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2010年 2月 碩士學位 論文
Baci l l ussubt i l i sMJP1이
생산하는 항세균 물질의 분리․정제 및 특성규명
朝 鮮 大 學 校 大 學 院
食 品 營 養 學 科
Baci l l ussubt i l i sMJP1이
생산하는 항세균 물질의 분리․정제 및 특성규명
Pur i f i cat i on andChar act er i zat i on ofAnt i bact er i alcompoundpr oducedby
Baci l l ussubt i l i sMJ P1
2010年 2月 25日
朝 鮮 大 學 校 大 學 院
Baci l l ussubt i l i sMJP1이
생산하는 항세균 물질의 분리․정제 및 특성규명
指 導 敎 授 張 海 春
이 論文을 理學碩士學位申請 論文으로 提出함.
2009年 10月
朝 鮮 大 學 校 大 學 院
食 品 營 養 學 科
任 殷 廷의 碩士學位論文을 認准함
委員長 조선대학교 교수 印
委 員 조선대학교 교수 印
委 員 조선대학교 교수 印
2009年 11月
목 차
ABSTRACT· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Ⅵ LI ST OF TABLE· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Ⅳ LI ST OF FI GURE· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Ⅴ
제 1장 서 론 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 7
제 2장 실험 재료 및 방법 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 11
1.항세균 활성 물질 생산 균주의 배양 ···11
2.항세균 활성 물질의 정제실험을 위한 전처리 ···11
(1)배양 상징액의 준비 ···11
(2)SolidPhaseExtraction(SPE)정제 ···11
3.항세균 활성 물질의 분리 및 정제 ···14
(1)IonExchangeChromatography(IEC)정제 ···14
(2)GelFiltrationChromatography(GFC)정제 ···16
(3)HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)analysis···16
4.항세균 활성 물질의 분석 ···18
(1)N-말단 아미노산 서열분석 ···18
(2)Liquid Chromatography(LC)를 이용한 Electrospray ionization tandem mass spectrometry(ESI-MS/MS)···18
(3) Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)를 이용한 Electrospray ionizationtandem massspectrometry(ESI-MS/MS)···18
5.정제 단계별 역가 ···21
(1)항균물질의 준비 ···21
(2)항균활성 측정방법 ···21
6.항균 spectrum 확인 ···22
(1)사용균주 ···22
(2)항균활성 측정 방법 ···22
7.안정성 확인 ···24
(1)pH 안정성 ···24
(2)열 안정성 ···24
(3)효소 안정성 ···24
8.최대 흡수 파장 확인 ···25
제 3장 결과 및 고찰 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 24
1.항세균 활성 물질의 분리 및 정제 ···26
(1)IonExchangeChromatography(IEC)정제 ···26
(2)GelFiltrationChromatography(GFC)정제 ···29
(3)HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)analysis···29
2.항세균 활성 물질의 분석 ···35
(1)N-말단 아미노산 서열분석 ···35
(2)Liquid Chromatography(LC)를 이용한 Electrospray ionization tandem mass spectrometry(ESI-MS/MS)···35
3.정제 단계별 항세균 활성 ···41
4.항균 spectrum ···43
5.항세균 물질의 안정성 ···45
(1)pH 안정성 ···45
(2)온도 안정성 ···45
(3)효소 안정성 ···48
6.항세균 활성 물질의 scanning···50
제 4장 결 론 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 52
제 5장 참고문헌 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 55
LI ST OF TABLE
Table 1. Buffer gradient condition of ion exchange chromatography(IEC) purificfation···15
Table 2.Solvent gradient condition of high performance liquid chromatography (HPLC)analysis···17
Table 3. Eluentgradientconditionofaminoacidanalysis···20
Table 4. Listofbacteriausedinthisstudy···23
Table 5. Amino acid composition of purified compound using gel filtration chromatography(GFC)···40
Table 6. Purificationofantibacterialcompoundfrom theculturesupernatant···42
Table 7.Inhibitory spectrum of purified antimicrobialcompound produced by B.subtilisMJP1···44
Table 8. Effect of pH treatment on the antimicrobial activity of purified antimicrobialcompoundproducedbyB.subtilisMJP1···46
LI ST OF FI GURE
Figure 1.Preparation of purified antibacterial compound from cell-free culture supernatantofB.subtilisMJPIusingsolidphaseextraction(SPE)···13 Figure 2. Elution profile of purified compounds using DEAE column of ion exchangechromatography(IEC)···27
Figure 3. Antibacterial and antifungal activity of partially purified using ion exchangechromatography(IEC)···28 Figure 4. Elution profile of purified compounds using once gel filtration chromatography(GFC)···30 Figure 5.Antibacterialactivity of purified compounds using once gelfiltration chromatography(GFC)···31 Figure 6. Elution profile of purified compounds using twice gel filtration chromatography(GFC)···32 Figure 7.Antibacterialactivity ofpurified compounds using twice gelfiltration chromatography(GFC)···31 Figure 8. Elution profile of purified compound using high performance liquid chromatography(HPLC)onC18column···34
Figure 9. Mass spectrum of purified antibacterial compound using ultra performanceliquidchromatography(UPLC)···37 Figure10.Detailofthetriply charged ion mass ofpeptideA(M.W .:3356.54 Da)···38 Figure 9. Detail of the triply charged ion mass of peptide B(M.W . :
3340.5244Da)···39
ABSTRACT
Pur i f i cat i on andChar act er i zat i on of Ant i bact er i alCompound
Pr oducedby Baci l l ussubt i l i sMJ P1
Yim,eunjung
Adviser:Prof.Chang,HaeChoon,Ph.D.
DepartmentofFoodandNutrition, GraduateSchoolofChosunUniversity
Antibacterialcompound produced by Bacillus subtilis MJP1 was purified.The cell-free culture supernatants from B.subtilis MJP1 were seperated using C18 Sep-Pak cartridge, ion exchange chromatography(IEC), and gel filtration chromatography(GFC). The purified antibacterial compound showed antibacterial activityagainstBacillussubtilisATCC 6633,ListeriamonocytogenesATCC 19113, Staphylococcus aureus subsp.aureus ATCC 29213,Enterococcus faecalis ATCC 29212.ThepurifiedantibacterialcompoundwasfoundtobestableinthepH range of3.0∼9.0,butitwas unstableatpH 10.0 Also,the antibacterialcompound was stableat50℃ for24h,andafterlipaseandα-amylasetreatment.Howeveritwas
제 1장 서 론
최근 식품 내 보존제와 같은 인공 첨가물의 사용이 소비자들의 건강악화에 미치는 영향에 대한 관심이 증가하는 추세이다.현대사회에서 사용되는 식품 보존제 및 사료 내 항생제,식물병원균 억제를 위한 농약은 대부분 자체독성으로 인하여 사용량이 제한되어 있고 이용범위가 좁을 뿐 아니라,소비자들이 기피하고 있는 실정임에도 불구하고 보다 효율적인 대체 방안이 없음으로 인해 지금까지 계속 사용되어지고 있다.이러한 화학적 합성 보존제 및 항생제 등은 여러 가지 산업에서 장기간 사용되어 왔으나 잔류성과 같은 공중 보건상의 위해 문제로 인해 계속 논란이 되어오고 있는 추세이다.이를 해결하기 위한 방법 중 하나가 미생물이 생산하는 항균물질을 이용하는 것이다.세균으로부터의 항균물질에 대한 연구는 1925년 E.coli가 생산한 colicin이 보고되면서부터 시작되어,그 후 Mattick가 유산균이 생산하는 nisin을 발견하면서부터 가속화되어왔다[31,43].
