Klebsiellα pneumoniαe 의 항균제 내성 에 관한 연구

(1)

대한임상병리사회지 : 제 20권 제 1 호 1988

Klebsiellα pneumoniαe 의 항균제 내성 에 관한 연구

동남보건전문대학 임상병리과 ^· 홍 성 노

1.

서 론

K. pneumoniae 는 Streptococcus pneumoniae ^다음으로 높은 빈도로 폐렴을 일으키며 특히 토양， 식물， 오염 수동의 환경요인으로 부터 상처를 통하여 많이 감염된 다. ^•

기회감염과 병원성 감염을 많이 일으켜 치명적일 수 있고 균혈증 (bacteremia) 을 유발시키며 환자나 의사，

간호원등의 손이나 의복등을 통하여 감염된다.8，9) 우리 나라에서 보고된 장내세균들의 항균물질 내성 추이를 보면， 김(1 977) 15)， 설(1977)18>， 조 (1982)21)퉁이 E.. coli 는 이 미 chloramphenical (CM) , tetracycline( TC), streptomycin (SM ), 및 ampicillin( AM) 의 항균물질에 대하여 높은 비율로 내성을 나타내고 있는 것을 보고 했고 김 (1984 )16>, 박 (1981) 17)， 정 (1984 )20)등의 보고에 의 하면 Shigella 의 균주들은 8종류 이상의 항균물질에 대 하여 동시 내성을 나타내도 있다고 하였다 5，14)

사람의 장내에서 기인된 균주들에게만 항균물질에 내성을 나타내는 것이 아니라 닭， 돼지， 소등 항균물 .질을 먹여서 기른 가축에게 까지도 다수의 항균물질 내성 균주가 었음을 하 (1971 )22)등이 보고했다. 본 실험 에서는 항균제 내성화 방지 및 올바른 항란제를 선택 하여 K. pneμmoniae 의 감염성 질환에 사용할 수 있는 기초자료를 얻기 위한 목적으로 항균제 감수성 및 내 성정도를 알아보았다.

ll.

실험재료 및 방법 1. 사용 균주

멸균 면봉을 이용하여 설사 질환 환자들의 직장 도 말 (retal swab) 을 하여 즉시 인산 완충용액에 수집한 다음 MacConkey 한천 평판배지에 접종시켜 3TC 배 양기에서 하룻밤 분리 배양하였다.

MacConkey 한천 평판 배지에서 K. pnemoniae로 의 섬되는 집락을 다시 MacConkey 한천 평판 배지에 도

말하여 순수 분리하였다.

이중 Congo Red로 협막을 염색하여 협막을 형성하

는 Gram음성 간균만을 Edward and Ewing(1972)6)의 방법에 따라 분리동정하여 1 차로 klebsiella속에 해당하 는 균주를 선별한 다음 MacConkey 한천 평판 배지에 보관하면서 100균주를 실험 대상 균주로 사용하였다.

2. 배지 및 항균제

표준균액용 배지로는 Müller Hintor broth(Ddifco) 를 항균제 감수성 검사배지로는 Müller Hintor agar (Difco ) 를 사용하였다. 항굵제는 WHO 표준품의 항균제로서 ampi，해lion(AM) 을 포함하여 8종류의 항균제로 æphalethin

(CE) chloranphenicol(CM) gentamycin(GM), kanamycer (KM) streptomycin (SM ) tetracycline (TC ), nalidixic acid(NA) 등이다.

항균물질의 조제와 보관은 Edwin (1980)7)과 Lorian (1 980)10) 의 방법에 따라 알맞은 solvent에 용해하여 20⁰C 에 동결시켜 보관하였다.

3. 항균제 내성실험

( 1) Kirby- Bauer 표준법

Kirby & Bauer둥(1 966)2)의 항균제 디스크 확산방법 에 따라서 9종류의 BBL사 디스크로 항균제 내성 검사 를 하였다. 사용한 항균물질의 함량및 내성 기준은 Table

l 과 같다.

