Exploring Chemical Analysis
Fourth Edition
Chapter 19:
Spectrophotometry:
Instruments and Applications
Copyright © 2005 by W. H. Freeman & Company
Daniel C. Harris
19장 분광광도법 : 기기 및 응용
19-2 혼합물의 분석
• 혼합물의 흡광도
[X] [Y] [Z]
A ε X b ε Y b ε Z b
그 림 19-12 Ti(IV) (1.32 mM), V(V) (1.89 mM) 및 두 이온이 함 유된 미지 혼합물의 과산화수소 착물에 대한 가시선 스펙트럼.
통로길이가 1 cm인 흡수용기 속 에 있는 모든 용액은 0.5 wt%
H2O2와 ~0.01 M H2SO4를 함유 하고 있다.
)
"
( [Y]
[X]
A"
) '
( [Y]
[X]
A'
"
Y
"
X
' Y '
X
에서 에서
ε b ε b
ε b ε b
등 흡수점 (isosbestic point)
• 등흡수점 (isosbestic point)
– 두 화학종의 몰 흡광계수가 같은 파장
– 단지 두 개의 주요 화학종이 존재한다는 증거
그림 19-13 pH 함수로서 pH 4.5와 pH 71. 사이에 서 나타낸 3.7×10-4 M 메 틸 레드의 흡수 스펙트럼
• 메틸레드의 등흡수점
– 같은 농도의 Hin과 In-는 465 nm에서 교차
) ]
[In [HIn]
( A
] [In [HIn]
] In [ ]
HIn [
A
[HIn]
] log [In
p pH
In H
HIn
465
465
465 In 465
HIn 465
465 In 465
HIn
- a
일정
일정
b
b b
K
19-3 분광광도 적정
• 분광광도적정 (spectrophotometric titration)
– 종말점을 검출하기 위해 빛의 흡수 또는 방출 을 이용
아포트랜스페린 + 2Fe3+ = (Fe3+
)
2트랜스페린
그림 19-15 나이트릴로트라이아세트산 철(III)에 의한 아포트랜스페린의 분광광 도 적정. 흡광도는 묽힘을 고려하여 보정 되어야 한다. 철을 가하기 전 용액의 초 기 흡광도는 색깔을 띠는 불순물에 의한 것이다.
Fe3+ 은 중성용액에서 Fe(OH)3로 침전되기 때문에 나이트 릴로트라이아세트산염을 사용한다. Fe3+은 나이트릴로트 라이아세트산염은 4개의 O와 N원자를 통해 Fe3+와 결합 한다.
대표적인 광도법 적정 곡선. 분석물(A), 생성물(P), 적정시약(T).
분석물 A + 적정액 T → 생성물 P
19-4 분자가 빛을 흡수하면 어떤 변화가 일 어날 것인가?
• 바닥상태 + 빛 → 들뜬상태
• 들뜬상태 → 바닥상태 + 빛 (또는 열)
분자 + 빛 → 들뜬 전자/들뜬 진동/들뜬 회전 상태
폼알데하이드의 전자상태
• C-H : σ 결합
• C=O : σ 결합, π 결합
• 바닥상태 : 평면구조
• 들뜬상태 : 피라미드구조
– C-O 결합의 약화
– C-O 결합의 길이 증가 – 결합각 감소
그림 19-16 바닥상태 (S0)와 최저 들뜬 단일항 (S1)에 있는 폼알데하 이드의 기하구조
그림 19-17 에너지 준위와 궤 도함수 모형을 나타낸 폼알데 하이드의 분자 궤도함수. 세 개의 σ 결합과 1개의 n 결합 은 완전히 겹쳐있다 (σ1~ σ4).
• 폼알데하이드의 전자 전이
– 가능한 전이 : S1, T1 – n → π*(T1) : 397 nm – n → π*(S1) : 355 nm – 에너지 : S1>T1
폼알데하이드의 진동 및 회전 상태
• 적외선 : 진동 운동 변화
• 마이크로파 : 회전 운동 변화
• 진동에너지 > 회 전에너지
그림 19-19 폼알데하이드의 여섯 가지 진동형태. 운동을 일으키는 데 요구되는 적외선의 파수는 cm-1로 나타낸다.
복합된 전자, 진동 및 회전전이
• 분자 + 빛 (>전자전이에 필요한 에너지)
– 전자전이 + 진동전이 + 회전전이
• 폼알데하이드 + hv
– 전자전이 : S0 → S1 전자상태
– 진동전이 : S0 바닥진동상태 → S1 들뜬진동상태 – 회전전이 : S0 회전상태 → S1 회전상태
• 넓은 흡수 띠
그림 18-9 0.915 ppm의 질소를 함 유한 아질산 이온 표준용액으로 출 발한 반응 18-7의적자색 생성물의 스펙트럼
그림 20-14 HNO3에 녹인 청동의 원자 흡수 스펙트럼
분자흡수 스펙트럼
원자흡수 스펙트럼
흡수된 에너지는 어떻게 될까?
• S
0+ hv → S
1들뜬 진동 및 회전준위 → ?
• 진동이완 (vibrational relaxation)
– S1 의 최저 진동준위로 이동(R1) – 에너지는 열로 전환
그림 19-20. 분자가 자외선 또는 가시선 광자를 흡수한 다음 일으킬 수 있는 물리적 과정. S0는 분자의 바닥상태 이고, S1과 T1은 각각 최저 들뜬 단일항 및 삼중항 상태 이다. 직선화살표는 광자가 관련된 과정을, 구부러진 화 살표는 비복사전이를 나타낸다. R은 진동이완이다.