미생물은 다른 미생물들을 죽이거나 억제하는 다양한 항균성 물질들을 생산한다.
기존의 보고들에 의하면 세균이 생산하는 항균성 물질은 화학적 성질에 따라 크게 nonpeptideantibiotics와 peptideantibiotics로 분류된다.B.subtilis168이 생산한다고 보고되어지는 bacilysocin등은 nonpeptideantibiotics에 속하는 대표적 항균성 물질이라 할 수 있다[64].후자의 경우 생합성되어지는 경로에 따라 또 다시 2가지로 분류한다.
그 중 하나는 ribosome을 거치지 않고 생산된 큰 효소복합체 종류이며 이 경우는 단지 몇 개의 아미노산 잔기만을 포함할 뿐이다.비단백성 아미노산인 D-amino acid 또는 hydroxy amino acid 등을 함유하며,N-methlyation,acylation,다른 기능그룹과의 공유결합 등 광범위한 변형을 거쳐 생성된다[56,58].Surfactin[9],polymyxin[53], penicillin[66]등을 예로 들 수 있다.두 번째 peptideantibiotics종류로는 ribosome에서 합성되는 peptide로 bacteriocin이 있다.Ribosome에서 합성되는 peptide는 Gram 양성 균에 의해 만들어지고,post-translationalmodification과 단백질 가수분해과정을 겪으 며,일반적으로 20～60개의 amino acid으로 이루어져 있다.Bacteriocin은 식품산업 및 생물의학에 적용되고 있으며[6,11,51],잘 알려진 bacteriocin으로는 subtilin과 nisin이 있다[22].
Bacteriocin은 세균이 생산하는 항균성 peptide로써, bacteriocin like substance
생산하며 일반적으로 bacteriocin을 생산하는 미생물과 형태,계통학적으로 유사한 균종에 대해서 살균기작을 갖는 물질[37],또는 생산균주와 같거나 유사한 균종을 억제 하는 단백질 또는 단백질복합체라고 알려지고 있으나[63],bacteriocin생산균주와 가까운 근연관계의 미생물을 억제하는데서 그치지 않고 넓은 항균력을 가지는 경우도 있다고 보고되었다[2,25].Bacteriocin은 2차 대사산물인 기존의 항생제와는 다르게 자신의 유전자로부터 직접 생합성되므로 직접적인 유전자 조작 등에 의한 생물공학적 응용이 용이하고 그 결과 산업현장의 소요에 보다 다양하게 반응할 수 있다는 장점을 지니고 있다.뿐만 아니라 분자가 단백질로 이루어져 있으므로 인체에 경구로 섭취되었을 때 소화기관의 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해됨으로써 인체에 무독성이고 잔류성이 없다[63]는 측면에서 식품 등의 새로운 생물학적 보존제,식물병충해에 대한 무독성 농약 및 사료로써 그 효용이 크다.
보고된 바에 의하면 bacteriocin은 화학구조,열 안정성,분자량,효소 안정성,변형된 aminoacid의 존재,화학적 작용방식 등에 따라 4가지로 분류되고 있다[20,35].ClassＩ 은 thioether고리를 갖는 lanthionine과 β-methyllanthionine같은 아미노산을 포함하며 크기가 5 kDa 미만인 lantibiotics가 있다.ClassⅡ는 non-lantibiotics로,크기가 10 kDa미만으로 작고 열에 안정하며 membrane-activepeptide이다.많은 bacteriocin들이 이 경우에 해당하며 Listeria 속에 대한 억제활성을 지니고,N-말단의 아미노산이
‘Tyr-Gly-Asn-Gly-Xaa-Cys’의 서열을 가지고 있다.또한 2개 이상의 peptide에 의해 활성을 나타내고,thiol-actived peptide이며,20여 개의 아미노산이 membrane helix 복합체를 구성하는 특징들이 알려져 있다.ClassⅢ는 크기가 30kDa이상인 크고 열에 불안정한 단백질이다.ClassⅣ는 bacteriocin에 지질,탄수화물과 같은 다른 화학적 일부가 결합한 단백질 복합체이다[15,34,41,52,70].
Bacillus속은 Gram 양성,간균,호기성이며 아포를 형성한다고 알려져 있는 산업적 으로 중요한 균주 중 하나로서,다양한 효소와 항생물질을 다량 분비한다고 알려져있다 [65].현재 Bacillus속으로부터 생산되는 상업적 생산품으로는 효소,항생제,아미노산,
의약산업에서의 사용에 있어 안전한 GRAS 미생물로 인정받았기 때문이다[55]. Bacillussubtilis는 Bacillus 속의 대표적 균주로써 흔히 ‘고초균’이라고 한다.주로 토양에 서식하며 비병원성인 Gram 양성의 아포 형성 균이다.호기성이며 주모성 편모를 가지고 운동을 한다.Bacillus속이 생산하는 항균물질로는 B.thuriginensis가 생산하는 tochicin[49], thuricin 7[12],thuricin 439[1], entomocin 9[13], B. licheniformis가 생산하는 bacillocin 490[42], B. megaterium 의 megacin[68],B.coagulans가 생산하는 colagulin[29],B.cereus의 cerein 7A[47], cerein 7B[47],B.polyfermenticus가 생산하는 polyfermenticin SCD[36]등이 있다,또한 Bacillussubtilis는 약 66종의 항생물질을 분비하는데,Bacillussubtilis가 생산하는 항균물질로는 subtilin[32],subtilosin[3],ericin A[61],ericin S[61]등이 대표적이다.
미생물이 생산하는 bacteriocin 중에서 유산균이 생산하는 nisin이 가장 많이 연구 되었다.nisin은 가장 잘 알려진 bacteriocin으로 GRAS로 승인받은 이후 현재 40개 이상의 국가에서 식품에 사용이 허가되어졌으며,우리나라에서도 식품 첨가물로 인정 되고,pediocin과 함께 유제품의 Listeria monocytogenes를 억제한다고 알려져 있다 [14,46].최근 수십년 동안 유산균으로부터 생산된 bacteriocin은 식품산업에서의 가능성 때문에 다양한 연구가 이루어지고 있는 실정이며 bacteriocin 외에도 유기산, acetaldehyde,hydrogenperoxide,diacetyl등에 대한 연구가 활발하게 시행되었던 것에 반하여 Bacillus속에 대한 연구는 조금 부족한 실정이다[17,33,51].유산균이 생산하는 bacteriocin은 대체로 Gram 양성균을 억제하고,곰팡이 및 효모에 대해서는 항균력이 거의 없으며,높은 pH에서는 안정성이 뛰어나지 못하여 역가가 소실된다는 보고가 있다[19].이에 반하여 Bacillus속이 생산하는 bacteriocin은 넓은 범위에서 항균력 및 pH 안정성 등이 입증되었다[31,63].
그러므로 유산균과 더불어 GRAS 미생물인 Bacillus속이 생산하는 bacteriocin을 이용한 천연 식품 보존제,식물의 무독성 농약,가축 사료 첨가제등을 지속적으로 연구 및 개발하여 현대사회에서 부각되어지고 있는 합성 보존제 및 첨가물에 대한 안정성 문제를 감소시켜야 할 것이다.
