Effects of Ganoderma Lucidum Extract Ethanol Extract and Microneedle Therapy System on Hair Growth in an Alopecia Model of C57BL/6N Mice

(1)

Received: May 3, 2014 ∙ Revised: May 19, 2014 ∙ Accepted: May 20, 2014 Corresponding Author: Lee Seung Yeon

Department of Oriental Pediatrics, Dongeui University Oriental Medicine Hospital, 52-57, Yangjeong-ro, Busanjin-gu, Busan 614-851, Republic of Korea.

Tel: +82-51-850-8680 E-mail: synlee@deu.ac.kr

ⓒ The Association of Pediatrics of Korean Medicine. All rights reserved. This is an open-access article distributed under the tenus of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

C57BL/6N 마우스 탈모모델에서 미세다륜침과 영지추출물이 모발성장에 미치는 영향

주봉현․유선애․강경화^*․이승연

동의대학교 한의과대학 소아과교실

*동의대학교 한의과대학 생리학교실

Abstract

Effects of Ganoderma Lucidum Extract Ethanol Extract and Microneedle Therapy System on Hair Growth in an Alopecia Model of C57BL/6N Mice

Ju Bong Hyun․Yu Sun Ae․Kang Kyung Hwa^*․Lee Seung Yoen Dept. of Pediatrics, College of Oriental Medicine, Dongeui University

*Dept. of Oriental Physiology, College of Oriental Medicine, Dongeui University

Objectives

This study was carried out to investigate the effect of Ganoderma lucidum extract (GLE) and microneedle therapy system (MTS) on hair growth in an alopecia model of C57BL/6N mice.

Methods

Five-week old mice were depilated and separated in 4 groups ; CON (50% EtOH), MXD (5% Minoxidil), MTS and GLE + MTS. The treatments were applied twice a week for 3 weeks. The hair growth was determined photographically, the hair density, thickness and length were identified by Folliscope and the weights of body and organs were measured. In dorsal skin tissue, the expression of hair growth-related gene and protein was analyzed by RT - PCR or Western blot. In addition, the hair follicles in the dermis were observed by H&E staining.

Results

The promotion of hair growth was observed in GLE + MTS and MTS compared to CON. The hair density, thickness and length were also improved in GLE + MTS and MTS compared to CON. The mRNA expression of TGF-α, TGF-β1, IGF-1, PRL and PL and the protein expression of VEGF and IGF-1 were increased in GLE + MTS and MTS compared to CON. The hair follicles and hair root growth were improved in GLE + MTS and MTS compared to CON. In the above results, GLE + MTS were more effective than MTS.

Conclusions

These results suggest that GLE and MTS has a hair growth activity and can be useful for the treatment of alopecia.

Key words : Ganoderma lucidum extract, Alopecia, C57BL/6N, Microneedle therapy system

대한한방소아과학회지 제28권 제2호(2014년 5월) J Pediatr Korean Med. May, 2014;28(2):72-87 ISSN 1226-8038(Print), 2287-9463(Online), http://dx.doi.org/10.7778/jpkm.2014.28.2.072

(2)

Ⅰ. Introduction

탈모는 모발이 존재해야할 부위에서 탈락되는 상태 를 의미하는 것으로 반흔성과 비반흔성으로 구분되며 반흔성 탈모증은 모낭이 파괴되고 섬유화되어 영구적 인 탈모로 이어지고 비반흔성 탈모증은 조직의 섬유화 없이 모낭이 그대로 보존되는 질환으로서 휴지기 탈모 증, 원형 탈모증, 생장기 탈모증 등이 있다¹⁾.

모발은 생명과 직접 연관되지는 않지만 두개골을 외부의 충격으로부터 보호하는 완충작용과 자외선으 로부터 두피를 보호하고 중금속 등의 노폐물을 배출하 는 역할 뿐 아니라 미용적인 면에서도 중요한 요소로 작용한다. 모발의 모습이 변화되면 그 사람의 이미지 도 변화되며, 젊음과 아름다움, 이성적 매력도 달라지 므로 발모, 양모 및 탈모 예방에 많은 관심이 증가하고 있다²⁾.

탈모의 원인으로 가장 많이 지목되는 것은 유전이 나³⁾, 최근에는 유전적 요인 이외에도 정신적 스트레스, 혈액순환 및 영양장애, 내분비장애, 노화, 자가면역질 환, 환경오염, 식생활 패턴의 서구화, 다이어트, 펌과 염색 등 후천적인 요인에 의해 탈모 인구가 늘어나고 있는 실정이다^4-5).

탈모에 관한 한의학적 표현으로는, 󰡔素問󰡕 ｢上古天眞論｣에서 발타 (髮墮), 발락 (髮落), 모발 (毛髮), 발거 (髮去)⁶⁾ 등으로, 󰡔肘後備急方󰡕에서 수빈발독 (鬚鬢髮禿)⁷⁾, 󰡔諸病源候論󰡕에서 수발독락후 (鬚髮禿落候), 귀 지두후 (鬼舐頭候), 모발불생후 (毛髮不生候), 백독후 (白禿候)⁸⁾ 등이라 하였으며, 󰡔外科正宗󰡕에는 유풍 (油風)⁹⁾이라 하여 오늘날의 원형탈모증을 설명하고 있다.

탈모의 원인에 대해서는 크게 내인 (內因)과 외인 (外因)으로 나누어 내인 (內因)으로 신허 (腎虛), 혈허 (血虛), 폐기허 (肺氣虛), 혈열 (血熱), 칠정 (七情) 등을, 외 인 (外因)으로는 풍사 (風邪), 풍열 (風熱), 습열 (濕熱), 풍 (風), 화 (火) 등을 원인으로 보았으며, 최근에는 전 체적인 몸 상태의 부조화에서 원인을 찾고 있으며, 몸 의 부조화가 호르몬 및 면역체계의 이상을 초래하여 모발의 순환장애와 영양공급 장애를 유발한다고 보고 있다¹⁰⁾.

현재 모발성장을 촉진하는 약물로서 미국 Food and Drug Administration (FDA)에서 공인받은 것으로 Minoxidil 과 Finasteride의 두가지가 있으나¹¹⁾, 발모 및 탈모방지 효과를 유지하기 위해서는 평생 동안 지속적

인 사용이 요구되며, 장시간 사용시 부작용과 지속의 어려움으로 인해 사용이 제한되는 실정이다. 이에 따 라 최근에는 천연물 소재를 이용한 치료제에 대한 관 심이 커지고 있고 아울러 한약재를 이용한 탈모치료의 실험과 연구가 진행되고 있다^12-20).

탈모환자는 점점 증가하고 있으며 초발 연령이 낮 아짐을 감안해 볼 때²⁰⁾, 탈모를 방지하고 모발의 성장 을 촉진시킬 수 있는 새로운 치료방법의 모색과 개발 은 매우 중요하다고 할 수 있다.

