Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 2 3985
화학공학의 이론과 응용 제8권 제2호 2002년
Lipase를 이용한 당에스테르의 효소적 합성
김우경, 김광일, 서덕기, 유인상, 윤현희 경원대학교 화학공학과
Enzymatic Synthesis of Sugar Fatty Acid Esters
Woo Kyung Kim, Kwang Ill Kim, Duk Ki Seo, Sang Yoo In, and Hyon Hee Yoon
Department of Chemical Engineering, Kyungwon University Dansuk Industry Co., Ltd.*
서론
기능성 당에스테르(sugar fatty acid esters)는 비이온성, 생분해성, 그리고 무독성 계면활 성제로서 식품유화제, 화장품유화제, 과일도포제 및 건강지향성 지질 대체 식품으로 사용 된다. 이와 같은 당에스테르는 고부가가치의 식품 관련 신소재로서 천연유기지방산 (lauric, myristic, palmitic, stearic, oleic acid 등)과 각종 당성분(sugars 또는 sugar alcohols)과의 transesterification 반응을 통해 생성된다.[1] 당에스테르는 공업적으로 당과 지방산을 원료로 사용하여 화학적합성방법으로 생산되고 있으나, 최근에는 환경친화성이 우수한 효소적인 합성법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.[2] 화학적 합성법에 의한 당에스테르의 생산은 과도한 용매 및 화학물질 사용과 에너지 소모가 많다는 문제점을 갖고 있다. 반면에 생체촉매기술의 발전과 함께 경제성이 향상되고 있는 효소적 합성법은 소량의 유해 화학물질을 사용하고 에너지사용이 최소화되는 장점을 갖고 있다.[3]
본 연구에서는 지방산과 당으로부터 당에스테르를 효소적으로 합성하는 반응의 특성을 조사하기 위하여, 당의 종류, 유기용매의 종류, 합성반응에 영향을 미치는 molecular sieve와 수분의 영향, 효소사용량 등을 변화시켜 당에스테르의 합성실험을 수행하였다. 본 실험에 사용한 당은 α-methyl-D-glucoside, D-sorbitol, xylitol, D(-)-fructose, sucrose, D(+)-glucose, D-fructose-1,6-diphosphate이고 지방산은 oleic acid를 사용하였고, 반응매질 인 유기용매는 acetone과 2-methyl-2-propanol (tert-butyl alcohol)을 사용하였다. 지방산 과 당의 acylation 반응을 위한 효소는 lipase(Novozym 435)를 사용하였다.
실험재료 및 방법
Acetone(또는 tert-butyl alcohol) 30ml에 당(6mmol)과 지방산(2mmol)을 혼합 시키고 수 분제거를 위해 200℃에서 하루동안 건조시킨 molecular sieve를 6g 넣어준 후 반응온도 50℃(또는 60℃)로 유지된 air bath에서 5분간 교반한 후에 0.3g의 Novozym 435 (immobilized lipase from Candida antarctica onto macroporous acrylic resin, EC 3.1.1.3, 활성도 7000 PLU (propyl laurate units)/g, 수분함량 1∼2 % (w/w), 입경 0.3∼
0.9mm, 벌크밀도 430 kg/m3, Novo Nordisk)를 첨가하여 sugar와 fatty acid의 아실화 반 응을 수행하였다. 매시간마다 시료를 채취하여 원심분리 후 상층의 맑은 액만 취하여 HPLC로 fatty acid의 농도를 분석하였다. 당에스테르의 수율은 지방산의 소모량으로부터 계산하였다.
Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 2 3986
화학공학의 이론과 응용 제8권 제2호 2002년
Sugar ester 합성반응에 영향을 미치는 수분의 영향을 조사하기 위한 실험에서는 tert-butyl alcohol(2-methyl-2-propanol) 30ml를 반응매질로 하여 1.09g의 D-sorbitol (6mmol)와 0.63ml의 oleic acid (2mmol)를 용해시키고 molecular sieve양을 0∼9g 변화시 키면서 각각의 vial에 0.3g의 Novozym 435를 첨가하여 아실화 반응을 수행하였다.
효소함량의 따른 당 에스테르의 수율을 조사하기 위한 실험에서는 tert-butyl alcohol 30ml에 α-methyl-D-glucoside 1.164g (6mmol)과 oleic acid (2mmol)를 용해시키고 효소의 양을 기질의 양의 5∼150%까지 변화시키면서 아실화 반응을 수행하였다. 지방산, 당, 당 에스테르의 농도는 HPLC를 사용하여 분석하였고 수분함량은 Karl fisher 수분측정기 (MODEL AF7)를 사용하여 분석하였다.
HPLC 분석조건은 다음과 같다.