우리나라의 경우 전통발효식품이 풍부하여 새로운 식품유래 bacteriocin을 개발하는 데 좋은 조건을 지니고 있다.이러한 조건을 바탕으로 인체에 무해하며 광범위한 항균
따라서 본 연구에서는 이미 우리나라 전통식품인 재래식 메주에서 분리되어 넓은 항세균 활성 및 항진균 활성이 입증된 Bacillus subtilis MJP1을 이용하여[72], BacillussubtilisMJP1이 생산하는 항균 물질 중 항세균 물질을 분리 및 정제하고, 정제된 항세균 물질을 규명하고 특성을 알아보고자 한다.
제 2장 실험 재료 및 방법
1.항세균 활성 물질 생산 균주의 배양
본 실험에서는 항세균 활성을 지닌 물질의 생산을 위하여 메주에서 분리된 Bacillus subtilisMJP1을 다음의 방법과 같이 배양하였다.균주를 5mlLB 배지(Luria-Bertani media)(1% bacto-tryptone,0.5% yeastextract,1% sodium chloride)에 접종하여 37℃
에서 24시간동안 전배양시킨 후,100mlLB 배지에 1%(v/v)의 전배양액을 접종하여, 다시 37℃에서 24시간동안 본배양하였다.
2.항세균 활성 물질의 정제실험을 위한 전처리
( 1)배양 상징액의 준비
항세균 활성 물질의 정제 및 분리를 위하여 BacillussubtilisMJP1을 상기된 방법으로 배양하였다.본배양액을 4℃에서 원심분리(9,500×g,15min)하여 얻은 상징액을 0.22μm membranefilter(Advantec,ToyoRoshiKaisha,Japan)로 제균하여 실험에 사용할 배양 상징액을 획득하였다.
( 2)Sol i dPhaseExt r act i on( SPE)정제
항세균 물질의 정제를 위한 전처리 단계로 SPE 정제를 시행하였다(Fig.1).상기된 방법에 따라 얻어진 Bacillus subtilis MJP1의 배양상징액을 소수성 column인 C18 Sep-Pakcartridge(WatersCo.,Boston,MA,U.S.A.)를 사용하여 부분정제를 시행하였다.
C18 Sep-Pak cartridge는 methanol50 ml를 통과시켜 활성화시킨 후에 3차 증류수 50ml를 흘려 준비하였다.준비된 Sep-Pakcartridge에 BacillussubtilisMJP1의 배양
methanol(HPLC-grade,FisherScientific.FairLawn,NJ,U.S.A.)5ml를 사용하여 용출하였다.유기용매인 methanol에 녹아있는 시료를 speed vac(Centra-VacVS-802, Vision,Bucheon,Korea)을 이용하여 유기용매를 제거하였다.
ActivatedwithMethanol50ml
WashedwithSterileWater50ml
RemovedMethanol usingbySpeedvac FlowedwithCell-free CultureSupernatant200ml WashedwithSterileWater50ml
ElutedwithMethanol5ml
Figure 1. Preparation of purified antibacterial compound from cell-free culturesupernatantofB.subtilisMJPIusing solidphaseextraction(SPE).
3.항세균 활성 물질의 분리 및 정제
( 1)I onExchangeChr omat ogr aphy( I EC)정제
SPE를 시행하여 획득한 전처리 시료를 FPLC(FastProteinLiquidChromatography) system(AKTA Prime plus,GE healthcare Bio-sciences,AB,Uppsala,Sweden)을 이용하여 정제하였다.용매를 휘발시켜 제거한 SPE 전처리 시료를 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.5)에 녹인 후 Bradford 방법[8]으로 protein assay regent(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,U.S.A)를 이용하여 정량하였다.SPE 전처리 시료는 0.45 μm syringe filter(Advantec)로 여과하여 IEC의 시료로 사용하였다.항세균 물질을 분리하기 위한 정제조건은 다음과 같다.IEC에 사용된 column은 HiPrepTM 16/10 DEAE FF(GE healthcareBio-sciences)column을 사용하였다.완충액으로는 20 mM Tris-HCl완충액(pH 8.5)을 사용하였으며,동일 완충액에 0M～1M NaCl로 기울기를 주어 column에 흡착된 항세균 활성 물질을 용출하였다.DEAE FF column에 4 ml/min의 유속으로 100 ml의 20 mM Tris-HCl완충액(pH 8.5)을 흘려 평형화시킨 후 4.35mg/ml의 농도로 2ml의 SPE 전처리 시료를 loading 한 뒤 80ml의 완충액 으로 column을 washing하고 column에 결합된 물질들을 동일 완충액 260ml에 0M～
0.65M NaCl의 기울기를 주어 용출시켰다(Table1).Column을 통과한 분획들은 5ml씩 fraction collector를 이용하여 획득되었고 A280에서 측정된 흡광도 값에 따라 크게 5구간으로 나누었다. 각 구간을 M.W.<1000인 dialysis membrane(Spectra/PorⓇ, Spectrum Laboratories,Inc.,RanchoDominguez,CA,U.S.A)을 사용하여 투석시켰다.
투석시킨 구간은 각각 동결건조하여 20mM Tris-HCl완충액(pH 8.5)에 녹여 항균활성을 확인한 후 다음 정제 실험의 시료로 준비하였다.
Purification process
Volume (ml)
A buffer(%) 20 mM Tris-HCl
(pH 8.5)
B buffer(%)
20 mM Tris-HCl +1M NaCl (pH 8.5)
Equilibration 100 100 0
Sample inject 102 100 0
Wash(A buffer) 182 100 0
Elute 342 35 65
Wash(B buffer) 442 0 100
Re-equilibration 542 100 0
Table 1. Buffer gradient condition of ion exchange chromatohraphy (IEC)purificfation
( 2)GelFi l t r at i on Chr omat ogr aphy( GFC)정제
상기된 방법으로 IEC를 시행하여 항균활성이 있는 구간을 획득하고 투석하여 1차 GFC 시료를 준비하였다.FPLC system의 GFC 조건은 다음과 같다.장비는 AKTA Prime plus를 사용하였으며, column은 Hi PrepTM 16/60 SephacrylTM S-100(GE healthcareBio-sciences)column을 사용하였다.완충액으로는 20mM Tris-HCl,0.15M NaCl완충액(pH 8.5)을 사용하였다.120ml의 완충액으로 평형화시킨 column에 IEC를 시행하여 준비된 시료를 Bradford방법을 사용하여 정량하고 0.36 mg/ml의 농도로 2ml를 0.5ml/min의 유속을 적용하여 loading하였다.동일 완충액(180ml)을 사용하여 column을 통과시킨 분획들은 5 ml씩 fraction collector를 이용하여 획득되었고, M.W.<1000인 dialysismembrane을 사용하여 투석시켰다.투석시킨 분획은 각각 동결 건조하여 20mM Tris-HCl완충액(pH 8.5)에 녹여 항균활성을 확인하였다.항균활성 이 확인된 분획은 정제도를 높이고자 동일한 방법으로 2차 GFC를 시행하였다.
( 3)Hi ghPer f omanceLi qui d Chr omat ogr aphy( HPLC)anal ysi s
2회의 GFC 시행으로 정제된 항세균 물질을 HPLC system(Younglin AcmeHPLC, Younglin Co.,Anyang,Korea)을 이용하여 단일물질로 분리 및 정제가 되었는지를 확인하고자 하였다.Column은 Luna5μlC18(250× 4.60mm,Phenomenex,Torrance, CA,U.S.A.)column을 사용하였고,5μg의 GFC로 정제된 항세균 물질을 20μl의 5%
acetonitrile에 녹여 주입하였다.용매는 5% acetonitrile(HPLC-grade,FisherScientific) 과 100% acetonitrile을 용매로 사용하여 유속은 0.5 ml/min 조건으로 시행하였다.