영지추출물은 임상에서 다용되는 재료이나 탈모 치 료에 있어 그 효능 측정이나 치료기전 탐색과 같은 구 체적인 연구는 현재까지 없었고, 특히 영지추출물의 효과를 극대화시키기 위해 사용되는 미세다륜침을 활 용한 치료법에 대한 효과를 검정한 연구는 없었기에 본 연구를 진행하였고, 유효한 효과를 얻었기에 보고 하는 바이다.

Ⅱ. Material and methods

1. 시약

본 실험에 사용된 시약은 MOBARIN과 Bikiro cream 은 TAI GUK Pharm. co. LTD (Hwaseong, Kyungki-Do, Korea)로부터, Derma-Q는 DONGBANG Medi-Care Inc

(Korea)로부터, chloroform, isopropanol, Igepal CA-630, Xylene, Eosin Y (1001337923), Hematoxylin Solution (SLBD9194), Gelatin (1001441535)은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터, RT-PCR kit (one-step RT-PCR PreMix kit)는 iNtRON Biotechnology, Inc. (Sungnam, Kyungki-Do, Korea)로부터, transforming growth factor

(TGF)-α, TGF-β1, insulin-like growth factor type 1 (IGF-1), prolactin (PRL), placenta lactogen (PL) primer는 Bioneer (Daejeon, Korea)로 부터, vascular endothelial growth factor (VEGF)와 IGF-1 primary antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 로부터, horse- radish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibody는 Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. (KPL, Gaithersburg, MD, USA)로부터, polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane과 enhanced chemiluminescence (ECL) system 은 Amersham Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ, UK)로부터, paraformaldehyde는 SAMCHUN PURE CHEMICAL (P1690, Pyeongtaek, Kyungki-Do, Korea),

(3)

74 Effects of Ganoderma Lucidum Extract Ethanol Extract and Microneedle Therapy System on Hair Growth in an Alopecia Model of C57BL/6N Mice

Ammonia solution (A0627)은 SAMCHUN PURE CHE- MICAL (Pyeongtaek, Kyungki-Do, Korea)로부터, Chromium potassium sulfate (07360-01)는 KANTO CHEMICAL (Tokyo, Japan)로부터 구입하여 사용하였다.

2. 실험동물

실험동물은 5 주령의 C57BL/6N male mice를 (주)SAM TAKO (Osan, Kyungki-Do, Korea)로부터 구입하여, 온 도 23 ± 3 ℃, 상대습도 50 ± 10%, 12시간 조명주기 조 건하에서 식이와 식수를 자유롭게 섭취하도록 하였으 며 7일간의 적응기간을 거친 후 실험에 사용하였다.

3. 영지추출물 조제

본 실험에 사용된 영지 (Ganoderma lucidum)는 국내 자연산으로, 갓부분 500 g을 증류수로 세척한 후, 4 L 의 25% ethanol을 첨가하여 10시간 동안 실온에서 추 출 (Ganoderma lucidum extract, GLE)하였다. 추출된 용 액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, 0.2 ㎜여과지 에서 여과하여 rotary evaporator로 500 ㎕이 되도록 감 압농축하였다. 실온에서 냉각시킨 뒤 감압필터를 사용 하여 불순물을 제거하고 고압·멸균하여 20 ℃에 보관 하였다가 실험직전 사용하였다.

4. 미세다륜침

미세다륜침은 Derma-Q (DONGBANG Medi-Care Inc, Korea) 0.2 ㎜를 사용하여 단독 또는 영지추출물 도포 와 병행하여 탈모 부위에 좌-우, 상-하, 대각선 방향으 로 각 1회 롤링 하였다.

5. 실험방법 1) 실험군 설정

실험군은 제모 후 50% EtOH을 도포한 대조군 (CON), 5% Minoxidil 도포군 (MXD), 미세다륜침 처치 군 (MTS) 및 GLE와 미세다륜침 처치군 (GLE + MTS)으 로 나누었다.

2) 제모 및 처치

실험동물들은 일차적으로 마우스용 clipper를 이용 하여 등 부위의 털을 깎고, 피부 속에 남아있는 모낭과 미세한 털을 제거하기 위하여 이차적으로 제모제 Bikiro (태극제약, 화성, 한국)를 발라 모낭이 눈에 보이

지 않을 때까지 제거하고 24시간 동안 방치하여 미세 상처가 회복 되도록 하였다.

CON군은 50% EtOH를, MXD군 (MOBARIN 5%

용액, TAI GUK Pharm. co. LTD, Hwaseong, Korea)을 각각 100 ㎕씩, 일주일에 2번, 제모한 등 부위에 3주간 도포하였다. MTS군은 일주일에 2번, Derma-Q를 사용 하여 6회 롤링 하였으며, GLE + MTS군은 일차적으로 Derma-Q를 이용하여 3회 롤링 하고 GLE를 100 ㎕씩 도포한 후 Derma-Q로 3회 롤링 하여 약의 흡수를 촉진 시켰다.

6. 피부의 육안적 관찰 및 털 길이 측정

시료와 미세다륜침 처치를 시작한 날을 실험 1 일째 로 정하여 피부에서 일어나는 발모와 관련된 특징들을 관찰하면서 7일 간격으로 디지털카메라를 이용하여 촬영하였고, 핀셋을 사용하여 털을 뽑아 털 길이를 측 정하였으며, 더욱 세밀한 관찰을 위하여 Folliscope (Lead M, Seoul, Korea)를 이용하여 모낭이 형성된 부위 와 발모부위를 촬영함으로써 털의 밀도와 굵기를 관찰 하였다.

7. 체중 및 장기 무게 측정

체중은 매주 1회 측정하였고, 장기의 무게는 실험 종료후 동물을 희생시킨 후 비장, 흉선, 심장, 간, 신장 을 적출하여 측정하였다.

8. RNA extraction and RT-PCR

시료 처치 7일, 14일, 21일째에 동물을 희생시켜 얻 어진 피부 조직에 Trizol을 넣어 homogenizer로 분쇄시 켜 RNA를 추출하였다.

RT-PCR은 one-step RT-PCR PreMix kit를 사용하여 45℃에서 30분, 94 ℃에서 5분간 반응시킨 후 94 ℃에 서 30초간 denaturation시키고, 적정온도에서 30초간 annealing시킨 다음, 72℃에서 1분간 extension시키는 cycle을 30회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5분간 PCR machine (GeneAmp, PCR system 9700, USA) 에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100 V 조건에서 30분간 전기영동을 통하 여 분석하였다.

Primer는 TGF-α, TGF-β1, IGF-1, PRL, PL과 GAPDH를 사용하였으며 염기 서열은 다음과 같다 (Table 1).

(4)

Table 1. Primers for RT-PCR Analysis

F: forward, R: reverse

9. Western blotting

피부조직 속에 함유되어 있는 IGF-1 과 VEGF를 분 석하기 위하여 -80 ℃에 보관하고 있던 등 피부 조직 0.2 g에 lysis buffer 500 ㎕을 첨가하여 homogenizer로 분쇄시켜 원심분리하여 단백질을 정량하였다.

