∼20%의 생존율을 나타냈다. 이는 CD미발현 세포도 파 괴되는 즉 방관자 효과가 있음을 설명하는 것이다.

제 10일 이후 5-FC 투여를 중단하고 정상 배양액으로 배 양하여 측정한 WiDr세포의 회복률은 10μM 농도에서는 제 2, 4일에 감소하였다가 제 6일부터 증가하기 시작하여 12일 에 86.1±1.4%, 14일에는 112.6±2.5%로 완전히 회복되었 고, 100μM 농도에서도 제 2, 4, 6일에 감소하였다가 제 8일 부터 증가하기 시작하여 제 14일에 76.1±2.5%, 16일에는 104.1±1.2% 로 완전히 회복되었다. 1,000μM 에서는 제 2, 4일부터 감소하기 시작하여 제 12일에 가장 낮은 10.6±

1.1%의 생존율을 보이다가 그 이후 조금씩 회복세를 보였 으나 제 20일에도 39.6±1.2%로 완전회복이 되지 않았다 (Fig. 4).

Fig. 2. Microphotograph of transfected pCMV/CD-1 gene into WiDr (A) and LoVo cell (B) by β-galactosidase immunohistochemical staining on day 6 of culture. Blue color indicated transfected cells (A: WiDr, B: LoVo) ×200.

A B

Fig. 3. Photograph of CD protein expression on WiDr and LoVo cell lines by Western blot on 2nd, 4th, 6th, 8th days of culture.

52 KDa

2 4 6 8 2 4 6 8

WiDr LoVo

(6)

한편 LoVo세포의 회복률은 10μM에서 제 2일부터 감소하 여 제 12일에 가장 낮은 생존율을 보이다가 그 이후 점차 회복되어 제 20일에는 98.8±1.8%로 회복되었으며 100μM 에서는 제 2일부터 감소하여 제 14일에 가장 낮은 생존율 (32.8±3.2%)을 보이다가 점차 증가하여 회복세를 보였으나 제 20일에도 69.7±0.5%로 완전히 회복되지 못하였다.

1,000μM에서도 제 14일에 가장 낮은 생존율(17.2±1.3%)을 보인 후 조금씩 회복되는 기미를 보였으나 제 20일에도 29.4±1.0%의 생존율을 보였다(Fig. 5). 회복되는 기간과 정 도는 CD단백질발현 기간, 이입률과 5-FC 농도(즉 5-FU 농 도)와 관계가 있는데 즉 WiDr세포는 제 4일에 단백질 발현 이 가장 강하게 나타나고 6일에 이어 8일에는 거의 발현되 지 않았고 LoVo세포는 4일에 약간 나타나고 6일에 강하게 발현되어 8일에도 계속 발현되어 세포사 효과와 회복률이 차이가 있고 이입률과 5-FC 농도에 따른 5-FU 농도와 정상 관관계가 있었다(Fig. 3∼5).

고 찰

결장 및 직장암에 주로 사용되는 화학요법제인 5-fluorouracil (5-FU)의 투여는 위장관 또는 골수에 대한 심각한 독성 을 야기할 수 있고, 환자의 반수 이하에서만 반응을 나타내 고 있다.(6,11,14,25,28) 또한 간동맥 화학요법(hepatic arterial chemotherapy, HAC)도 그 치료성적은 전신요법과 비슷하며 담도경화증, 담낭염, 간염 및 소화성궤양 등의 부작용을 야 기할 수 있다. 따라서 이러한 5-FU의 독성을 배제할 수 있 는 투여방법이나 새로운 치료방법의 개발이 요구되고 있 다. 1960∼1970년대 초 viral genome이나 naked DNA를 배양 된 포유류 세포에 이입시키는 기술이 개발된 이래로 현재 유전자 변환 상태를 유전자 수준에서 교정하고자 하는 “유 전자 요법(gene therapy)”이 암치료의 이론적 근거를 배경으 로 다양하게 연구 시도되고 있다.(16,25) 종양 유전자 치료 에 대한 주요 접근 방법으로는 면역 감시 체계에 결합이 있는 암 환자에서 자가 면역세포 항진을 목적으로 IL-2, TNF 등의 cytokine을 이용하거나,(4,21) 비활성화된 종양억 A

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

160

% survival

Days of culture 0

140 120 100

60 80

40 20

FC FC+CD FU

WiDr - 10 uM B

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

160

% survival

Days of culture 0

140 120 100

60 80

40 20

WiDr - 100 uM

C

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

160

% survival

Days of culture 0

140 120 100

60 80

40 20

WiDr - 1000 uM

Fig. 4. A, B, C. The Effects of growth inhibition of WiDr cells after 10 uM (A), 100 uM (B), 1,000 uM (C) of 5-FC, 5-FU administration and 5-FC administration after CD gene transfection on 2nd, 4th, 6th, 8th, 10th days of culture, and the survival curves of WiDr cells with normal culture media of CD gene transfected cells on 12th, 14th, 16th, 18th, 20th days.