HPLC 시행 시 사용한 용매의 조건은 Table2와 같다.
Time (min)
A solvent(%) 5% ACN
B solvent(%) 100% ACN
20 100 0
30 65 35
60 32 68
70 0 100
80 0 100
90 100 0
100 100 0
Table 2. Solvent gradient condition of high performance liquid chromatography(HPLC)analysis
*ACN :acetonitrile
4.항세균 활성 물질의 분석
( 1)N-말단 아미노산 서열분석
IEC를 시행하여 획득된 시료를 규명하기 위하여 N-말단 아미노산 서열분석을 시행 하였다.IEC를 시행하여 획득된 시료를 tricine-SDS-PAGE[54]로 정제 상태를 확인 하였다.Gel상에서 하나의 band가 있음을 확인한 후 IEC를 시행하여 획득된 시료를 Prosorb samplepreparation cartridge(Applied Biosystems,Fostercity,CA,U.S.A.)를 사용하여 탈염시키고 N-말단 아미노산 서열분석의 시료로 사용하였다.분석기기로는 Pricise 491 HT protein sequencer(Applied Biosystems)를,column은 PTH analysis column(2.1 × 220 mm, Applied Biosystems)을 사용하였으며, 용매 A는 3.5%
tetrahydrofurane(THF),B는 12% isopropanol이 함유된 acetonitrile을 사용하였다.
( 2) Li qui d Chr omat ogr aphy( LC) 를 이용한 El ect r ospr ay i oni zat i on t andem massspect r omet r y( ESI -MS/ MS)
IEC로 정제한 항세균 물질을 LC-ESI-MS/MS를 이용하여 단백질 내부서열을 확인하고 자 하였다.준비된 시료를 trypsin을 처리하여 생성된 peptide fragment를 다음의 장비를 이용하여 분석하였다.장비는 Hybrid mass spectrometersystem(Q-TOFⅡ,Manchester, England),column은 AQUA 5μ C18 125Å(Phenomenex,Torrance,CA,U.S.A.)를 사용 하였다.A 용매는 0.5% acetic acid,0.02% formic acid,B 용매는 0.5% aceticacid, 0.02% formicacid가 포함된 80% acetonitrile을 사용하여 분석하였다.
( 3) Ul t r a Per f or mance Li qui d Chr omat ogr aphy( UPLC) 를 이용한
Waters)을,A 용매로는 0.1% formicacid가 포함된 10% acetonitrile,B 용매로는 0.1%
formicacid가 포함된 90% acetonitrile을 사용하여 UPLC를 이용하여 분석하였다.
( 4)아미노산 조성분석
GFC로 정제한 물질의 아미노산 조성을 알아보기 위하여 다음과 같은 조건에서 아미노산 조성분석을 시행하였다.밀폐된 조건에서 시료에 6N HCl을 첨가하고 질소를 채워 digestion 시킨 후 아미노산 분석기로 분석하였다. 분석기기는 Amino acid analyzer(Waters2690, Waters 747, Waters), column은 AccQ-Tag column(3.9 × 150mm,Waters)를 사용 하였다.용리액 A는 50% phosphoricacid를 사용하여 pH 5.7 로 조정한 100mM NaAC,5.6mM triethylamine용액,용리액 B는 50% phosphoricacid 를 사용하여 pH 6.8로 조정한 100 mM NaAC,5.6 mM triethylamine 용액,용리액 C는 100% acetonitrile,용리액 D는 3차 증류수를 사용하였다.기울기 조건은 Table3과 같이 시행하였다.
Time (min)
Flow rate (ml/min)
AEluent (%)
BEluent (%)
CEluent (%)
DEluent (%) 0.00 1.00 90.0 10.0 0.0 0.0 0.50 1.00 89.0 10.0 1.0 0.0 17.00 1.00 88.0 10.0 2.0 0.0 24.00 1.00 86.0 9.0 5.0 0.0 32.00 1.00 63.0 25.0 12 0.0 33.5 1.00 0.0 87.5 12.5 0.0 33.8 1.30 0.0 87.5 12.5 0.0 37.00 1.30 0.0 87.0 13.0 0.0 48.00 1.30 0.0 87.0 13.0 0.0 48.10 1.30 0.0 0.0 60.0 40.0 51.00 1.00 90.0 10.0 0.0 0.0 65.00 1.00 90.0 10.0 0.0 0.0 Table3.Eluentgradientconditionofaminoacidanalysis
5.정제 단계별 역가
( 1)항균물질의 준비
본 실험에 사용한 정제단계별 항균물질은 다음의 방법과 같이 준비하였다.배양상징액 은 항세균 활성물질 생산균주를 상기된 항세균 활성 물질의 정제 실험을 위한 전처리 방법에 의하여 배양,원심분리 및 제균하여 실험에 사용할 배양상징액을 획득한 뒤 동결건조하고 20 mM Tris-HCl완충액(pH 7.5)에 녹여 5배 농축하여 사용하였다.
SPE 정제물은 상기된 항세균 활성 물질의 정제 실험을 위한 전처리 방법에 의하여 획득한 뒤,유기용매를 제거하고 20mM Tris-HCl완충액(pH 7.5)에 녹여 사용하였다.
IEC 및 GFC 1,2차 정제물은 상기된 항세균 활성 물질의 분리 및 정제 방법에 의하여 획득한 뒤 투석,동결건조시킨 후 20mM Tris-HCl완충액(pH 7.5)에 녹여 항균활성 측정에 사용하였다.
( 2)항균활성 측정방법
정제 단계별 항세균 활성은 spot-on-the-lawn test[28]방법에 의하여 다음과 같이 시행하였다.지시균으로 사용한 BacillussubtilisATCC 6633을 도말한 LB 고체배지에 단계별 정제물을 순차적으로 희석하여 각각 10 μl씩 spotting한 후,37℃에서 하룻밤 배양하여 활성을 측정하였다.항세균 활성 역가는 단계별 정제물을 순차적으로 2배씩 희석하여 지시균주에 대해 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역을 취하고,이 값에 1ml에 해당하도록 환산해주는 환산계수를 곱하여 AU/ml로 나타내었다.
6.항균 spect r um 확인
( 1)사용균주
본 항균활성의 실험에서 사용한 세균은 Table4에 정리하였다.
지시균으로 사용한 공시균주 및 유해균주는 다음과 같이 준비하였다. Bacillus subtilisATCC 6633,MicrococcuslutesATCC 13513,StreptococcusmutansATCC 25175,Staphylococcus aureus subsp.aureus ATCC 29213,Enterococcus faecalis ATCC 29212,EscherichiacoliATCC 25922,EscherichiacoliO157:H7ATCC 43895, Pseudomonasaeruginosa ATCC 27853,Salmonella enteiaca serovar.TyphiATCC 19430은 LB 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다.Listeria monocytogenes ATCC 19113은 BHI(brain heartinfusion,Difco Laboratoreis,Franklin Lakes,NJ U.S.A.)배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양한 뒤 고체배지에 Glassbead(4 mm, Isolab,Wertheim,Germany)를 이용하여 도말하였다.
( 2)항균활성 측정 방법
지시균주에 대한 항균 spectrum은 다음과 같은 방법으로 측정하였다.상기 방법에 따라 지시균주를 도말한 해당 고체배지에 GFC 2차 정제물 10μl를 spot-on-the-lawn test방법에 의하여 spotting 한 뒤 저해환을 형성하는 최대 희석배수 및 1ml에 해당 하는 환산계수를 고려하여 AU/ml를 계산하였다.