단백질 50 ㎍을 l0% sodium dodecyl sulfate poly- acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리하고, hypond-PVDF membrane으로 transfer하였다. Transfer된 membrane은 Tris-buffered saline Tween-20 (TBST) (20 mM Tris, pH 7.6, 136 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 용해된 5% skim milk에 1 시간동안 실온에서 blocking 하였다.

Primary antibody는 1 : 1000 으로 희석하여 4℃에서 overnight 하였고, TBST로 3회 세척하고, HRP-conjugated secondary antibody (1 : 1000 dilution)로 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. ECL system을 이용하여 각 factor의 발현을 조사하였다.

10. DNA 및 단백질 밴드의 정량

DNA 및 단백질 밴드는 Scion Image Release Beta3b software (Frederick, MD, USA)를 사용하여 정량하였다.

각 밴드영역에서 측정된 pixels의 수를 정량하여 대조 군에 대한 비율로 나타내었다.

11. 피부조직의 조직학적 관찰

피부조직의 조직학적 관찰을 위해 약 처리 7일, 14 일, 21일째에 동물을 희생시켜 적출한 등쪽 피부조직 을 10% 중성포르말린에 고정한 다음 24시간 후 흐르 는 물에 수세하고 alcohol, xylene, paraffin으로 탈수, 투 명, 침투과정을 거쳐 파라핀에 포매하였다. 포매된 조 직을 5 ㎛의 박절편을 만들어 hematoxylin and eosin (H&E) 염색한 후 광학현미경으로 모낭 크기와 수, 모 근의 길이를 관찰하였다.

12. 통계처리

성적은 통계 프로그램 패키지 SPSS (17.0 K for Wind- ows)를 사용하여 평균치 ± 표준편차로 나타내었고 유 의수준은 p<0.05 로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Dunett test 검정을 실시하 였다.

Ⅲ. Results

1. 발모현상 관찰

제모한 배부의 발모상태를 육안적으로 관찰한 결과 실험 1일, 7일에는 모든 군에서 육안적인 발모현상을 전혀 관찰할 수 없었다 (Fig. 1, 2).

(5)

Fig. 1. Photograph of hair regrowth in depilated C57BL/6N mice after topical application of CON, MXD, MTS and GLE + MTS on 1 day

The dorsal skins of mice were shaved and applied hair removal cream externally, and the test treatments were applied twice a week for 3 weeks. CON was treated with 100 ㎕ of 50% EtOH as a vehicle.

MXD was rolled 6 times with micro-needle therapy system. GLE + MTS was treated with 100 ㎕ of Ganoderma lucidum extract and rolled 6 times with micro-needle therapy system.

Fig. 2. Photograph of hair regrowth in depilated C57BL/6N mice after topical application of CON, MXD, MTS and GLE + MTS on 7 days

The group CON, MXD, MTS and GLE + MTS are same as Fig. 1.

실험 14일째는 50% EtOH을 도포한 CON군에서는 5마리 중 2마리에서 피부가 부분적으로 회색으로 변하 였으나 5마리 모두 육안적인 발모현상은 관찰할 수 없 었다. MXD군에서는 5마리 모두 피부가 전체적으로 회색으로 변하고 발모현상이 모두 관찰되었다. MTS군 에서는 5마리 중 1마리에서 피부가 전체적으로 연한 회색으로 변하고, 2마리에서 피부가 부분적으로 회색 으로 변하는 현상을 관찰하였다. GLE + MTS군에서는 5마리에서 피부가 전체적으로 회색으로 변하고 부분 적인 발모현상을 관찰하였으며 MXD군, GLE + MTS 군, MTS군, CON군 순으로 발모현상이 촉진되는 것을

관찰하였다 (Fig. 3).

실험 21일째는 50% EtOH을 도포한 CON군에서는 5마리 모두 부분적인 발모현상을 관찰하였다. MXD군 에서는 5마리 모두 전체적으로 증가된 발모현상을 관 찰하였다. MTS군에서는 5마리 가운데 4마리에서 전체 적으로 증가된 발모현상을, 1마리에서 부분적인 발모 현상을 관찰하였다. GLE + MTS군에서는 5마리 모두 전체적으로 증가된 발모현상을 관찰하였으며 MXD군, GLE + MTS군, MTS군, CON군 순으로 발모현상이 촉 진되는 것을 관찰하였다 (Fig. 4).

(6)

2. 모발의 밀도, 굵기 및 길이 변화에 미치는 영향 1) 모발의 밀도 변화

Filloscope 50배율에서 모발의 밀도를 측정한 결과 CON군은 153.72 ± 39.83 number of hair/㎠ 이었으며, MXD군은 351.25 ± 32.93 number of hair/㎠ 으로 CON 군에 비해 유의한 증가를 보였다. MTS군은 192.23 ± 17.75 number of hair/㎠ 으로 CON군에 비해 유의한 차이가 없었고 GLE + MTS군은 237.87 ± 46.85 number of hair/㎠ 로 CON군에 비해 유의한 증가를 보였다 (Fig. 5).

2) 모발의 굵기 변화

Filloscope 100 배율에서 모발의 굵기를 측정한 결과

CON군은 12.63 ± 5.38 ㎛이었으며, MXD군은 28.65 ± 4.09 ㎛로 CON군에 비해 유의한 증가를 보였다. MTS 군은 14.30 ± 3.29 ㎛로 CON군에 비해 유의한 차이가 없었고 GLE + MTS군은 23.20 ± 4.23 ㎛로 CON군에 비해 유의한 증가를 보였다 (Fig. 6).

3) 모발의 길이 변화

제모 후 7일, 14일, 21일째 모발의 길이를 측정한 결 과 7일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군의 모발의 길이는 각각 0.21 ± 0.04 ㎜, 0.23 ± 0.03 ㎜, 0.21 ± 0.03 ㎜와 0.21 ± 0.03 ㎜로 각 실험군 간의 유의 한 차이는 없었다. 14 일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군의 모발의 길이는 각각 0.78 ± 0.24 ㎜, 2.50 ± 0.53 ㎜, 1.20 ± 0.48 ㎜와 2.80 ± 0.71 ㎜로 CON

(7)

Fig. 5. Effect of GLE and MTS on hair density in an alopecia model of C57BL/6N mice by Folliscope (X50 magnification) Results are the mean ± S.D. of 5 mice per group. * p<0.05 vs. CON group

Fig. 6. Effect of GLE and MTS on hair thickness in an alopecia model of C57BL/6N mice by Folliscope (X100 magnification) Results are the mean ± S.D. of 5 mice per group. * p<0.05 vs. CON group

군에 비해 MXD군과 GLE + MTS군에서 유의한 증가를 보였다. 21일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군의 모발의 길이는 각각 3.90 ± 0.57 ㎜, 7.90 ±

0.57 ㎜, 4.35 ± 0.58 ㎜와 6.20 ± 0.63 ㎜로 CON군에 비해 MXD군과 GLE + MTS군에서 유의한 증가를 보였 다 (Fig. 6).