(7)

제 유전자(p53)의 활성을 목적으로 wild-type의 종양억제 유 전자의 형질을 도입하는 방법, 또는 antisense를 이용하여 암 유전자를 억제시키거나,(19) 약제 감수성 유전자를 사용하 는 것 등이 있다.(5) 이 중에서 약제 감수성 유전자의 사용, 즉 enzyme prodrug을 이용한 자살유전자요법(suicide gene therapy) 중 자살유전자의 하나인 cytosine deaminase (CD) 유 전자를 이용한 치료가 보고되고 있는데, 세균 및 곰팡이에 존재하고 있는 CD는 포유동물에는 존재하지 않고, 무독성 인 5-FC를 독성물질인 5-FU로 전환시켜서 세포독성과 방사 선 감수성을 나타내는 세균 효소로 알려져 있다. Esche- richia coli의 CD유전자는 유전자 전달 vector에 적합한 약 1.9 kb의 구조로 구성되어 있다.(3,14) 이러한 CD유전자를 결장암 세포에 선택적으로 발현시킨 후 무독성인 5-FC를 투여하면 5-FU의 전신독성을 최소화할 수 있고 세포독성은 최대화시킬 수 있다. 현재 결장암, 다형신경교모종, 전립선 암, 유방암세포 등에서 plasmid 또는 virus vector를 이용, CD 유전자를 도입시켜 CD단백질이 발현되는 것이 보고되고 있다.(3,12,13,16,17,20) 이러한 유전자 치료를 위한 유전자 를 표적세포에 전달하는 물질을 vector라고 하고, naked

DNA 또는 RNA, DNA 또는 RNA와 ligand나 liposome에 결 합시킨 것, 치료 유전자를 함유한 virus 입자 등이 이에 속한 다. Vector에는 viral vector와 non-viral vector가 있고, 가장 간단한 vector로는 naked DNA를 들 수 있다. 이것은 이입률 이 낮다는 단점이 있으나, DNA 크기에 큰 영향을 받지 않 고, liposome이나 lipofectin과 결합하여 특별한 장기나 조직 에 쉽게 조준할 수 있으며, 면역반응이 적어 반복 투여가 가능하다는 장점이 있다.

저자들은 CD유전자, LacZ, Hygromysin-resistant gene이 모 두 포함된 pCMV/CD-1 plasmid vector를 사용하여 lipofectin 이용방법으로 WiDr 및 LoVo 결장암 세포에 이입을 시도하 였다. CD유전자 이입은 β-galctosidase 면역조직염색법으로 확인하고(Fig. 2), polyclonal anti-CD antibody를 이용한 western blot을 시행하여 CD단백질 발현을 확인하였다(Fig. 3).

WiDr세포에서는 처음에는 미약하지만 배양 제 4일에 증가 되어 6, 8일에 다소 감소하는 이입상태와 이와 일치하는 CD단백질 발현 즉 제 2일에는 약한 발현을 보이다가 4일의 강한 발현 후 6, 8일에 점차 감소하는 CD단백질 발현을 관 찰할 수 있었다. CD유전자의 이입률에 대하여 Aghi 등(1)과 A

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

160

% survival

Days of culture 0

140 120 100

60 80

40 20

FC FC+CD FU

LoVo - 10 uM B

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

160

% survival

Days of culture 0

140 120 100

60 80

40 20

LoVo - 100 uM

C

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

160

% survival

Days of culture 0

140 120 100

60 80

40 20

LoVo - 1000 uM

Fig. 5. A, B, C. The effects of growth inhibition of LoVo cells after 10 uM (A), 100 uM (B), 1,000 uM (C) of 5-FC, 5-FU administration and 5-FC administration after CD gene transfection on 2nd, 4th, 6th, 8th, 10th days of culture following by culture,and the survival curves of LoVo cells with normal culture media of CD gene transfected cells on 12th, 14th, 16th, 18th, 20th days.