Table4.Listofbacteriausedin thisstudy
Microorganism strains Mediuma Incubation
temprature Reference
Gram-positive bacteria
Bacillus subtilis ATCC 6633 LB 37℃ [69]
Listeria monocytogenes ATCC 19113 BHI 37℃ [57]
Staphylococcus aureus subsp. aureus
ATCC 29213 LB 37℃ [24]
Enterococcus faecalis ATCC 29212 LB 37℃ [4]
Micrococcus lutes ATCC 13513 LB 37℃ [39]
Streptococcus mutans ATCC 25175 LB 37℃ [16]
Gram-negative bacteria
Escherichia coli ATCC 25922 LB 37℃ [7]
Escherichia coli O157:H7 ATCC
43895 LB 37℃ [62]
Psuedomonas aeruginosa ATCC
27853 LB 37℃ [44]
Salmonella enteiaca serovar. Typhi
ATCC 19430 LB 37℃ [60]
aLB,Luria-Bertanimedium;BHI,brainheartinfusionmedium.
7.안정성 확인
( 1)pH 안정성
항균물질의 활성이 pH에 의하여 변화되는지를 알아보기 위하여 pH 3.0(50 mM glycine-HCl),pH 4.0(50 mM sodium acetate),pH 5.0(50 mM sodium acetate),pH 6.0(50mM sodium citrate),pH 7.0(50mM Tris-HCl),pH 8.0(50mM Tris-HCl),pH 9.0(50mM glycine-NaOH),pH 10.0(50mM glycine-NaOH)완충용액을 5N HCl과 5 N NaOH로 보정하여 만들었다.상기 방법에 따라 준비한 GFC 2차 정제물을 pH별 완충용액에 각각 용해시켜 37℃에서 2시간 동안 처리한 후 2배씩 순차적으로 희석하여 spot-on-thelawntest를 시행하고 그 활성을 측정하였다.
( 2)열 안정성
GFC 2차 정제물의 활성에 대한 온도의 영향을 알아보기 위하여 상기의 방법으로 준비한 GFC 2차 정제물을 4℃,30℃,50℃,70℃에서 24시간,100℃에서 30분,121℃에서 15분 동안 처리한 후 앞서 기록된 pH 안정성과 같은 방법으로 항균 활성을 측정하였다.
( 3)효소 안정성
GFC 2차 정제물의 활성에 대한 효소의 영향을 알아보기 위하여 다음과 같이 효소를 준비하였다. proteinase K(EC 3.4.32.64, Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.), protease(typeⅠ,Sigma),pronaseE(typeⅩⅣ,Sigma),trypsin(EC 3.4.21.4,Sigma), α-chymotrypsin(EC 3.4.21.1,Sigma)은 50 mM Tris-HCl,10 mM CaCl2완충액(pH
대신 20mM Tris-HCl완충액(pH 7.5)을 첨가하여 동일한 조건으로 처리한 후 활성을 비교하였다.
8.최대 흡수 파장 확인
GFC 2차 정제물의 최대 흡수 파장을 알아보기 위하여 wavescanning을 시행하였다.
UV spectrophotometer는 ultrospec2100pro(Amersham Biociences,Uppsala,Sweden) 을 사용하였고,준비된 정제물을 3차 증류수 1ml에 녹인 후 190nm부터 900nm의 범위 내에서 1nm 단위로 최대흡수파장을 측정하였다.
제 3장 결 과 및 고 찰
1.항세균 활성 물질의 분리 및 정제
( 1)I onExchangeChr omat ogr aphy( I EC)정제
BacillussubtilisMJP1이 생산하는 항세균 물질을 정제하기 위하여 Bacillussubtilis MJP1의 배양상징액을 SPE 정제하여 얻어진 전처리 시료를 IEC의 시료로 사용하였다.
DEAE column을 사용하여 anion exchangechromatography를 실시하였을 때 column 의 resin에 결합하지 않고 20 mM Tris-HCl에 의해 용출되어져 나온 2개의 peak와 resin에 결합한 뒤 0M～1M의 NaClgradient를 주어 용출시킨 3개의 peak을 얻을 수 있었다(Fig.2).이 다섯 개의 peak들을 각각 dialysis membrane을 사용하여 투석, 동결건조 후 항균활성을 확인한 결과 peak1과 peak4에서는 항세균 활성만 관찰되었고, peak 5에서는 항진균 활성만이 관찰되었다(Fig.3).항세균 활성이 확인된 2개의 구간 중에서 DEAE column의 resin에 결합하는 peak 4만을 투석,동결건조 후 다음 정제 실험의 시료로 준비하도록 하였다.
peak1 peak2
peak3 peak4
peak5
Figure 2.Elution profile ofpurified compounds using DEAE column ofion exchange chromatography(IEC).peak1 and 2,20 mM Tris-HCl(pH 8.5)buffer washed fraction;peak 3～5,20 mM Tris-HCl+ 1 M NaCl(pH 8.5)buffereluted fraction.
A B
1
2 3
4 5
1
2 3
4 5
BacillussubtilisATCC 6633 AspergilluspetrakiiPF-1
Figure3.Antibacterialand antifungalactivity ofpartially purified using ion exchange chromatography(IEC). A, antibacterial activity against B. subtilis ATCC 6633;B,antifungalactivity againstA.petrakiiPF-1.1,peak 1fraction of IEC chromatogram;2,peak 2fraction ofIEC chromatogram;3,peak 3fraction of IEC chromatogram;4,peak 4fraction ofIEC chromatogram;5,peak 5fraction of IEC chromatogram.
( 2)GelFi l t r at i on Chr omat ogr aphy( GFC)정제
IEC 정제를 시행하여 획득된 항세균 활성이 있는 peak 4구간을 투석 후 정량하여 1차 GFC 정제를 시행하였다(Fig.4).분자크기에 따라 SephacrylTM S-100 column을 통과한 시료는 A280에서 흡광도를 측정하였고,다시 2개의 구간(Ｉ,Ⅱ)으로 나누어 투석 한 뒤 순차적으로 희석하며 항세균 역가를 확인하였다.그 결과 column을 나중에 통과 한 Ⅱ구간에서만 역가가 확인되었고(Fig 5.),이 구간만을 모아 투석,동결건조하여 GFC 2차 정제를 시행하였다(Fig.6).GFC 2차 정제가 끝난 후 투석,동결건조하여 상기와 같이 순차적 희석하며 항세균 역가를 확인한 후(Fig.7)다음 정제 실험의 시료를 준비하였다.
( 3)Hi ghPer f omanceLi qui d Chr omat ogr aphy( HPLC)anal ysi s
2회의 GFC 시행으로 정제된 항세균 물질을 HPLC system을 시행하여 정제가 되었는지를 알아보고자 하였다.그 결과 하나의 peak가 관찰되었다(Fig.8).이 구간을 획득한 후 용매를 제거하여 항세균 물질의 특성규명을 위한 분석용 시료를 준비하였다.
peakⅠ
peakⅡ
Figure 4.Elution profile of purified compounds using once gel filtration chromatography(GFC).peakⅠ,fraction ofdetected on 177.80min;peak Ⅱ,fraction ofdetectedon202.60min.
1
2 1x 2-1x 2-2x 2-3x 1x 2-1x 2-2x 2-3x
Figure 5. Antibacterial activity of purified compounds using once gel filtration chromatography(GFC). 1, diluted peak Ⅰ fraction of GFC chromatogram;2,dilutedpeakⅡ fractionofGFC chromatogram.