(8)

Fig. 7. Effect of GLE and MTS on hair length in an alopecia model of C57BL/6N mice

Results are the mean ± S.D. of 5 mice per group.

* p< 0.05 vs. CON group

Fig. 8. Effect of GLE and MTS on body weight in an alopecia model of C57BL/6N mice Results are the mean ± S.D. of 5 mice per group.

3. 체중변화에 미치는 영향

제모 후 0일, 7일, 14일, 21일째 체중을 측정한 결과 0일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군의 체 중은 각각 19.84 ± 0.90 g, 19.26 ± 0.51 g, 19.36 ± 1.05 g과 19.47 ± 1.21 g으로 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다. 7일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS 군의 체중은 각각 21.52 ± 1.09 g, 21.43 ± 1.12 g, 20.55

± 1.38 g과 20.28 ± 1.06 g으로 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다. 14일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE

+ MTS군의 체중은 각각 23.73 ± 1.27 g, 24.06 ± 0.70 g, 23.13 ± 1.08 g과 22.77 ± 1.03 g으로 각 실험군 간의 유 의한 차이는 없었다. 21일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군의 체중은 각각 25.48 ± 0.59 g, 25.83 ± 0.98 g, 24.85 ± 1.14 g과 24.74 ± 0.85 g으로 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다 (Fig. 8).

4. 장기무게 변화에 미치는 영향

제모 후 21일째 장기무게를 측정한 결과 비장의 무게 는 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군이 각각 0.07

± 0.01 g, 0.07 ± 0.02 g, 0.06 ± 0.02 g과 0.07 ± 0.01 g으 로 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다. 흉선의 무게는

CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군이 각각 0.08

± 0.02 g, 0.07 ± 0.02 g, 0.08 ± 0.02 g과 0.08 ± 0.02 g으 로 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다. 심장의 무게는 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군이 각각 0.15

± 0.01 g, 0.15 ± 0.02 g, 0.14 ± 0.02 g과 0.15 ± 0.02 g으 로 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다. 간의 무게는 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군이 각각 1.24

± 0.14 g, 1.34 ± 0.22 g, 1.28 ± 0.19 g과 1.30 ± 0.18 g으 로 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다. 신장의 무게는 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군이 각각 0.38

± 0.05 g, 0.44 ± 0.18 g, 0.41 ± 0.10 g과 0.39 ± 0.04 g으 로 각 실험군 간의 유의한 차이는 없었다 (Fig. 9).

5. 모낭 및 모발의 성장조절 유전자 발현에 미치는 영향 1) TGF-α, TGF-β1 과 IGF-1 유전자 발현 변화

제모 후 7일, 14일, 21일째 피부조직의 TGF-α, TGF- β1과 IGF-1의 발현량을 조사한 결과 MXD군은 모두 CON군에 비해 TGF-α, TGF-β1과 IGF-1 발현이 현저 히 증가하였다. MTS군과 GLE + MTS군은 MXD군에 비해 발현량이 적었으나 GLE + MTS군, MTS군 순으로 CON군에 비해 발현이 증가하였다. 또한 시간이 지날

(9)

Fig. 9. Effect of GLE and MTS on organ (spleen, thymus, heart, liver, and kidney) weight in an alopecia model of C57BL/6N mice

Results are the mean ± S.D. of 5 mice per group.

Fig. 10. Effect of GLE and MTS on the expression of TGF-α, TGF-β1 and IGF-1 mRNA in an alopecia model of C57BL/6N mice

RNA was isolated from the dorsal skin tissues at day 7 (A), day 14 (B), and day 21 (C). Detection of mRNA was examined by RT-PCR analysis as described in Materials and Methods. GAPDH was used as internal control genes.

(10)

Fig. 11. Effect of GLE and MTS on the expression of PRL and PL mRNA in an alopecia model of C57BL/6N mice

RNA was isolated from the dorsal skin tissues at day 7 (A), day 14 (B), and day 21 (C). Detection of mRNA was examined by RT-PCR analysis as described in Materials and Methods. GAPDH was used as internal control genes.

수록 발현량이 증가하였다 (Fig. 10).

2) PRL과 PL유전자 발현 변화

제모 후 7일, 14일, 21일째 피부조직의 PRL과 PL의 발현량을 조사한 결과 MXD군은 모두 CON군에 비해 PRL과 PL의 발현이 현저히 증가하였다. 반면 MTS군 은 CON군과 유사한 발현을 보였다. GLE + MTS군은 MXD군에 비해 발현량이 적었으나 CON군에 비해 발 현이 증가하였고 PRL의 발현은 14일 이후에 증가하였 다 (Fig. 11).

6. VEGF와 IGF-1 단백질 발현에 미치는 영향

제모 후 7일, 14일, 21일째 피부조직의 VEGF와 IGF-1 의 단백질 발현을 조사한 결과 MXD군은 모두 CON군에 비해 VEGF와 IGF-1 발현이 현저히 증가하 였다. 반면 MTS군은 VEGF와 IGF-1 발현이 7일과 14 일째에 CON군과 유사한 발현을 보였으나 21일째 발

현이 증가하였다. GLE + MTS군은 시간이 지날수록 발 현량이 증가하여 21일째 발현량이 MXD군과 유사하였 다 (Fig. 12).

7. 피부조직의 광학현미경적 관찰소견

제모 후 7일, 14일, 21일째 H&E 염색을 시행하여 피부조직에서 모낭, 모근 및 발모상태를 광학현미경으로 관찰하였다. 제모 7일째 CON군은 모근의 발달이 미약하 였으며, 이에 비하여 MXD군, MTS군과 GLE + MTS군은 모근의 발달이 촉진 된 것을 관찰하였다. 제모 14일째에 는 모든 군에서 모낭의 발달을 관찰할 수 있었고, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군은 CON군에 비하여 모낭의 수와 크기가 현저히 증가하였다. 제모 21일째에는 완전히 성 장한 모근이 다수 관찰되었고 특히 MXD군, MTS군과 GLE + MTS군은 CON군에 비하여 모낭과 모근의 수와 크기가 발달하였고, 굵은 털의 수가 증가하여 보다 잘 발달된 발모상태를 나타내었다 (Fig. 13).

(11)

Fig. 12. Effect of GLE and MTS on the expression of VEGF and IGF-1 protein in an alopecia model of C57BL/6N mice

Protein was isolated from the dorsal skin tissues at day 7 (A), day 14 (B), and day 21 (C). The expression of VEGF, IGF-1 and β-actin was assayed by western blot analysis as described in Materials and Methods.

Fig. 13. Effect of GLE and MTS on the histological changes in an alopecia model of C57BL/6N mice Sections of dorsal skin tissues were stained at day 7 (A), day 14 (B), and day 21 (C) by H&E staining. X40.

Histological findings of the hair follicles of depilated C57BL/6N mice were improved in MXD, GLE + MTS and MTS as compared with CON.