Disk diffusion method에 의 한 항란제 내 성 검 사의 결과는 NCCL Standards를 기본으로하여 판정 하였고，

그 결과로써 희석법의항균제농도 기준범위를 정하는데 사용 하였다.

(2) 한천 평판 희석법

항균물질 디스크로 일차적인 항균물질억채 여부가 판정된 후 이차적으로 정때) 및 조21) 등의 한천 평판 희 석볍으로 최소 발육억제 농도 (MIC) 를 정하였다. 항

(2)

Tahlt'. 1. Zone diameter interpretative standrcls Zone diameter. nearest whole mm.

Antmcrbial agent DiscCont

Ampicillin 10 μg

Cabenicillin 100 μg

Cephalothin 30 μg

Chloramphenicol 30 μg

Gentamycin 10 μg

Kanamycin 30 μg

Streptomycin 10 μg

Tetracycline 30 μg

Nalidixic acid 30 μg

균제 농도의 확인은 E.coil A TCC 25922을 control strain 으로 사용하여 농도를 확인 하였다.

실험 결과에서 판정된 최소 발육 억제농도가 일정 범위의 (Table 2)7,10) 농도보다 높은 경우에 내성균으로 판정 하였다.

Table. 2. Criteria of resistant Gram negative strains expressed by MIC (U g / ml)

Antimicrobials reslstant

Ampicillin _{늘 32}

cephalothin 늘 32

Chloramphenicol _{르 25}

Gentamycin 늘 16

Kanamycin _{르 25}

Streptomycin _{르 15}

Tetracycline _{르 12}

Nalidixic acid _{츠 32}

m.

^{실험 성적}

1. 실험에 사용한 100균주의 생화학적 동정결과는 Edward and Ewing(l972)6\ Cowan Steel(l974)4) 및

Bergey’s Manual(l984)3) 제 8 판등의 K. Pηeμmdniae 의 동정결과와 일치 부합되었다.

Resistant -Intermediate Susceptible

듣 11 12-13 늘 14

듣 17 18-22 르 23

흐 14 15-17 늘 18

츠 12 13-17 _{르 18}

흐 12 13-14 _{르 15}

듣 13 14-17 르 18

흐 11 12-14 늘 15

흐 14 15-18 늘 19

츠 13 14-18 늘 19

대 조균주인 K. pneumoniae ATCC 13882, K. þneu^lI10niae A TCC 13883, K. pneumoniae A TTC 10031 3 균주의 특성과도 일치하여 100분리 균주는 K. þne 1t lllolliae 임이 동정 되었다.

K. pneumoniae 의 기 본 생 화학적 성 상인 KIA 배 지 에 서 산을 생성 하고， HzS 는 생산하지 않으며 lmvlc 시 험은 Indol 이 음성， Vp가 양성， Citrate 가 양성인 것이 특정이고 Capsule을 형성하며 운동성은 없지만 생화학 적 검 사중 당분해 능 검 사를 한 겁 과 dulcitol 파 adonitol

를 분해시키는 능력에 따라서 4Group으로 나눌 수 있 었다.

즉， (A) dul-group (B) ado group (C) duJ- ado group (D) dul+ ado+ group 이 었 다.

(A) dul- group은 27 분리균주로 전균주중 27% 가 dul을 분해시키지 못했다.

(B) ado- group은 16 분리균주로 전란주중 16 %r 가 ado를 분해시키지 못했다.

(C) dul- ado- group은 9 분리균주로 전 균주중 9%

가 dul 과 ado을 모두 분해 시키 지 봇했으며

(D) dul+ ado+ 은 48 분리 균주로 48% 가 127~ 지 당을 전부 분해 시켰다.

기타 생화학반응-은 전 분리균주가 Klebsl꾀a 분류 기 준에 잘 부합 되었다. 전 분리칸주가 arb룹 분해 시켰 지만 48-72 시간으로 분해 시간이 지연되었다. 대조균 주인 K. plleumolll‘ae A TCC 13882 는 dul 분해 능이 없 었고 K. þlleulnolliae ATCC 10031 은 dul 과 arb를 모 두 분해 시키지 봇했으며 K. þlleltJllolliae A TCC 13883 은 dul 과 arb를 모두 분해 시 켰다.

