백서의 간에서의 허혈-재관류 손상 후에 오는 아포프토시스
순천향대학교 의과대학 외과학교실1, 내과학교실2, 임상분자생물학연구소3, 소화기연구소4 김 태 윤1, 이 원 석1, 윤 익 진1 , 4, 박 성 규2 , 3, 홍 대 식2 , 3
김 연 수2 , 4, 심 찬 섭2 , 4, 이 민 혁1, 김 재 준1
Apoptosis after Ischemia-Reperfusion Injury in Rat Liver
Department of Surgery
1, Internal Medicine
2,
Institute for Clinical Molecular Biology Research
3& Institute for digestive research
4, Soon Chun Hyang University, College of Medicine, Seoul, Korea
Tae-Yun Kim
1, Won Seok Lee
1, Ik-Jin Yun
1,4, Sung Kyu Park
2,3, Dae Sik Hong
2,3, Yun Soo Kim
2,4, Chan Sup Shim
2,4, Min-Hyuck Lee
1, Jae-Jun Kim
1Abstract B
Baacckkggrroouunndd : Liver ischemia-reperfusion injury is one of the major problems in liver transplantation and radical liver surgery. Ischemia-reperfusion injury is known to be induced by oxygen free radicals and the cell damages used to result in cell necrosis. However, apoptosis, another type of cell death, may be also related to the ischemia-reperfusion injury and hepatic dysfunction after ischemia-reperfu- sion injury may also be associated with the apoptosis. We examined the correlation between ischemia- reperfusion injury and apoptosis in rat liver by apoptosis morphological study.
M
Meetthhooddss : Male Sprague-Dawley rats were used. For each rats, 60 minutes partial clamp was applied to the hepatic artery and portal vein. Then, 5 groups which had 4 rats each were divided on the base of reperfusion injury duration of 0, 1, 3, 6, 24 hour (total numbers of rat were 20). For each rat, the central lobe which was given ischemic injury (ischemic groups) and the lateral lobe which was not given ischemic injury (control groups) were sampled after 60 minutes ischemia time. Apoptosis was exam- ined by the method of TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay. Counter staining was H&E staining and under the light microscopy with x60 and x300 magnification, apoptotic cell were examined..
R
Reessuullttss : The groups of apoptotic cells were observed in 24hr reperfusion group. In 24 hr groups, besides conglomeration of apoptotic cells destructed hepatocyte cytoplasms were also observed. In all of the non-ischemic control group, no apoptosis was observed. Although the early reperfusion groups had not so much apoptotic cells as 24 hour group, the number of apoptotic cells in 0, 1, 3, 6 was signif- icantly increased compared with the control groups.
C
Coonncclluussiioonn : Apoptosis activity may be increased during reperfusion period with the maximum in 24 hour. This meant that apoptosis in ischemia-reperfusion injury might be associated with the chronic damage to hepatocyte and it might be the one of the causes of fibrosis or cirrhosis mechanism.
Key words: rat liver, ischemia-reperfusion injury, apoptosis
서론
간암이나 간이식과 같은 간에 대한 외과적 광범위 간 절제 수술의 필요가 증가하면서 절제시 필연적 으로 수반되는 간 동맥 및 간 문맥의 혈류 중단에 의한 허혈-재관류 손상이 큰 문제로 대두되고 있다.
수술시 허혈-재관류 손상이 심할 경우에는 수술 후 간부전이 유발되어 유병율과 사망률이 증가한다.
허혈-재관류 손상을 줄이기 위한 많은 방법이 제시 되고 연구가 계속되고 있으나 아직 결정적으로 예 방하거나 치료하는 방법은 개발되지 않았으며 더욱 중요한 문제는 정확한 원인과 손상 기전이 확실히 밝혀지지 않았다는 사실이다.