(12)

Ⅳ. Discussion

일반적으로 탈모는 모낭 파괴 여부에 따라 반흔성 과 비반흔성으로 나누어지며, 모낭이 그대로 보존되어 있는 비반흔성의 탈모의 경우 원형탈모, 남성형 탈모 증, 여성형 탈모증, 생장기 탈모증, 휴지기 탈모증 등으 로 구분할 수 있다¹⁾.

탈모증은 생명에 직접적인 위해를 가하는 질환은 아니지만, 외적인 미용 및 이미지를 중시하는 사회적 현상 때문에 우울증, 대인기피증과 같은 심신증을 유 발 할 수 있기 때문에 그 중요성이 점점 커지고 있다.

최근에는 노화나 유전적인 요인 뿐만 아니라 각종 환경오염, 업무의 스트레스, 혈액순환 및 영양장애, 식 생활 패턴의 서구화, 다이어트, 잦은 염색이나 펌 등과 같이 후천적인 영향으로 인해 급격하게 탈모인구가 증 가하고 있다^4-5). 이에 전 세계적으로 모발성장과 탈락 에 관한 세포학적, 생화학적 연구가 활발히 진행되고 있으며, 모발성장을 촉진하는 약물이 많이 개발되고 있다.

현재 모발성장을 촉진하는 약물로서 미국 FDA에서 공인 받은 것으로 Minoxidil과 Finasteride의 두 가지가 있다¹¹⁾. 하지만 발모 및 탈모방지 효과를 유지하기 위해 서는 평생 동안 지속적인 사용이 요구되며, Minoxidil의 장기간 사용은 가려움증, 홍반, 표피박리, 건성화 피부 염, 다모증²¹⁾과 같은 여러 가지 부작용을 동반하며, fi- nasteride의 경우에는 여성은 사용하지 못하며, 남성은 성기능감퇴와 같은 부작용²³⁾을 동반할 수 있기 때문에 최근에는 천연물에 대한 관심이 고조되고 있다.

한의학적으로도 탈모에 관한 많은 연구가 진행되고 있으며, 전통적인 탕제 복용법 이외에 다양한 치료방 법들이 보고되고 있다. 약침과 봉침을 통한 치료사례 가 있고¹³⁾, 가감청영탕 (加減淸營湯)¹⁴⁾, 경옥고 (瓊玉膏)¹⁵⁾ 등을 통한 탈모 방지와 발모 촉진에 대한 보고가 있으며, 상백피¹⁶⁾, 측백 ¹⁷⁾, 반하¹⁸⁾, 골쇄보¹⁹⁾, 천남성²⁰⁾ 등과 같이 단일 약재를 이용해 모발의 성장을 촉진한 연구결과가 보고되었다.

영지는 임상에서 다용되는 재료이나 탈모관련 임상 증례만 보고되고 있고¹²⁾, 실험적 연구는 보고된 바가 없 기에 새로운 탈모치료제 개발 및 미세다륜침과 같이 사 용했을 때의 효과를 알아보고자 본 연구를 진행하였다.

C57BL/6N 생쥐는 체모가 검정색이고, 자발적 탈모 가 일어나는 특징을 지니고 있다. 또한 melanocyte가 모

낭에만 한정적으로 존재하며 melanin합성이 모발성장 주기와 잘 일치하므로 피부색으로 모발의 성장주기를 판정할 수 있다는 장점이 있어 모발생리 연구에 널리 이용되고 있다²⁴⁾. C57BL/6N 생쥐는 제모 후 6주째 휴 지기가 오기 때문에 체중 20 g 내외의 5주령 C57BL/6N 쥐를 일차적으로 마우스용 clipper를 이용하여 털을 깎 고, 이차적으로 제모제를 발라 모낭이 눈에 보이지 않 을 때까지 제거한 후, 24시간 동안 방치하여 미세상처 가 회복되도록 하였다.

미세다륜침은 아주 가느다란 길이 0.25-2.0 ㎜의 바늘 192개가 장착된 롤러를 피부 표면에서 굴리면서 기계적 인 구멍에 의해 피부에 다수의 microscopic channel을 만 들도록 고안된 장비^25-26)로 처음에는 약물 전달을 증가시 키기 위한 방법으로 사용되었으나, 유효 약물성분의 도 포 없이 기계적으로 구멍을 만들어주는 자체만으로도 각종 흉터와 주름 개선에 효과가 있다는 연구들이 보고 되고 있다²⁷⁾. 본 실험에서는 Derma-Q (DONGBANG Medi-Care Inc, Korea) 0.2 ㎜를 사용하여 단독 또는 영지 추출물 도포와 병행하여 탈모 부위에 6회 동안 좌-우, 상-하, 대각선 방향으로 롤링 하였다.

영지 (Ganoderma lucidum)는 미온무독 (微溫無毒)하 며 감미고 (甘微苦)하여 심 (心), 비 (脾), 폐 (肺), 간 (肝), 신경 (腎經)에 들어가며 양심안신 (養心安神), 보기익 혈 (補氣益血), 지해평천 (止咳平喘)하는 효능이 있다

28). 또한 polysaccharide, tritepene, nucleoside, steroid, fat- ty acid, alkaloid, 단백질 아미노산 무기염류 등이 포함 되어 있어 이뇨작용 (利尿作用), 해독작용 (解毒作用), 보간작용 (補肝作用), 조압작용 (調壓作用)이 뛰어나며 강심 (强心), 강장 (强壯), 강정 (强精) 작용에 탁월한 효 능이 있는 것으로 알려져 있으며 항균작용, 항염증작 용과 면역작용 뿐만 아니라 항암작용 등의 약리효과가 우수한 것으로 밝혀져 오고 있다²⁹⁾. 본 실험에 사용한 영지 (Ganoderma lucidum)는 국내 자연산으로, 갓부분 500 g을 세척 후 25% ethanol에서 10시간동안 추출하 여, 원심분리기로 돌리고 여과하여 감압농축하였다.

실험그룹은 CON군, MXD군, MTS군, GLE + MTS군 총 4개 그룹으로 나누어 한 개 그룹당 5마리씩 실험하 였다. CON군은 50% EtOH를, MXD군은 5% Minoxidil 을 각각 100 ㎕씩, MTS군은 Derma-Q를 사용하여 6회 롤링 하였으며, GLE + MTS군은 일차적으로 Derma-Q 를 이용하여 3회 롤링하고 GLE를 100 ㎕씩 도포한 후 다시 Derma-Q로 3회 롤링 하여 약의 흡수를 촉진시켰 으며, 주 2회씩, 3주간 진행하였다.

(13)

미세다륜침과 영지추출물의 발모효과를 알아보기 위한 실험에서 육안적으로 관찰한 결과, 실험 1일, 7일 에는 모든 군에서 발모현상을 관찰할 수 없었다. 실험 14일째는 50% EtOH을 도포한 CON군에서는 5마리 중 2마리에서 피부가 부분적으로 회색으로 변하였으 나 5마리 모두 육안적인 발모현상은 관찰할 수 없었다.