-176-

(3)

대조균주와 A,B,C,D 4 group 간의 당분해능 비교를

Table 3 에 나타내 었다.

2. K. pnelllnoniae 분리균주의 항균물질 내성은 비교 룹 Table 4 에 제시된 결과를 같이 K. pneulnoniae분리 균주듬은 항균물질 종류에 따라서 다양한 내성을 나타 내는 것을 관찬할 수 있었다.

AM 에는 분리균주 천체가 내성을 나타내어 100%

내성율을 보였다.

NA 에는 분리균:주 전체가 감수성을 나타냈다.

CE 에는 14 분리균주 (14%) 가 내성을 나타냈고，

CM 에는 16 분리균주 (1 6%) 가 내성을 나타냈고， GM

에는 2 분리균주 (2%) 가 내성을 나타냈고， KM 에는

8 분리균주 (8%) 가 내성을 나타냈고， SM 에는 13 분 리균주 (13%) 가 내성을 나타냈고 TC 에는 17 분리균 주 (1 7%) 나 내성을 나타냈으며， 내성의 유형은 Table

5 에 제시된 결과와 간이 내성을 이룬 헝균물질 조합별 로 분류하엿고， 조합에 해당되는 분리균주는 다음과

감았다.

20 분리균주 (2이가 2종 항균물질에 내성을 나타냈고 조합유형은 4 조합으로 AMrSMr’ AMrTU, AMrCEr’ 빛 AMrCMr 였다.

3종 항균물질에 동시 내성을 나타내는 균주는 5 균주

(5%) 엿으며 유형 은 3조합으로 AMrCMrTcr, AMrSM

rTU 및 AMrCMrSMr 였 다.

4 개의 분리균주 (4%) 가 4종 항균물질에 동시 내성을 나타냈고， 유형 은 3조합으로 AMrCMrKMrTU, AMrCM rKMrSMr 및 AMrCMrSMrTU 였 다.

4 개의 분리균주 (4%) 가 5종 항균물질에 동시내성을 나타냈고 유형은 2조합으로 AMrCPCMrKMrTcr과 AMrCMrKMrSMr 였 다.

6종 항균물질 AMrCMrGMrKMrSMrTcr에 동시 내 성을 가진 분리균주는 1 균주로 (1%) 내성율을 나타냈 다.

이들의 결과중 특정적으로 전균주 모두 내성을 나타 내고 있는 NA 및 내성화 되어가고 있는 CM 의 MIC

백분율을 Fig. 1 에 나타내었다. K. Pηeμmoηiae ATCC 13882, K. pneumoniae A TCC 13883, K. P ηeμmontae

ATCC 10031 은 모두 AM 한 종류의 항균물질에 만 내 성을 나타냈다.

N.

고 찰

장내세균은 여러종류의 항균물질에 대해서 동시에 내성이 생낀다는 현상이 알려진 후 그 원인이 무엇인 지 규명 되 지 않았으나 Akiba(1960) 등이 Shigella 와

E. colz 를 동시 배양시켰을 때 항균물질 내성이 Shigella

Table. 3. Biochemical properties ^K.pneμ mo η iae test strains 4gr. and control ATCC strains.

Strain

Test 13882

Gas from Glucose

+

Lactose

+

Sucrase

+

Mannitol

+

Dulcitol

adonitol

+

Salicin

+

Inocitol

+

Sorbitol

+

Arabinoee

+

Raffinose

+

Rhamnose

+

) : percentage of negative strains gr Group

control Strain 10331 13883

+ +

Test strain

Agr. Bgr. Cgr. Dgr.

+ + + +

(27)

+

⁽⁹⁾

+

⁽¹⁶⁾ ⁽⁹⁾

+

+ + + +

(4)

로부터 E.coli 에 전달되는 현상을 보고하였다. 그러나 어떤 원인에 의해서 세균끼리 항균물질이 전달되는지 는 그 기전을 잘알지 못하였는데 Mitsuhashi¹²)에 의해 서 “ R-factor:ι (R -plasmid) 가 세포 상호접촉 (Cell to cell contact) 으로 전달되 어 진다고 보고했다 11，12，13)

항균제의 남용 및 오용에 따라 점차 내성균의 출현 빈도가 많아지고 치료에 새로운 문제점을 낳고 있다.