허혈-재관류 손상과 가장 밀접한 관계가 있다고 생각되는 요소에는 산소유리기(oxygen free radi- cal)를 들고 있다. 발생기전으로는 산소유리기에 의 한 세포괴사가 중요 기전이라고 하였으나,1,2최근 연
구에 의하면 간의 허혈-재관류 손상의 기전에 있어 서 apoptosis가 중요한 역할을 한다고 보고되고 있 다.3동물실험으로도 허혈-재관류 손상이 유발된 간 에서의 apoptosis가 증가한다는 연구결과가 발표되 고 있다.4 백서에서 허혈-재관류 손상을 유발한 뒤 재관류 시간의 경과와 apoptosis가 상관 관계가 있 는지 관찰하여 허혈-재관류 손상의 기전을 이해하 기 위해 본 연구를 시행하였다.
대상 및 방법 1. 대상
몸무게 200-250g의 Sprague-Dawley 백서 암컷을 사용하였으며 각 실험군에 따라 4마리씩 사용하였 다.
2. 방법
1) 허혈-재관류 손상 유도
백서를 ketamine hydrochloride 100 mg/kg와 Fig. 2 Another site of Fig. 1. Apoptotic cells were scarcely discovered comparing with Fig. 1. However, the damages of cytoplasm were more severe than those of Fig. 1. A is x60 and B is x300 magnification.
Fig. 1 Light microscopic view of rat liver. The liver tissue was taken at the time of 24 hour after 60 minutes ischemia injury. The staining method was TUNEL assay and the dark brown colors presented apoptosis.
Two groups of cluster of apoptotic cell and some cytoplasmic damages were observed. Counter staining was H&E. A is x60 and B is x300 magnification.
A
B A
B
xylazine 25 mg/kg의 혼합제를 근육주사 하여 마취 하였다. 마취가 된 백서는 전기 털깍기를 이용하여 복부의 털을 제거하였고 복부를 알코올로 소독하고 정중 절개하였다. 간을 노출하고 간 주위의 인대를 제거한 후 간의 좌, 우 중앙엽의 간 동맥과 간 문맥, 담도관을 일회용 혈관 겸자를 이용하여 60분간 허 혈-재관류 손상을 주었다. 허혈 기간이 지난 후에는 허혈-재관류 손상을 받은 좌, 우 중앙엽과 손상을 받지 않은 나머지 부분에서 각각 간 조직을 일정 재 관류 기간이 지난 후 얻었다. 재관류 기간 후 얻는 간 조직은 허혈 손상 직후, 재관류 1시간, 재관류 3 시간, 6시간, 24시간 등 5개의 시간대로 나누어 백 서를 희생하여 얻었으며 간 조직은 얻은 직후 4%
paraformaldehyde(PFA)에 고정하였다.
2) 조직 고정
간 조직은 적출 즉시 4% PFA에 임시 고정한 후 paraffin을 이용하여 영구 고정하였다. 먼저 임시 고 정된 조직은 표시된 조직캡슐에 얇게 잘라서 넣고 phosphate-buffered saline(PBS)로 10분씩 두 번 정 도 씻어서 PFA를 제거해 주었다. 이후 조직의 물기 를 완전히 제거한 후 50% ethanol 60분으로 시작하 여 100% ethanol 35분까지 ethanol의 농도를 점차 증가시키며 탈수시켰다. 이후 조직에 paraffin이 잘 침투될 수 있도록 zylene에 담구었다. 처음에는 ethanol과 zylene이 3:1로 혼합된 용액에 10분간 넣 어두고 이후 점차 zylene의 농도를 올려서 나중에는 순수 zylene에 10분간 넣어두었다. 그후 zylene과 paraffin을 3:1로 혼합한 용액에 20분간 두는 것을
시작으로 나중에는 순수 paraffin으로 고정하였다.
순수 paraffin을 배양기안에서 틀에 부어넣고 캡슐 안의 조직을 꺼내서 잘린 면이 밑으로 향하도록 놓 은 후 ice box안에 넣고 핀셋으로 눌러 고정시켰다.
고정된 paraffin 위에 그물망을 덮어 흔들리지 않게 -4℃ 냉장고에 넣어둔 후 조직 절편기로 잘랐다.
3) TUNEL 염색
paraffin에 고정된 조직은 4㎜의 두께로 조직 절편 을 만들어 histochemistry kit(ApotagTM Oncor, Gaithersburg, MD)을 이용하여 apoptosis의 정도를 Fig. 3 Light microscopic view of rat liver with
TUNEL staining. Non-injured lobe of 24 hr ischemia-reperfusion injury group. No apoptotic cell was observed.