MXD군에서는 5마리 모두 피부가 전체적으로 회색으 로 변하고 발모현상이 모두 관찰되었다. MTS군에서는 5마리 중 1마리에서 피부가 전체적으로 연한 회색으로 변하고, 2마리에서 피부가 부분적으로 회색으로 변하 는 현상을 관찰하였다. GLE + MTS군에서는 5마리에 서 피부가 전체적으로 회색으로 변하고 부분적인 발모 현상을 관찰하였으며 MXD군, GLE + MTS군, MTS군, CON군 순으로 발모현상이 촉진되는 것을 관찰하였다.

실험 21일째는 CON군에서는 5마리 모두 부분적인 발 모현상을 하였고, MXD군에서는 5마리 모두 전체적으 로 증가된 발모현상을 관찰하였다. MTS군에서는 5마 리 가운데 4마리에서 전체적으로 증가된 발모현상을, 1마리에서 부분적인 발모현상을 관찰하였다. GLE + MTS군에서는 5마리 모두 전체적으로 증가된 발모현 상을 관찰하였으며 MXD군, GLE + MTS군, MTS군, CON군 순으로 발모현상이 촉진되는 것을 관찰하였다.

미세다륜침과 영지추출물의 발모효과를 알아보기 위해 제모한 생쥐에서 Filloscope를 이용해 모발의 밀도 굵기 및 길이를 관찰하였다. Filloscope 50 배율에서 모 발의 밀도를 측정한 결과 CON군은 153.72 ± 39.83 number of hair/㎠ 이었으며, MXD군은 351.25 ± 32.93 number of hair/㎠ 으로 CON군에 비해 유의한 증가를 보였다. MTS군은 192.23 ± 17.75 number of hair/㎠ 으 로 CON군에 비해 유의한 차이가 없었고 GLE + MTS 군은 237.87 ± 46.85 number of hair/㎠ 로 CON군에 비 해 유의한 증가를 보였다. Filloscope 100 배율에서 모 발의 굵기를 측정한 결과 CON군은 12.63 ± 5.38 ㎛ 이 었으며, MXD군은 28.65 ± 4.09 ㎛ 로 CON군에 비해 유의한 증가를 보였다. MTS군은 14.30 ± 3.29 ㎛ 로 CON군에 비해 유의한 차이가 없었고 GLE + MTS군은 23.20 ± 4.23 ㎛ 로 CON군에 비해 유의한 증가를 보였 다. 제모 후 7 일, 14 일, 21 일째 모발의 길이를 측정할 결과 7일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군 의 모발의 길이는 각각 0.21 ± 0.04 ㎜, 0.23 ± 0.03 ㎜, 0.21 ± 0.03 ㎜ 와 0.21 ± 0.03 ㎜ 로 각 실험군 간의 유 의한 차이는 없었다. 14일째 CON군, MXD군, MTS군 과 GLE + MTS군의 모발의 길이는 각각 0.78 ± 0.24 ㎜,

2.50 ± 0.53 ㎜, 1.20 ± 0.48 ㎜와 2.80 ± 0.71 ㎜ 로 CON 군에 비해 MXD군과 GLE + MTS군에서 유의한 증가를 보였다. 21일째 CON군, MXD군, MTS군과 GLE + MTS 군의 모발의 길이는 각각 3.90 ± 0.57 ㎜, 7.90 ± 0.57

㎜, 4.35 ± 0.58 ㎜와 6.20 ± 0.63 ㎜ 로 CON군에 비해 MXD군과 GLE + MTS군에서 유의한 증가를 보였다.

미세다륜침은 콜라겐 유도치료라는 개념으로 설명 될 수 있고 통상적인 상처 치유 과정을 보면 염증기 때 대식세포가 늘어나면서 platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), TGF와 같은 cytokine의 분비가 증가하고, 이러한 다양한 성장인자 에 의해 섬유모세포가 활성화되어 콜라겐 섬유를 비롯 한 결체조직의 합성이 증가하게 되면서 피부조직이 재 생이 된다³⁰⁾. 본 실험에서는 CON군과 비교시 MTS군 에서 발모에 유의한 결과를 얻었다. 이러한 점을 볼 때, 피부에 인위적으로 무수히 많은 미세한 구멍을 만드는 것이 새로운 콜라겐 섬유의 합성을 유도하여, 상처를 치유하는 동시에 모낭의 재생을 돕고, 기능을 활성화 시켜 발모에 영향을 끼침을 알 수 있었다.

또한 MTS군에 비해 GLE + MTS군에서 육안적으로 발모가 많이 되었고, Filloscope로 관찰시 모발의 밀도, 길이, 굵기가 유의한 증가를 보였기에 영지가 발모를 촉진시키는 효능이 있음을 확인하였다.

본 실험에서 사용한 약물과 도구가 부작용 및 스트 레스를 유발하는지 알아보기 위해 체중과 장기무게의 변화를 관찰했다. 장기적 반복적 스트레스 자극은 cor- ticosterone의 증가와 체중의 감소를 유발하고³¹⁾, 약물 의 독성은 장기무게의 변화를 가져올 수 있다. 제모 후 0일, 7일, 14일, 21일째 체중을 측정할 결과 0일, 7일, 14일, 21일째 체중변화는 1.3 g 안팎으로 각 실험군 간 의 유의한 차이는 없었다. 제모 후 21일째 장기무게를 측정한 결과 비장, 흉선, 심장, 간, 신장 모두에서 유의 한 차이는 없었다. 이상의 결과로 볼 때 Minoxidil, 영 지추출물, 미세다륜침 자극이 스트레스로 작용하지 않 았음을 알 수 있고, Minoxidil과 영지추출물이 독성을 띄지 않음을 알 수 있었다. 다만 실험기간이 짧았던 점 을 감안해 볼 때, 3개월 이상의 장기간 사용이 어떠한 영향을 미치는지는 추후 실험이 더 필요해 보인다.

세포의 성장과 분화는 여러 가지 cytokine에 의해 일 어나며 모발의 성장과 관련된 cytokine에는 TGF-α, TGF-β1, IGF, PRL, PL, VEGF 등이 있다. 이들 인자들 은 기질, 진피유두, 혈관계의 증식을 유도하고, 진피유 두내 세포외기질의 양을 증가시켜 성장기에 있는 모낭

(14)

을 유지시킨다.

TGF-α, TGF-β1은 모낭에서 발현되는 성장인자 중 하나로써 모발의 성장에 영향을 미친다^32-33). TGF-α와 TGF-β1의 RNA 발현량은 제모 후 7일째, 14일째, 21 일째 시간이 흐름에 따라 발현량이 서서히 증가하였다.

21일째 TGF-α와 TGF-β1의 RNA 발현량은 MXD군, GLE + MTS군, MTS군, CON군순으로 발현하였다.

IGF-1은 진피유두에서 만들어지는 물질로 모낭에 있는 keratinocyte의 분화를 촉진하여 모발의 성장을 돕 는 대표적 성장인자로, 모유두 세포의 성장을 촉진하 며 모발성장을 촉진하고 모발의 세포사를 방지하여 육 모작용을 한다³⁴⁾. IGF-1의 RNA 발현량은 제모 후 7일 째 MXD군, GLE + MTS군, MTS군, CON군순으로 발 현량이 증가하였고 14일째, 21일째 시간이 흐름에 따 라 MXD군, GLE + MTS군과 CON군의 발현량이 서서 히 증가하였으나, MTS군의 변화는 적었다.