Purified antibacterial compound
Figure 6.Elution profile of purified compounds using twice gelfiltration chromatography(GFC).
1x 2-1x 2-2x 1
Figure 7. Antibacterial activity of purified compounds using twice gel filtration chromatography(GFC). 1, diluted purified antibacterial compound fractionofGFC chromatogram.
Antibacterial compound
Figure8.Elution profileofpurified compound using high performanceliquid chromatography(HPLC)on C18column.
2.항세균 활성 물질의 분석
( 1)N-말단 아미노산 서열분석
IEC로 정제하여 획득된 시료를 tricine-SDS-PAGE를 한 후 N-말단 아미노산 서열 분석을 시도하였으나,N-말단이 blocking되어 아미노산 서열을 확인할 수 없었다.
Edman 방법은 시료가 혼합물이거나 N-말단이 blocking되어 있는 경우 불가능하다는 보고가 있다[74].N-말단이 blocking되는 이유로는 N-말단이 ‘Gln'인 경우 R group이 cyclize되어 pyrrolidone carboxylate화 되거나, acetyl(CH3-CO-NH-), formyl(H-CO-NH)과 같은 blocking group이 있는 경우, 그 외에도 N-trimethylalanine의 경우 Edman 반응을 방해하기 때문이라고 알려져 있다[10]. 또한 Edman sequencing 방법은 dehydro잔기와 같은 보기 드문 아미노산이 있는 경우 불가능하다고 알려지고 있으며,sublancin168[50]이 가진 thioetherring과 cerein 7B[48]가 가진 disulfide bridge 같은 분자 내 결합에 의해 방해된다고 보고되고 있다.이러한 경우 N-말단의 blocking group을 제거한 뒤 다시 분석하거나 N-말단의 분석을 포기하고 단백질 내부의 아미노산서열을 분석하는 방법 등이 있다[23,45,59].
( 2) Li qui d Chr omat ogr aphy( LC) 를 이용한 El ect r ospr ay i oni zat i on t andem massspect r omet r y( ESI -MS/ MS)
IEC로 정제한 항세균 물질의 N-말단 아미노산 서열분석을 확인할 수 없었기 때문에 LC-ESI-MS/MS를 사용하여 peptide fragment를 이용한 단백질 내부서열을 확인 하고자 하였으나 peak가 검출되지 않아 내부서열을 확인 할 수 없었다.
( 3) Ul t r a Per f or mance Li qui d Chr omat ogr aphy( UPLC) 를 이용한 El ect r ospr ay i oni zat i ont andem massspect r omet r y( ESI -MS/ MS)
2단계의 GFC를 시행하여 얻어진 단일 peak를 다시 HPLC를 시행하여 하나의 peak임을 확인했음에도 불구하고 이를 UPLC를 이용하여 ESI-MS/MS를 시행한 결과 두개의 분자량이 다른 peptide인 peptideA(M.W.:3356.54Da)와 peptideB(M.W.:3400.5244 Da)가 검출되었다(Fig.9-11).
두 peptide가 C18cartridge에서 흡착된 것으로 보아 모두 소수성이며,IEC의 DEAE column과 GFC의 SephacrylS-100 column에서 하나의 peak으로 검출된 것을 보아 매우 유사한 이온 세기 및 분자량을 지녔다고 생각할 수 있다.이로 인하여 상기된 정제방법에서 단일물질로 정제된 것처럼 보였을 것이라 추측할 수 있다.
( 4)아미노산 조성분석
GFC로 정제한 물질의 아미노산 조성을 알아보기 위하여 아미노산 조성을 분석한 결과는 Table5와 같았다.정제된 항세균 물질은 검출된 아미노산 중 glycine을 가장 많이 포함하였음을 알 수 있었으며,alanine,asparagine과 asparticacid.leucine등이 그 다음으로 많이 검출 되었다.
A B
Figure 9. Mass spectrum of purified antibacterial compound using ultra performanceliquidchromatography(UPLC).
[M+3H]3+=1134.18 M.W.3400.5244Da
Figure10.Detailofthetriply charged ion massofpeptideA(M.W.:3356.54 Da).
[M+3H]3+=1119.52 M.W.3356.54 Da
Figure 11. Detail of the triply charged ion mass of peptide B(M.W. : 3400.5244Da).
Table 5.Amino acid composition ofpurified compound using gelfiltration chromatography(GFC)
Amino acid Mole % Residues per molecule
Asx* 15.50 16
Glx* 3.70 4
Ser 3.14 3
Gly 23.94 24
His 0.00 0
Thr 2.66 3
Arg 0.00 0
Ala 16.12 16
Pro 8.64 9
Tyr 0.20 0
Val 4.28 4
Met 0.00 0
ILe 9.88 10
Leu 10.82 11
Phe 1.17 1
Cys ND** ND**
Lys ND** ND**
Trp ND** ND**
Total 100.05% 101
3.정제 단계별 항세균 활성
항균물질의 정제 단계별 역가를 알아보기 위하여 배양상징액,SPE 정제,IEC 정제, 1차 GFC 정제,2차 GFC 정제 단계별로 항균물질을 준비하여 감수성 균주인 Bacillus subtilisATCC 6633에 대한 역가를 spot-on-the-lawn test방법에 의하여 확인하였다 (Table6).그 결과 배양상징액은 기존에 보고된 BacillussubtilisMJP1의 배양상징액과 같은 조건에서 같은 specificactivity를 나타내었고[72],SPE 정제의 경우 기존에 보고된 specific activity보다 2배 높은 specific activity를 나타내었다.정제 단계가 진행됨에 따라 시료의 volume과 totalactivity 및 recovery는 점차 감소하고,specificactivity는 증가함이 관찰되었다.GFC 2차 정제의 경우 chromatogram은 1차 정제에 비해 정제도가 높아 보이지만 specificactivity을 비교하였을 때 차이가 없음을 알 수 있었다.
Purification step Volume (ml)
Specific activity (AU/ml)
Total activity (AU)
Recovery (%)
Supernatant 600.0 320 1.92×105 100
Sep-Pak 30.0 2,560 7.68×104 40
IEC 1.0 12,800 1.28×104 6.7
GFC
(first purification) 0.4 6,400 2.56×103 1.3 GFC
(second purification) 0.2 6,400 1.28×103 0.7 Table6.Purification ofantibacterialcompoundfrom theculturesupernatant.
*B.subtilisATCC 6633wasusedasasensitivestrain.
4.항균 spect r um
BacillussubtilisMJP1이 생산하는 항세균 물질의 GFC 2차 정제물의 활성을 Gram 양성균 6종과 Gram 음성균 4종을 대상으로 조사하였다.Spot-on-the-lawn test방법 에 의해 항세균 활성을 실험한 결과 Gram 양성균인 Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus subsp.aureus ATCC 29213,Enterococcus faecalis ATCC 29212,Listeria monocytogenes ATCC 19113 에 대해 항세균 활성이 관찰되었다.