(8)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Rowley 등(24)은 plasmid vector를 사용 시 1% 이하 또는 2∼

5%의 이입률을 보고하였는데 저자들의 실험에서는 WiDr 세포가 4.2±0.6%, LoVo 세포가 13.8±0.8%로 차이가 있지 만 비교적 높은 이입률을 나타냈다. 이것은 vector의 세포내 친화성과 조준의 차이로 볼 수 있다. 실험 이전에 90% 이상 의 CD 유전자가 이입된 세포들을 이용하기 위하여 CD-hygromycin resistant 세포의 선별배양을 1년간 시도하였 지만 성공하지 못하고 위와 같은 4∼13%의 이입률을 나타 내는 세포들을 이용하였다.

WiDr 세포에 대한 5-FC 투여, 5-FU 투여 및 CD유전자 이입 후 5-FC 투여의 효과에 대하여 Austin과 Huber (3)는 각각 10μM, 100μM, 1,000μM, 10,000μM, 100,000μM을 투여한바 5-FC 투여 후에는 100% 이상의 생존율을 유지하 다가 10,000μM 이상 투여 시 생존율이 급격히 감소하였고, 5-FU 투여 후에는 10μM에서 10% 이하의 생존율을 나타내 고 100μM, 1,000μM, 10,000μM에서도 계속 10% 이하의 생존율을 나타냈다고 하였다. 또한 CD유전자 이입 후 5-FC 를 투여한 후에는 10μM에서 70% 정도, 100μM에서 20%

정도, 1,000μM에서 5% 정도의 생존율을 보였다고 하였다.

Rowley 등(24)도 0.1 mM, 0.5 mM, 50 mM의 5-FU 투여 후에 는 2일부터 50% 이하로 감소한 후 4∼6일에 5% 이하로 생 존율이 감소하였으며 5-FC 만을 투여한 경우 0.01 mM에서 10 mM까지는 100% 이상의 생존율을 유지하다가 그 이후 급격히 감소하였고 CD유전자 이입 후 5-FC를 투여한 후에 는 0.01 mM에서 80%, 0.05 mM에서 55%, 0.1 mM에서 15%, 0.5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM에서 10∼15%의 생존 율을 나타냈다고 하였다. 저자들의 실험에서도 Fig. 4에서 보는 바와 같이 10μM, 100μM, 1,000μM의 5-FC 투여 후에 는 100∼150%의 생존율을 보였고 5-FU 투여 후에는 농도 와 배양 시간에 따라 60∼70%에서 점차 감소하여 5∼20%

의 생존율을 나타냈다. CD유전자 이입 후 5-FC를 투여한 후에는 10μM에서 2, 4일에 42%, 6∼10일에는 50∼70%의 생존율을 보였으며 100μM 에서는 제 2일부터 10일까지 4 5∼55%의 생존율을, 1,000μM에서는 제 2일에 41%에서 시 간이 지날수록 감소하여 제 12일에 10%의 낮은 생존율을 보여 다른 연구자들과 비슷한 결과를 보였다. 한편 LoVo세 포에서는 다른 연구자들의 보고가 드물었는데, 저자들의 실험에서 보면 5-FC 투여 후에는 WiDr세포와 비슷한 결과 를 보였으나 5-FU 투여 후에는 제 2일에 90∼60%에서 점차 감소하여 제 10일에는 25∼6%의 생존율을 보여 비슷하였 다. 그러나 CD유전자 이입 후 5-FC 투여 후에는 10 uM에서 제 2일에 70%에서 서서히 감소하여 제 12일에 58%, 16일에 도 74%의 생존율을 보였고 100μM에서도 제 2일 75%에서 서서히 감소하여 14일에 32%의 생존율을 나타냈고 그 이후 서서히 증가하였으나 20일에도 70%의 생존율을 나타냈다.