Column : Nucleosil 100 (C18) 10u column(4.6 ×250 mm, Alltech) Mobile phase : Acetonirtile : Methanol : H2O = 65 : 15 : 20 Detector : RI detector
Flow rate : 1.0 ml/min
Sample injection volume : 20μ
실험결과 및 토론
Figure 1과 2는 용매 및 당의 종류에 따른 전환율을 나타낸 결과이다. 반응매질을 tert-butyl alcohol로 사용한 경우 acetone 보다 전반적으로 전환율이 높았고 그중에서도 α -methyl-D-glucoside(96.7%), D-sorbitol(99.6%), xylitol(99.7%)등이 가장 높았지만 sucrose(11.8%)와 D-fructose-1,6-diphosphate(12.8%)는 낮은 전환율을 나타내었다. 이는 용 매의 대한 당의 용해도의 차이와 온도 때문이라고 판단된다. 그러므로 이 실험에서 사용 한 용매들은 sucrose와 D-fructose-1,6-diphosphate에는 적합하지 않다는 것을 알수 있다.
반면 나머지당들은 효과적인 효소적 합성을 하는데 적당한 당들로 선정할수 있을 것이다.
Figure 3은 당에스테르의 효소적 합성반응에서 수분이 전환율에 미치는 영향을 조사한 결과이다. 본 실험에서 당에스테르 합성 반응시 생성되는 수분을 제거하기 위하여 반응물 에 molecular sieve를 첨가하였다. figure 3에 나타난 바와 같이 molecular sieve의 첨가량 에 따라 전환율이 큰 차이를 보이고 있다. molecular sieve의 첨가량에 따라 반응 도중 수분함량이 figure 3(b)와 같이 조절되었으며, 90%이상의 전환율을 얻기 위해서는 수분 함량을 0.15% 이하로 유지시켜야 하는 것을 알수 있다.
Figure 6은 효소의 양에 따른 전환율의 변화를 조사한 실험이다. 기질의 양에 15%이상 의 효소양이 들어간 반응에서는 24시간동안의 반응에서 80%이상의 수율을 얻었고 그이 하의 양에서는 낮은 수율이 나왔다. 그러나 반응시간에서는 효소함량이 많은 것이 4∼6시 간만에 80%이상의 빠른 전환율을 나타내었다. 따라서 효소함량은 반응시간과 비례한다는 것을 알수 있다.
참고문헌
1. Akoh, C. C. and Swanson, B. G. (1994), Carbohydrate Poyesters as Fat Substitutes, Marcel Dekker, Inc., New York.
2. Sarney, D. B. and Vulfson, E. V.(1995), Application of enzymes to the
Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 2 3987
화학공학의 이론과 응용 제8권 제2호 2002년
synthesis of surfactants, Trends in Biotechnology, 13, 164-172.
3. Akoh, C. C. (1995), Liplid-Based Fat Substitutes, Critical Reviews in Food and Nutrition, 35(5), 405-430.
Time(h)
0 5 10 15 20 25 30
Yield(%)
0 20 40 60 80 100
α−methyl-D-glucoside D-sorbitol xylitol
D(-)-fructose sucrose D(+)-glucose
D-fructose -1,6 -diphosphate
Figure 1. Sugar ester synthesis in tert-butyl alcohol using different sugars.
(sugar : oleic = 3:1)
Time(h)
0 5 10 15 20 25 30
Yield(%)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
α-methyl-D-glucoside D-sorbitol xylitol D(-)-fructose sucrose D(+)-glucose
D-fructose -1,6 -diphosphate
Figure 2. Sugar ester synthesis in acetone using different sugars.
(sugar : oleic = 3:1)
Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 2 3988
화학공학의 이론과 응용 제8권 제2호 2002년 Time(h)
0 5 10 15 20 25 30
Yie ld(% )
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Molecular sieve 0g Molecular sieve 1g Molecular sieve 3g Molecular sieve 5g Molecular sieve 9g
Time(h)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
M o istu re cont en t(% )
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40
Molecular sieve 0g Molecular sieve 1g Molecular sieve 3g Molecular sieve 5g Molecular sieve 9g
(a) (b)
Figure 3. Effect of moisture content on the enzymatic sugar ester synthesis.
(a) Sugar ester yield, (b)mositure content
Time(h)
0 5 10 15 20 25 30
Yi el d(% )
0 20 40 60 80 100
Enzyme 5%
Enzyme 15%
Enzyme 25%
Enzyme 37%
Enzyme 53%
Enzyme 105%
Enzyme 159%
Figuar 4. Esterification of oleic acid with α-Methyl-D-glucoside by using different content of lipase-catalyzed.