Prolactin도 털의 성장조절에 관여하는데, prolactin 은 뇌하수체 이외의 태반, 유선, 뇌 및 림프구에서 많이 발견되는 것으로 모낭의 성장과 발생을 조절한다³⁵⁾. PL 역시 모발의 성장을 촉진하고 모발세포의 세포사를 방 지한다. 제모 후 7일, 14일, 21일째 피부조직의 PRL과 PL의 RNA 발현량을 조사한 결과 MXD군은 모두 CON군에 비해 PRL과 PL의 발현이 현저히 증가하였 다. 반면 MTS군은 CON군과 유사한 발현을 보였다.

GLE + MTS군은 MXD군에 비해 발현량이 적었으나 CON군에 비해 발현이 증가하였고 PRL의 발현은 14일 이후에 증가하였다.

VEGF는 혈관의 생성을 유도하는 성장인자로서 혈 관내피를 성장시켜 혈액순환을 개선하여 모발의 성장 과 모근세포의 분화를 강화시키는 인자로 알려져 모발 관련 연구에 사용되는 지표인자 중 하나이다³⁶⁾. 털을 지배하는 혈관들은 털의 성장주기에 따라 변화하는데 생장기에서 최대로 분포하며, 퇴화기에는 대부분의 모 세혈관이 붕괴되거나 사라진다. 털의 성장주기별 혈관 분포변화는 혈관재생에 관여하는 VEGF에 의하여 내피 세포의 활성을 유도하거나 증식 및 이주에 관여하며 혈관재생에 필요한 matrix proteolysis와 관련된 protease 생산을 자극하고 혈관투과성을 항진시키는데, 사람에 서 모낭의 외모근초의 각질세포에서 관찰된다고 하였 다. 제모 후 7일, 14일, 21일째 피부조직의 VEGF와 IGF-1의 단백질 발현을 조사한 결과 MXD군은 모두 CON군에 비해 VEGF와 IGF-1 발현이 현저히 증가하였 다. 반면 MTS군은 VEGF와 IGF-1 발현이 7일과 14일째

에 CON군과 유사한 발현을 보였으나 21일째 발현이 증가하였다. GLE + MTS군은 시간이 지날수록 발현량 이 증가하여 21일째 발현량이 MXD군과 유사하였다.

이상의 실험 결과로 볼 때 피부조직의 VEGF와 IGF-1의 단백질 발현에서 영지추출물과 미세다륜침의 병용이 Minoxidil과 유사한 효과를 보이는 것을 알 수 있었다.

그러나, 21일째 MTS군에서 IGF-1의 RNA발현은 CON에 비해 증가하지 않았으나 단백질 발현은 CON 에 비해 증가하는 것으로 보아 유전자의 전사와 번역 단계에서 조절을 통해 유전자의 발현에 영향을 미치는 것으로 생각된다.

미세다륜침과 영지추출물의 발모효과를 알아보기 위한 실험에서 H&E 염색을 시행하여 피부조직에서 모 낭, 모근 및 발모상태를 광학현미경으로 관찰하였다.

제모 7일째 CON군은 모근의 발달이 미약하였으며, 이 에 비하여 MXD군, MTS군과 GLE + MTS군은 모근의 발달이 촉진 된 것을 관찰하였다. 제모 14일째에는 모 든 군에서 모낭의 발달을 관찰할 수 있었고, MXD군, MTS군과 GLE + MTS군은 CON군에 비하여 모낭의 수 와 크기가 현저히 증가하였다. 제모 21일째에는 완전 히 성장한 모근이 다수 관찰되었고 특히 MXD군, MTS 군과 GLE + MTS군은 CON군에 비하여 모낭과 모근의 수와 크기가 발달하였고, 굵은 털의 수가 증가하여 보 다 잘 발달된 발모상태를 나타내었다.

영지추출물과 미세다륜침의 발모효과에 대한 실험 의 결과를 세가지 측면으로 나누어 살펴보았다. 육안 및 현미경으로 관찰한 결과 모발성장을 촉진하였고, 모 발의 밀도와 굵기를 증가시키는 효과를 나타내었으나 체중과 장기의 무게에 변화를 나타내지 않았다. 분자생 물학적 관찰결과 피부조직에서 모낭과 모발의 성장과 관련된 인자의 유전자 및 단백질 발현을 증가시켰다.

마지막으로 광학현미경적 관찰 결과 진피층에서 모낭 과 모근의 성장을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터 영지추출물과 미세다륜침이 모발성장을 촉진하고 유도 하는 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 따라서 장기간 사용시 다모증, 가려움증, 홍반 등의 부작용이 있는 미 녹시딜의 대체 치료법으로 영지추출물과 미세다륜침의 병용치료가 효과가 있는 것으로 생각한다.

Ⅴ. Conclusion

C57BL/6N 마우스 탈모 모델에서 영지추출물과 미

(15)

세다륜침이 모발성장에 미치는 영향과 기전을 조사하 여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 육안적 관찰결과 GLE + MTS군에서 전체적으로 증가 된 발모현상이 있었다.

2. Filloscope를 이용한 모발의 밀도, 굵기 및 길이를 관찰한 결과, 밀도에 있어서 CON군과 비교시 GLE + MTS군 은 약 1.5배 증가했다. 굵기에 있어서 CON군과 비교시 GLE + MTS군은 2배가량 굵어졌다. 밀도에 있어서 CON군과 비교시 GLE + MTS군은 1.5배 증가하였다.

3. 모낭 및 모발의 성장 조절 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 유전자의 발현량을 관찰한 결과 CON 에 비해 GLE + MTS군은 TGF-α, TGF-β1, IGF-1 의 발현량이 CON군에 비해 발현이 증가하였고, 시간이 자날수록 발현량이 증가하였다. PRL, PL의 경우 GLE

+ MTS군은 14일 이후 CON군에 비해 발현량이 증가 했다.

4. 피부조직의 VEGF와 IGF-1 단백질 발현을 조사한 결과 GLE + MTS군은 시간이 지날수록 발현량이 증가하여 21 일째 MXD군과 유사하였다.

5. 모낭, 모근 및 발모상태를 광학 현미경으로 관찰한 결과 MXD군, MTS군, GLE + MTS군은 제모 7일째부터 모 근이 발달하는 것이 관찰되었으며, 제모 21일째에는 MXD군, MTS군과 GLE + MTS군은 CON군에 비하여 모낭과 모근의 수와 크기가 발달하였고, 굵은 털의 수가 증가하여 보다 잘 발달된 발모상태를 나타내었다.

Ⅵ. Acknowledgement

이 논문은 2014학년도 동의대학교 교비 지원 (2014AA373)에 의해 연구되었습니다.