• 내부전환 (internal conversion)
– S1과 에너지가 같은 S0 (높은 진동상태)로 이동 – 바닥진동상태로 전이 (R2)
– 에너지는 인접 분자로 이동
• 흡수 → R
1→ 내부전환 → R
2: 흡수된 hv는 열로 전환
그림 19-20. 분자가 자외선 또는 가시선 광자를 흡수한 다음 일으킬 수 있는 물리 적 과정. S0는 분자의 바닥상태이고, S1과 T1은 각각 최저 들뜬 단일항 및 삼중항 상 태이다. 직선화살표는 광자가 관련된 과 정을, 구부러진 화살표는 비복사전이를 나타낸다. R은 진동이완이다.
• 계간전이 (intersystem crossing)
– S1 → T1의 들뜬 진동준위
– R3 이완 → T1의 최저진동준위 – 계간전이 : T1 → S0
– R4 이완
그림 19-20. 분자가 자외선 또는 가시선 광자를 흡수한 다음 일으킬 수 있는 물리 적 과정. S0는 분자의 바닥 상태이고, S1과 T1은 각각 최저 들뜬 단일항 및 삼중 항 상태이다. 직선화살표는 광자가 관련된 과정을, 구부 러진 화살표는 비복사전이 를 나타낸다. R은 진동이완 이다.
그림 19-20. 분자가 자외선 또는 가시선 광자를 흡수한 다음 일으킬 수 있는 물리적 과정. S0는 분자의 바닥상태이고, S1과 T1은 각각 최저 들뜬 단일항 및 삼중항 상태이다. 직선화살표는 광자가 관련된 과정을, 구부러진 화살표는 비복사전이를 나타낸다. R은 진동이완이다.
internal conversion
intersystem crossing
• 형광과 인광
– 형광 (F) : S1 → S0전이 – 인광 (P) : T1 → S0 전이 – λ : 형광 < 인광
– 수명 : 인광(10-4~10-2 초)>형광(10-8~10-4 초)
• 흡수와 형광
– 에너지 : 흡수 > 형광 – 거울상
그림 19-21 안트라센의 스펙트럼은 대표적인 흡 수와 형광의 근사적인 거울상의 관계를 보여준 다. 형광스펙트럼은 흡수 보다 낮은 에너지에서 나타난다.
• 거울상?
그림 19-22. 흡수 및 방출 스 펙트럼을 나타내는 구조와 스 펙트럼이 서로 근사적인 거울 상이 되는 까닭을 보여주는 에 너지 준위 그림. 흡수에 있어 서 파장 λ0는 최저에너지에서 그리고 λ+5 는 최고에너지에서 나타난다. 방출에 있어서 λ0 는 최고에너지이고 λ-5 는 최저에 너지이다.
• 광화학 (photochemistry)
– 빛의 흡수에 의해 일어나는 화학반응
• 발광 (luminescence)
– 광발광 (photoluminescence) : 형광, 인광 – 화학발광 (chemiluminescence)
• 화학반응 → hv 방출 (야광봉)
19-5 분석화학에서의 발광
• 발광 (luminescence)
– 형광, 인광 등
– 광원 시료 검출기 : 900
• 산란 복사선에 의한 방해 최소화
– 흡수보다 예민
• 촛불 : 50,000-500 vs. 0+500 ?
• 흡수 : -log(P/P0), 상대적
• 형광 : I = kPoC, 농도에 비례
• 단일 분자에서의 방출을 검출
그림 19-23. 발광 실험의 개략적 모형도. 시료는 단일 파장의 빛에 의해 조사되고 방출은 여러 파장 범위에 걸쳐 관찰된다. 방출 단색 화 장치는 방출스펙트럼을 측정하기 위해 동시에 한가지 단일 방 출 파장만을 선택한다.
4
셀레늄의 형광분석
• Se
– 생명에 필수적인 미량원소
– Glutathion peroxidase : Se을 함유한 효소, 세 포에 유해한 ROOH의 파괴를 촉진
– 높은 농도의 Se은 유독
• Se의 형광분석
그림 19-25. 셀레늄을 함유 한 생성물의 형광 검량선.
곡선과 최대점은 자체흡수 에 기인한 것이다.
• 자체흡수 (self-absorption)
– 인접한 분자가 형광을 흡수
– 농도 증가 → 자체형광흡수 증가 → 비선형 검 량선
• Quench : 자체형광흡수로 방출이 감소
그림 19-26. 효소결합면역흡착제 분 석법. 대상 분석물질과 특성적으로 반응하는 항체1은 고분자성 지지체 에 결합되어 있으며 이것을 미지시료 로 처리한다. 과량의 결합되지 않은 분자들을 씻어버린 후 나머지 분석물 질은 항체1에 결합되어 있다. 그 다음 결합된 분석물질은 항체2로 처리하 는데 이것은 분석물질에 있는 다른 자리를 인식한다. 효소가 항체2에 공 유결합한다.
효소결합면역흡착제 분석법 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
그림 19-27. 항체2에 결합된 효소는 (a)색깔을 띠거나 (b)형광성 생성 물을 형성하는 반응에서 촉매로 작용한다. 면역분석법에서 결합된 각 각의 분석물질 분자들은 쉽게 측정할 수 있는 여러 개의 색깔을 띤 분 자나 형광성 생성물을 형성한다.