실험에 사용된 Gram 양성균 중에서 Streptococcus mutans ATCC 25175, Micrococcus lutes ATCC 13513와 Gram 음성균인 Escherichia coliATCC 25922, Escherichia coliO157:H7 ATCC 43895,Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonellaenteiacaserovar.TyphiATCC 19430에 대해서는 활성이 관찰되지 않았다 (Table.7).Bacillusthurigiensis가 생산하는 bacteriocin인 tochicin의 경우 동종에게만 저해 활성을 나타낸다고 보고되고 있으며[49],B.cereus가 생산하는 cerein7[47]과 B.subtilis가 생산하는 subtilin[32],subtilosin A[3]의 경우 Gram 양성균에서 활성을 보였다고 보고되었다.이 외에도 Bacillus속이 생산하는 thuricin7[12],entomocidus9[13] 등은 Listeria monocytogenes,Streptococcuspyogenes,Pseudomonas aeruginosa와 같은 병원 미생물을 억제한다는 보고들이 있다.이로써 BacillussubtilisMJP1이 생산 하는 항세균 물질이 bacteriocin이 생산균주와 유사한 계통의 세균을 저해한다고 정의 된 것에 비하여 보다 넓은 항균범위를 지니고 있음을 추측할 수 있다.기존에 보고된 BacillussubtilisMJP1 배양상징액의 항균 spectrum 실험과 비교했을 때[72]실험에 사용된 세균 중 BacillussubtilisATCC 6633,Staphylococcusaureussubsp.aureus ATCC 29213,Enterococcus faecalis ATCC 29212,Listeria monocytogenes ATCC 19113에만 활성이 있는 것과 그 외의 Gram 양성균 및 Gram 음성균에 대해서는 활성 이 없다는 점이 일치하였다. 저해 활성이 나타난 지시균 중에서 Listeria monocytogenesATCC 19113에 가장 강한 활성을 보이는 것은 bacteriocin의 특징 중 Listeria속에 강한 저해활성을 지니는 classⅡa군 의 특성과 유사하다고 볼 수 있다.
이와 같이 항균 spectrum 실험결과 BacillussubtilisMJP1이 생산하는 항세균 물질의 GFC 2차 정제물은 배양상징액과 억제하는 지시균주가 일치하였으며,기존에 보고된 bacteriocin의 특성과도 유사한 부분을 찾을 수 있었다.
Microorganism Indicator species Antimicrobial activity (AU/ml)
Gram-positive bacteria
Bacillus subtilis ATCC 6633 6,400
Listeria monocytogenes ATCC 19113 12,800
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC
29213 3,200
Enterococcus faecalis ATCC 29212 3,200
Micrococcus lutes ATCC 13513 0
Streptococcus mutans ATCC 25175 0
Gram-negative bacteria
Escherichia coli ATCC 25922 0
Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895 0
Psuedomonas aeruginosa ATCC 27853 0
Table7.Inhibitory spectrum ofpurified antimicrobialcompound produced by B.subtilisMJP1
5.항세균 물질의 안정성
( 1)pH 안정성
GFC 2차 항세균 정제 물질의 활성이 pH에 의하여 변화되는지를 알아보기 위하여 pH 3.0에서 pH 10.0까지의 범위에서 잔존 활성의 역가를 측정한 결과 Table8과 같이 pH 3.0부터 pH 9.0까지의 영역에서 안정함을 관찰하였다.기존 보고된 배양상징액의 pH 안정성 실험[72]에서는 pH 3.0부터 pH 5.0까지의 범위에서는 역가가 감소하였으며 pH 6.0에서 pH 10.0구간에서 안정하게 나타났다.GFC 2차 정제물과 배양상징액을 pH 안정성 측면에서 비교하였을 때 산성 구간에서는 GFC 2차 정제물의 활성이 더 높으 며,중성 및 알칼리 구간에서 두 항균 물질 모두 안정하다는 점이 유사하다고 볼 수 있다.Gross,E.[26]등은 pH가 항균활성에 미치는 영향에 대해 pH가 높을 경우 hydroxideions,depronatedamines,depronatedhydroxylgroup과 같은 nucleophile이 dehydro-residue와 반응하여 분자 간 혹은 분자 내 cross-linkage를 형성하여 화학적 변형을 일으킨다고 보고하였으며,nisin의 경우 dehydro-residue의 존재로 인해 위와 같은 반응이 일어나 여러 종류의 반응물이 생성되고 nisin의 항균력은 소실된다고 보고된 바 있다[40].
( 2)온도 안정성
GFC 2차 정제물의 활성에 대한 온도의 영향을 알아보기 위하여 4℃,30℃,50℃, 70℃에서 24시간,100℃에서 30분,121℃에서 15분 동안 처리하여 항세균 활성을 측정 하였다.그 결과 Table9과 같이 4℃,30℃,50℃에서 24시간 처리한 구간은 역가의 소실이 전혀 없었음을 관찰할 수 있었다.70℃에서 24시간,100℃에서 30분 동안 처리 한 구간은 역가가 50%이상 감소하였으며,121℃에서 15분 동안 처리한 구간은 역가가 완전히 소실되었음을 관찰하였다.기존에 보고된 배양상징액의 온도 안정성 실험[72]에서는 고온에서 역가가 감소된다는 유사점이 있으나 30℃부터 역가가 50%이상 감소하였으며, 121℃에서 온도 처리 시 역가가 완전히 소실되지 않고 남아 있다는 차이를 관찰하였다.
Table 8.Effect of pH treatment on the antimicrobialactivity of purified antimicrobialcompoundproducedby B.subtilisMJP1
Treatment Antimicrobial activity (AU/ml)
pH
3.0 6,400
4.0 6,400
5.0 6,400
6.0 6,400
7.0 6,400
8.0 6,400
9.0 6,400
10.0 1,600
*B.subtilisATCC 6633wasusedasasensitivestrain.
Table 9.Effectofheattreatmenton the antimicrobialactivity ofpurified antimicrobialcompoundproducedby B.subtilisMJP1
Treatment Antimicrobial activity (AU/ml)
Heating
4℃, 24 hr 6,400
30℃, 24 hr 6,400 50℃, 24 hr 6,400
70℃, 24 hr 1,600
100℃, 30 min 3,200
121℃, 15 min 0
*B.subtilisATCC 6633wasusedasasensitivestrain.
( 3)효소 안정성
GFC 2차 정제물의 활성에 대한 효소의 영향을 알아보기 위하여 효소를 처리한 후에 활성을 비교하였다.그 결과 Table 10과 같이 amylase나 lipase등의 처리에는 활성이 소실되지 않았으나,단백가수분해효소인 proteinaseK,pronaseE 등의 처리에서는 활성이 완전히 소실되었고 trypsin,α-chymotrypsin,protease 등의 처리에는 활성이 50%이상 감소함을 관찰하였다.기존에 보고된 배양상징액의 효소 안정성 실험[72]에서 는 amylase및 lipase에서는 역가가 소실되지 않았고,단백가수분해 효소에서는 역가가 완전히 소실되는 점에서 배양상징액에 비하여 GFC 2차 정제물이 trypsin, α -chymotrypsin, protease 등의 효소에 상대적으로 안정하다고 추측할 수 있었다.
이상의 실험결과 GFC 2차 정제물은 항세균 물질은 단백질 또는 펩타이드로 이루어 졌음을 알 수 있었으며,bacteriocin 또는 bacteriocin 유사물질임을 추측할 수 있었다.
또한 당이나 지질의 결합이 항세균 활성에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다
Treatment Antimicrobial activity (AU/ml)
Enzyme
Proteinase K 0
Pronase E 0
Protease 1,600
Trypsin 3,200
α-chymotrypsin 3,200
Lipase 6,400
α-Amylase 6,400
Table 10. Effect of enzyme treatment on the antimicrobial activity of purifiedantimicrobialcompoundproducedby B.subtilisMJP1
*B.subtilisATCC 6633wasusedasasensitivestrain.