Klebsiella 에 대한 항균물질 감수성 검사에 대한 보고 가 국내에서는 매우 드물고 또한 보고된 것도 극히 일 부지방에 대한 것이기 때문에 국내에 분포하는 Klebsiella 균종에 대한 내성 유형은 현재까지 잘 파악되어 있지 않다.

김 (1984)16), 박(1 981¹⁷6 ^{및 정}(1984)20) 등의 실험보고 가 있는데 대표적으로 이(1 980)14) 등의 실험과 상관 관계가 깊은 것으로 사료되어 이(1 980)19) 등의 실험과 비교 분석하였다. 이(1 980¹⁹) 등이 병원과 농어촌 지역 에서 분리한 K

.p

neumomae 분리균주들에 대한 항균물 질 내성 보고가 있었는데 125분리균주중 병원에서 유 래된 분리균주가 44.8 % AM, 15 %가 CE^,^1.5%가 GM, 2.4 %가 TC, 16.4 %가 KM^,22.4 %가 SM 에 내 성 인 것 으로 나타났고， 또한 농어촌에서 분리된 분리균주의 22.4%가 AM, 1.77 %가 CE^,3.4 _{%가 TC에 내}_{성 을 나} 타냈다. 병원과 농어촌지역 구분없이 총 분리된 균주 들의 항균제별 내성비율은 AM에 43주 (34.4 %), CE 에

Table. 4. Durg susceptibility patterns 100 strains of K. peηemontae

0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 늘 32 64 128 늘 128

No of strains ₂ ₉₈

AM Percentage ₂ ₉₈

Curnulative % ₂ ₁₀₀

No. of strains ₂ ₄ ₅ ₄₁ ₃₄ ₉ ₅

CE percentage ₂ ₄ ₅ ₄₁ ₃₄ ₉ ₅

Cumulative % 2 6 11 52 86 95 100

No. of strains ₂ ₅₂ ₂₉ ₇ ₉

CM percentage ₂ ₅₂ ₂₉ ₇ ₉

Cumulative % 3 55 84 91 100

No. of strains 81 7 5 3 2 2

GM percentage 81 7 5 3 2 2

cumulative % 81 88 93 96 98 100

No. of strains 8 62 9 7 6 6 2

KM percentage 8 62 9 7 6 6 2

Cumulative % 8 70 79 86 92 98 100

No. of strains 69 7 11 9 2 2

SM percentage ₆₉ ₇ ₁₁ ₉ ₂ ₂

Cumulative % 69 76 87 96 98 100

No. of strains ₃₂ ₄₄ ₈ ₅ ₇ ₂ ₂

TC percentlge 32 44 8 5 7 2 2

Cumulative % 32 76 84 89 96 98 100

No. of strains 4 79 13 4

NA percentage ₄ ₇₉ ₁₃ ₄

Curnulative % 4 83 96 100

(5)

Table. 5. Antibiotic resistance patterns of ^K.pneμmoηtas

No, of drugs multiply Resistant to

No, of strains Resistance ^pa얀ern

2 3 4 4 4 5 5 5

η η η η

AmCeCmGmKmSmTc AmCmGmKmSmTc AmCmKmSm AmCmKmSm AmCmSmTc AmCmTc AmSmTc AmCmSm AmSm AmTc AmCe AmCm 7

6 4

41

4 3 3 3 2 2 2 2

내성은 이둥 19)의 실험결과와 대체로 일치하였다.

그외 KM 및 SM 2종류의 항균물질에 대한 내성은 이등19)의 보고가 본 실험의 결과 보다 약 두배정도 높 게 나타났다.