References

1. Ahn SG, Jang KH, Song JW, Cheon SH. Common Skin Disease 2nd ed. Seoul: Doctor's Book. 2009:496-8.

2. Mun JB, Kim YJ, Lee TA. TCM objective evaluation of the effect of alopecia treatment. Korean J Med. 2006:

57-69.

3. Hanneken S, Ritzmann S, Nothen MM, Kruse R.

Androgenetic alopecia. current aspects of a common phenotype. Hautarzt. 2003;54(8):703-12.

4. Lee SI, Ahn DS, Shin MS. Korean medicine clinical application. Seoul: Seongbosa. 1982:399-401.

5. Stem KS. The molecular and structural biology of hair, introduction. Ann NY Acad Sci, xii-xiii. 1991.

6. Kim DH. Huangdi's internal classic annotation. Seoul:

EusSungdang. 2001:14, 18, 236.

7. Ge Hong. Handbook of prescriptions for emergencies.

Beijing: Commercial Press. 1998:500.

8. Ding GI. Treatise on the pathogenesis and manifestations of all diseases. Beijing: People's Health Publishing.

1991:763, 765, 772.

9. Zhen BG. Orthodox manual of external medicine. Beijing:

Chinese Parmaceutical Science Press. 2002:987.

10. Jang HY, Choi KH, Kim SH, Kwon KR, Kim BY.

Bibliographic studies of depilation. J Pharmacopuncture.

2002;5(2):92-108.

11. Rumsfield JA, West DP, Fieldler-weiss VC. Topical minoxidil therapy for hair regrowth. Clin Pharm. 1987;

6(5):54-67.

12. Ju BH, Choi YK, Yu SA, Lee SY. A case report on child with different types of alopecia. J Pediatric Korean Med. 2013;27(3):53-64.

13. Lee SY, Kho JM, Lee SY, Lee MH, Kim YJ, Lee SH, Yu SY, Jeung JY, Khun HJ, Lee YH. A case study of beevenom effect on alopecia universalis started from alopecia areata. The Acupuncture. 2008;31(1):163-73.

14. Hong JA, Kang SJ, Jang JY, Kang YR. A Clinical trialon efficacy of Gagamcheongyongtang in the alopecia patient with febrile tendency. J Korean Orient Med Ophthalmol Otolaryngol Dermatol. 2013;26(2):19-29 15. Do EJ, Hwang MY, Kim SY, Lee JS, Yang DS, Yang

JH, Kim MR. The effect of Gyungokgo-gamibang extract on hair growth and protein expression in mice. Korean J Herbology. 2001;26(4):9-14.

16. Na HY, Lee MW, Jeong HS, Kwon J, Lee KG, Lee CH. Experimental studies on hair growth effects of cortex mori radicis in hair removed C57BL/6N mice. Korean J Orient Physiol Pathol. 2006;20(2):428-35.

17. Kim YJ, Jung HC, Jung HT, Choi KY, Yun YG, Jang SI. Hair growth promoting effect of thuja orientalis ethanol extracts on hair loss-induced DBA1J mice.

(16)

Korean J Orient Physiol Pathol. 2004;18(5):1471-5.

18. Jeong IK, Jo HY, Kim TH, Kim NS, Jeong HS, Lee CH. Experimental studies on the hair growth activity of extracts of pinelliae rhizoma in spontaneous alopecia model and normal C57BL/6N mice. Korean J Orient Physiol Pathol. 2009;23(1):84-92.

19. Jeong SY, Jeong IK, Kim DK, Jo HY, Jeong HS, Lee CH. Experimental studies on the hair growth activity of drynariae rhizoma extracts in C57BL/6N mice. Korean J Orient Physiol Pathol. 2007;21(2):453-61.

20. Kwon KS, Lee MW, Jeong IK, Jeong HS, Song BY, Song JM, Lee CH. Experimental studies on the hair growth activity of fractions and extract of arisaematis rhizoma in C57B/6N mice. Korean J Orient Physiol Pathol. 2009;23(3):619-30.

21. Lee JS, Kim SN. A survey of the status of hair loss product use, hair loss treatment and satisfaction level.

J Fashion Bus. 2007;11(2):76-91.

22. Benmously Mlika R, Ben Hamida M, Hammami H, Dorbani Ben Thabet I, Rouatbi M, Mokhtar I.

Long-pulsed Nd:YAG laser in the treatment of facial hypertrichosis during topical minoxidil therapy. J Cosmet Laser Ther. 2013;15(4):217-8.

23. Melcangi RC, Caruso D, Abbiati F, Giatti S, Calabrese D, Piazza F, Cavaletti G. Neuroactive steroid levels are modified in cerebrospinal fluid and plasma of post-finasteride patients showing persistent sexual side effects and anxious/depressive symptomatology. J Sex Med. 2013;10(10):2598-603.

24. Olsen EA ed. Disorders of hair growth : diagnosis and treatment. NY: McGraw-Hill. 1994:39-58.

25. Mark RP. Microneedles for transdermal drug delivery.

Adv Drug Deliv Rev. 2004;56(5):581-7.

26. Al-Qallaf B, Das DB. Optimizing microneedle arrays

for transdermal drug delivery: extension to non-square distribution of microneedles. J Drug Target. 2009;17(2):

108-22.

27. Aust MC, Fernandes D, Kolokythas P, Kaplan HM, Vogt PM. Percutaneous collagen induction therapy: an alternative treatment for scars, wrinkles, and skin laxity.

Plast Reconstr Surg. 2008;121(4):1421-9.

28. The Herbology Professors in the of colleges of Oriental Medicine in Korea. Herbology(5th edition). Seoul:

YoungLim Co. 1999:498-9.

29. Kang KH, Yoon HM. Study on anti-allergic effecst of Ganoderma lucidum herbal acupuncture and Gano- derma lucidum extract. J Pharmacopuncture. 2007;10(3):

37-46.

30. Kim JH, Park HY, Jung MY, Choi EH. Dermal proliferative effect and safety of Automicroneedle Therapy System(AMTS). Korean J Dermatol. 2010;48(11):955-65.

31. Jang HY. Body weight gain and corticosterone changes in response to acute and chronic stress in rats. Seoul:

KyungHee University. 2004:9-13.

32. Kong MK. Effects of black sesame oils on hair growth in C57B/6N mice. Daegu: Keimyung University. 2008:37.

33. Ryoji T. Growth factors and hair growth. Korean Soc investig Dermatol. 1997;4(2):103-8.

34. Ahn SY, Long-Quan Pi, Hwang ST, Lee WS. Effect of IGF-I on hair growth is related to the anti-apoptotic effect of IGF-I and up-regulation of PDGF-A and PDGF-B. Ann Dermatol. 2012;24(1):26-31.

35. Gönül M, Gül U, Cakmak S, Kilinç C, Kilinç S. Prolactin levels in the patients with alopecia areata. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2009;23(11):1343-4.

36. Back SH, Yoon JB, Sim WY, Haw CR. Effects of vaseular endothelial growth factors on hair growth in vitro. Korean J Dermatol. 1999;37(1):23-30.