6.항세균 물질의 scanni ng
GFC 2차 정제물의 최대 흡수 파장을 알아보기 위하여 190nm부터 900nm의 범위 에서 wave scanning을 시행하였다.이로부터 B.subtilis MJP1이 생산하는 항세균 활성 물질의 최대 흡광파장은 Figure 12에서 나타난 바와 같이 289.0 nm이며 이때 흡광도는 1.141을 나타내었다.
Wavelength:289.0nm
Figure 12.Wave scaning of purified antibacterialcompound produced by Bacillus subtilis MJP1 wave scanning condition:wavelength(nm),190～900;scan step,1nm;scanspeed,1800nm/min.
제 4 장 결 론
Bacteriocin은 미생물이 생산하는 천연의 항균성 펩타이드 또는 항균성 단백질로써 생산균주와 가까운 속이나 종의 균주를 저해하는 물질,더 나아가 광범위한 항균범위를 가지며 세균을 저해하는 물질을 말한다.최근 몇십년 동안 유산균에 대한 광범위한 연구와 함께 유산균이 생산하는 대표적 항균물질인 nisin에 대한 연구가 크게 증가 하였으며,그로 인한 nisin의 산업적 이용에도 영향을 미쳤다.그러나 현재 가장 많이 이용되고 있는 bacteriocin인 nisin은 낮은 pH에서만 역가가 나타나는 제한성과,주로 Gram 양성균만을 저해하고 Gram 음성균과 곰팡이 및 효모에 있어서는 큰 활성이 없는 점 등이 가장 큰 단점으로 지적되고 있다.이에 반해 많은 Bacillus속이 광범위한 항균역가와 pH 안정성을 입증받았다.
그러나 아직까지도 Bacillus속이 생산하는 항균물질에 관한 연구는 유산균에 대한 연구보다 부족한 실정이다.Bacillus subtilis와 Bacillus licheniformis가 각각 GRAS 등급으로 인정받아 식품 및 다양한 산업분야에서 안정하게 이용될 수 있다는 가능성과 여러 Bacillus 속이 다양한 효소,항생물질,아미노산등을 생산한다는 점을 감안하면 앞으로 Bacillus속은 더욱 주목받을만한 가치가 있다고 생각된다.
본 연구에서는 우리나라 재래식 메주로부터 분리된 BacillussubtiisMJP1으로부터 생산되는 항세균 활성 물질을 분리․정제하고 그 항균물질의 특성을 조사하여 천연 식품보존제,무독성 농약 및 가축 사료 산업 등 다양한 분야에서 이용가능성을 탐색 하고자 하였다.
기존에 보고된 메주에서 분리된 Bacillus subtilis MJP1이 생산하는 항균물질을 분리․정제하기 위하여 solid phase extraction(SPE), ion exchange chromatography(IEC),gelfiltration chromatography(GFC)정제를 하였다.항균물질
4구간만을 모아 GFC를 시행하였다.GFC를 시행하여 확인된 2개의 majorpeak중에서 항균역가가 있는 peakⅡ만을 모았고 다시 한번 GFC 정제를 시행하였다.총 두 단계의 GFC를 시행하여 단일 peak를 획득하였으며 특성 및 물질규명을 위한 시료로 준비하였다.
IEC를 사용하여 정제된 항세균 물질은 tricineSDS-PAGE에서 하나의 band임을 확인 한 후 N-말단 아미노산 서열분석을 하였으나 실패하였다.FPLC system을 시행하여 획득된 항세균 활성 물질은 HPLC를 사용하여 단일 peak임을 확인하였고,N-말단 아미노산 서열분석 대신 내부서열을 알아보기 위한 UPLC를 이용한 ESI-MS/MS를 시행하였다.그 결과 HPLC에서 단일 peak로 확인된 항세균 활성 물질은 분자량이 매우 유사한 2개의 peptide(A:3356.54Da,B:3400.5244Da)가 존재함을 확인하였다.
GFC를 시행하여 정제된 항세균 물질의 특성을 알아보기 위하여 배양상징액,SPE, IEC,1차,2차 GFC 정제 단계별 역가 비교를 하였다.감수성 균주인 Bacillussubtilis ATCC 6633에 대한 역가를 확인한 결과 배양상징액에서 320specificactivity(AU/ml)를 나타내었으며,마지막 정제단계인 2차 GFC에서는 6,400 specific activity(AU/ml)를 나타내었다.
GFC 2차 정제물의 항균 spectrum을 조사한 결과,기존에 보고된 Bacillussubtilis MJP1의 배양상징액과 마찬가지로 동종인 BacillussubtilisATCC 6633뿐만 아니라 Staphylococcus aureus subsp.aureus ATCC 29213,Enterococcus faecalis ATCC 29212,Listeria monocytogenesATCC 19113 등의 Gram 양성균에서도 역가를 확인 하였다.
pH 안정성 실험에서는 pH 3.0부터 pH 9.0까지는 pH에 대한 영향을 전혀 받지 않았으며 pH 10.0에서 역가가 감소하는 경향을 관찰하였다.GFC 2차 정제물의 열 안정성 실험에서는 4℃,30℃,50℃에서 24시간 처리한 구간에서는 매우 안정하였고,70℃에서 24시간,100℃에서 30분 동안 처리한 구간부터 역가가 감소하여 121℃에서 15분 동안 처리한 구간은 역가가 완전히 소실되었다.효소 안정성 실험에서 GFC 2차 정제물은 일부 단백분해효소에 의해 분해되어 역가를 상실하였으며,Lipase나 α-Amylase에서는 안정함을 나타냈다.위의 안정성 실험을 바탕으로 정제된 항세균 물질이 넓은 pH 범위 에서 안정하고,비교적 높은 온도에서도 활성을 유지한다는 점을 관찰할 수 있었으며,단백 분해효소에 의해 분해되므로 단백질성 물질임을 확인하였다.
위 실험의 결과 중에서 BacillussubtilisMJP1이 생산하는 항균물질은 특히 Listeria
성장하여 식중독의 발생에 관여하는 Listeriamonocytogenes는 각종 식품에 오염되어 listeriosis를 유발하는 치명적인 병원성 세균으로 알려져 있다[38].또한 Wood[71]등은 Listeriamonocytogenes가 낮은 온도(4℃)에서 독성이 훨씬 높아 냉장상태의 저장식품 에서 이로 인한 여러 문제점이 우려된다고 보고하였다.
현재 50여 개의 국가에서 식품첨가물로 사용되어지고 있으며 우리나라에서도 식품 첨가물로 인정되어온 nisin은 pH 2.0에서 가장 안정하며,pH가 증가할수록 안정성이 감소하여 산성이 아닌 식품에 첨가할 때에는 이러한 단점을 신중히 고려해야한다[72]. 또한 nisin과 같은 유산균이 생산하는 bacteriocin또는 BLS는 산성이나 중성조건에서만 안정하며 pH 8.0이상에서는 불활성화 된다는 보고가 있다.
이상의 실험에서 관찰된 Bacillus subtilis MJP1의 넓은 항균력과 pH 안정성,열 안정성은 Bacillus 속이 생산하는 많은 항균성 peptide가 음료,식품산업에서 주요 생물학적 방부제 및 식물 병해충의 생물학적 제제,항생제의 전구물질로써 가능성을 지니고 있음을 뒷받침해준다.앞으로는 유산균에 국한되어져왔던 항생물질의 연구 및 개발이 다양한 장점을 지닌 Bacillus속에 대한 연구로 확대되어 효율과 안정성 모두 를 기대할 수 있고 산업적으로도 유용하게 활용될 수 있도록 더욱 발전되어야 할 것이다.
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