여러 항란물질에 대한 결과는 이동19)의 보고에서 동 시내성 항균물질이 5종으로 본 실험 7종보다 2종이 적 었지만 내성균주 분리율은 본 실험보다 높았다. 본 실 험결과 AM 에 전 분리균주가 모두 내성을 나타냈으며 GM을 비롯한 나머지 항균물질들에 대해서도 점차 내 성율이 높아가고 잇는 것으로 생각된다.

o---ø AM

~NA lJr---b CM

m

mm

mw

m

mω 때 mω mω

m

{〕φ엌으디딩 {〕요띠【。잉 〕다φui%나 ω〉끽잭3E3”〕

m ω

수집하여 세 성상을 확인 론

K. pneμmomae로 분리 된 100 개 균주를 균학적 검사를 통하여 본 균의 생화학적 하고 항균제 내성 양상을 알아 보았다.

V. 결 128

8 16 32 64

concentration(μg/ml)

4 0 2

Fig. 1. Curvilinear nature dose response curves with three different antimicrobial agents^,tested over a wide

1. 단일약제 내성 균주

1) AMr: 100 % 2) CMr: 16 % 3) Tcr: 16 % 4) CEr: 14 % 5) SMr: 13 %

6) KMr: 8 %

7) GMr: 2 %로 나타났다. 그런것에 반해 NA 에는

100주 모두가 감수성으로 나타났다.

range of concentration

2 개주 (1.6) GM 에 5 개주 (4%) , KM 에 l17n 주 (8.8%) , SM 에 15 개주 (12%) 및 TC에 17주 (13.6 %)가 내성 인 것으로 밝혀졌다.

이 둥(198이영)의 보고에 의하면 여러 항균물질에 동 시내성을 나타내는 비율이 2종 내성이 3%， 3종 내성 이 3%, 4종 내성이 9% 및 5종 내성이 7.5%였다. 본 인의 실험결과와 비교할때 AM 및 CE에 대한 내성은 본 실험의 결과가 이 동19) 보다 높았고， GM에 대한

(6)

2. q.x~l LH ~ ~-?- 3) 4%91 i5JTI A~] oJ]

4F'a :

12 % 4) 3%91 i5JTI A~] oJ]

4F'a :

15 %

1) 7%91 i5J TI A~j oJ] 5)

4F'a:

2 % 2%91 i5J TI-;(!] oJ]

4Pa :

68 %.£ 1-]-q)J-q.

2) 6%91 i5JTI A~j oJ]

4F'a:

3 ^%

Syutdies on

antibioti~s

resistance of Klebsiella pneumoniae

Seong No Hong

Dept of clinical and patholegy, Dong Nam Health junior College

Abstract

One hundred strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from feces of dysenteric patients, which were resistant to ampicillin but sensitive to nalidixic acid.

Sixteen out of the 100 isolates were resistaRt to chloramphenicol, 14 to cephalothin, 16 to tetracycline, 14 to streptomycin, 8 to kanamycin and 2 to gentamycin.

And 5 types of different multiple resistance profiles

1. Akiba T.Koyama T, Isshiki S and Tukushimrna T : Studies on the mechanism of development of multiple drug resistant Shigella strains.

2. Bauer, A. W., W.M.M. Kirby, J.C .. Sherris, and M.

Turck. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single Disc method.

Amer. ]. Clinic. Pathol. 45 : 493-496.

3. Bergey, D.H.R.S. Breed and E.G.D. Murry. 1984.

bergey's Manual of Systemic Bacteriology, P. 409 -504. 8th ed. Vol. 1., The Williams and Wilkins Co., Baltimore.

4. Cowan, S. T. and K. ]. Steel. 1974 Manual for the identfication of medical bacteria. p. 103-116. 2nd.

ed., Cambridge Univ. Press.

5. Davis, B.D., R.Dulbecco, H.N.Eisen, H.S. Ginsberg.

1980. Microbiology. p.137-152, 3rd., Harper & Row.

6. Edwards.P.R., and W.H.Ewing 1972. identivication of Entrrobacteriaceae p. 291-300. 3rd ed. Burges Co., Minnesota.

were observed from 100 strains of them :one of them resistant to AP, CE, CM, GM, KM, SM, and TC (7antibiotics) from 2 strains, another resistant to AM, CM, GM, KM, and. TC (6antibiotics) from 3strains, another resistant to AM, CM, KM, and TC ( 4gntibiotics) from 4 strains, another resistant to AM, CM and TC (3antibitics) from 15strains, the other resistant to AM and SM ( 2antibiotics) from 68 strains.