1,000μM에서도 역시 제 2일에 75%에서 서서히 감소하여 제 14일에 17%로 가장 낮은 생존율을 보이다가 다시 증가

하기 시작하였으나 제 20일에도 30%의 생존율을 나타내어 WiDr세포와 약간 다른 양상의 세포사 효과를 나타냈다. 이 는 w-p53 양성인 LoVo 세포에서는 5-FU 에 대한 w-p53 유 전자의 상승효과(저자들의 다른 실험결과 로 현재 논문 게 재 심사 중)와 CD단백질 발현과 5-FC 농도와의 정상관관계 의 결과와 관련이 있다고 생각된다(Fig. 2). 즉 WiDr세포는 제 4일에 단백질 발현이 높고 점차 감소하기 때문에 제 2, 4, 6일에 작용하고 농도가 높을수록 작용시간이 길어지고 LoVo세포는 제 2일에는 미약한 단백질 발현으로 작용 정도 가 약하나 4, 6, 8일의 시간이 지날수록 단백질 발현이 높게 나타나므로 작용시간이 길고 농도가 높을수록 또한 작용시 간이 길어지므로 제 20일까지도 효과가 나타난다는 것을 알 수 있었다. 위의 작용시간 지연은 5-FU의 세포내 이동이 전달체-매개성 전송(carrier-mediated transport)에 의해 이루 어지는 데 반해 5-FC는 비매개성 투과에 의해 이루어지기 때문이거나, 5-FC의 효소 분해 작용의 속도가 느리고, 전환 된 5-FU의 세포 내 농도가 고농도로는 되지 못하기 때문이 라고 하였다.(22,29)

이입률이 높지 않은 유전자를 이용한 CD 유전자 치료에 서 CD발현세포들은 5-FC 투여 후 자신의 세포사뿐만 아니 라 주위의 CD미발현세포들의 세포사도 동반하는 소위 방 관자효과(bystander effect)를 나타내는 것으로 알려져 있다.

저자들의 실험에서 4.2%와 13.8%의 이입률에도 불구하고 30∼80%의 세포사 효과를 나타낸 것은 CD미발현세포에도 5-FU의 효과가 작용하였다는, 즉 방관자 효과가 있었다는 것을 알 수 있었다. 방관자 효과의 기전에 대하여 gap junc- tion을 통한 세포간의 metabolic cooperation, 이외에도 apo- ptosis에 의해 파괴된 세포의 독성 잔유물의 세포내 이입, 세포면역 등이 관여한다고 보고된 바 있다.(8,9,17) 또한 gap junction의 구성 성분인 connexin의 발현정도에 따라, α -glycyrrhenitic acid로 세포간의 전달을 억제함에 따라 방관 자 효과의 차이가 있다고 하였다.(7,18) 적어도 in vitro에서 는 세포간의 gap junction을 통한 metabolic cooperation이 방 관자 효과의 주요 기전이라고 하였다. Trinh 등(27)에 의하 면 흰쥐에 이식된 결장암에서 5-FU 자체가 세포막을 자유 로이 통과해서 주변세포를 죽이는 CD/5-FC 계통의 방관자 효과가 gap junction intercellular communication (GJIC)에 의 존해서 방관자 효과를 나타내는 HTK/GCV system보다 우 월한 효과를 보인다고 하였다. 실제 종양세포 1 cm³가 10⁹개 의 세포로 구성되어 있을 때 이들 세포내 1∼5% 정도에서 유전자 이입이 이루어지므로, 실제 유전자 치료에 있어서 유전자가 주입된 세포들이 주입되지 않은 주변 세포를 죽 이는 방관자 효과가 매우 중요한 역할을 하는 것이다. CD 유전자 이입 후 5-FC 투여 10일 후에 5-FC 투여를 중단하고 정상배양액으로 배양한 세포 회복률(cell recovery) 결과에 대하여 Rowley 등(24)은 0.5 mM의 5-FC 투여 중단 4∼5일 후부터 회복하기 시작하여 배양 제 20일경에는 거의 100%

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서는 10μM에서 제 14일에, 100μM에서는 제 16일에 100%

회복하였으며 1,000μM에서는 농도가 높아 제 20일에도 40% 정도로 회복 중이었다. LoVo세포에서도 늦게 지연되 기는 하였지만 10μM에서 제 20일에 회복되었으나 100μ M, 1,000μM 에서는 제 20일에도 70%, 30% 정도로 회복 중이었다. 실제 임상에서 사용한다면 이입률을 높이기 위 하여 adenovirus vector의 이용방법이나 세포 회복률을 감안 하여 농도에 맞게 기간을 맞춰 재 투여하는 방법, 다른 면역 치료나 방사선조사를 고려해야 될 것으로 생각된다.

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