7. Edwin, H.L. 1980. Laboratory tests in Chemotherapy.

Manual of Clinical microbiogy 3rd ed. American Society for microbiology, Washington, D.C:

8 Hoeprich. P.D. 1983. Infectious disease. 1 : 509-522.

Harper & Row publishers, Phiiadelphia.

9. Lennet, E.H., A. Balows, W.J. Hausler, J.P. Tranut.

1980. Manual of clinical microbiology; Washington, D.C.

10. Lorian, V. 1980. Antibiotic in Laboratory medicine.

p.78-80. williams & Wilkins Co., Baltimore I London.

11. Muchugh GLand Swartz MN : Elimination of plasmids from several bacterial species by novobiocin, antimicrob.

Agents Chemother., 12 : 423-436, 1977.

12. Mitsuhashi SK Harda and Hashimoto H: Multiple resistance of enteric bacteria and transmission of drug resistance to other bacteria by mixed cultivation.

Japan. ]. Exptl. M., 30 : 170-184, 1960.

13. Watanabe T and Fukasawa T: Episome-Mediated Transfer of resistance in Enterobactriaceae II.

-180-

(7)

Elimination of resistance factors with acridine dyes.

J. Bacterol., 81 : 679-687, 1962.

14. Wolfgang K. Joklik, D.phil and D. Bernard Amos, MD. 1984 Zinsser Microbiology, ^P.595-622, 18ed., Appleton- Century- Crofts, Norwalk, Connecticut.

15. {J<?-JAJ, {1§:11], oprJ~. ~PJ%, 7-J-i'-~. 1977. ^~

~f- ¥9-1 ~ ?.] ~ :4 ~ Jt! oJl J.i ~21 ~} E. coli9-1 i>JA~

A~j {fyAj oJl qj "6}e:j qj ~oj A~ %~§1 ?.j 12 : 1-10 16. ~?.]~. o]~£l1. 1984 Shigella TI-~9-1 i>JifA~l 1.1Va

~ ~~Aa R-plasmidoJl B-~ ~-=r-. qj~ D]A~% ~

§j ?.] 19 : 11-24.

17. ~"6-~. 1981. ~2·20 7H-%l{} ~21~ o]~TI-9-1 .Jl

~Jl} 3!}71 20\!{1-9-1 i>JifA~jojj qj~ {J-yAj9-l \!:!{!, qj~DjA~%~§1?-j 16:1-6

18. {=H~%. 1977. ~--:<;-9-1 ~:A} ~ ~⁷J~oj]Ai ~21~

E.coli9-l ~A~l~Aa ~ qj~o]A~%~§1?.1.12: 11-18.

19. o]:i!J~. ~~AJ, {1§:11], ~}%%, o]"6-~. 7-J-i'-~,

o] Aj it, 1980. ¥9-1 ~ if~ ~ ~ Jtl if'T-91 ⁶JTI-All 1.11'-d OJ~ojj B-~ ~-=f-. qj ~Dj A~%~§] ?.j 12 :'11 -18.

20. 1)fll§}, o]~Jt!. o]*-t~, ~7]AJ, o]~-T. o]~Ell.

%Aa~c. 1984. o]~TI-~9-1 i>JifA~l ~Aa qj~o]A~%

~-}§] ?.]. 19 : 25-34.

21. S:%~, ~i.£71, 1982. qj~if9-1 i>JTIA~l ~Aj ~ ~

~Ad R-plasmid qj~o]A~%~§1?.] 17:21-34.

22. "6}qj%, ;;{j{:i~, ⁷J~Tr, 1971. -i'-2142} ^7}~oj]J.i

~21~ Salmonella ~ qjAJTI-9-1 ~Aa~:A}9-1 ~.¥..

qj ~o] A~% ~§j ?.]. 6 : 21-28.