Fig. 4 Light microscopic view of rat liver with TUNEL staining. Non-injured lobe of just after ischemia(A), 1 hour after ischemic injury and 6 hour after ischemic injury.
Dark brown staining of apoptotic cell was not observed.
A
B
C
검사하였다. 잘라져서 slide에 고정된 조직은 xylene 용액을 이용하여 deparaffin시키고 ethanol 을 이용하여 탈수를 시켰다. 이후 20 g/mL pro- teinase K로 25℃에서 15분간 분해시켰다. 이후 증 류수로 세번 씻어낸 후 digoxigenin-uridine-5’- triphosphate가 담긴 apotag equilibration 완충액에 2분간 반응시켰다. 검체를 37℃ humid chamber에 서 60분간 terminal deoxynucleotidyle transferase 로 처리한 후 3번 더 증류수로 씻어내고 3% hydro- gen peroxide로 5분간 처리하였다. 다음에 2번 PBS 로 씻어낸 후 anti-digoxigenin-peroxidase와 30분 간 반응시켰다. 배경 염색은 HE staining으로 실시 하였고 apoptosis 유무를 현미경으로 관찰하였다.
결과
1. 재관류 후 24시간 후의 변화
허혈-재관류 손상을 주고 24시간만에 얻은 조직을 관찰해 보면 손상을 준 군과 손상을 받지 않은 군에 서 현저한 차이를 보였다. 손상을 주지 않은 부분의 간은 apoptosis가 관찰되지 않았다.(Fig.3) 반면에 손상을 받은 부분의 간에서는 군락을 이루는 apop- tosis와 세포질이 파괴된 듯한 양상이 관찰되었다 (Fig.1 & 2). apoptosis가 다발성으로 발생한 군락
의 형태도 많은 apoptosis 세포핵이 염색되어있는 형태(Fig.1)와 세포핵보다는 세포질의 손상이 다발 성으로 발생한 듯한 양상(Fig.2)을 보이는 군락 등 다소 차이가 있어 보였다.
허혈-재관류 손상을 받은 실험군에서 많게는 3-4 개, 적게는 1-2개의 이러한 군락이 있는 모습이 발 견되었고 손상을 받지 않은 대조군에서는 apoptot- ic cell이 거의 염색되지 않았다. 개복만 했다가 허 혈 시간이 지난 후 다시 복부를 닫아주고 24시간이 경과한 후 간을 채취해 염색한 조직에서도 마찬가 지로 apoptosis가 거의 발생한 소견을 발견할 수 없 었다.
2. 허혈-재관류 손상을 받지 않은 군에서의 초 기 변화
허혈-재관류 손상을 받지 않은 군에서는 초기 허 혈 시간인 60분이 지나고 바로 검체를 채취한 군 (Fig.4 A), 재관류 1시간 군(Fig.4 B), 재관류 6시간 군(Fig.4 C)까지의 모든 군에서 거의 apoptotic cell 을 관찰할 수 없었다. 자료가 제시되지는 않았지만 재관류 3시간 군에서도 apoptotic cell은 관찰되지 않았다. 시간대 별로 보면 시간의 경과와 apoptotic cell의 존재 여부는 전혀 관계가 없었다.
3. 허혈-재관류 손상을 받은 군에서의 초기 변화 Fig. 5 Light microscopic view of rat liver with TUNEL staining. One apoptotic cell was observed just after ischemia-reperfusion injury(A) and 1 hour after ischemia- reperfusion injury(B). In 6 hour ischemia- reperfusion injury group, some cluster of apoptotic cells were observed.
A
C
B
허혈-재관류 손상을 준 군에서는 허혈 기간 직후 (Fig.5 A), 재관류 1시간(Fig.5 B), 재관류 6시간 (Fig.5 C) 모든 군에서 apoptotic cell이 관찰되기는 하였으나 24시간이 지난 군에 비해서는 드물게 관 찰되었다. 허혈 시간이 지난 후 바로 채취한 검체에 서보다 재관류 시간이 증가할수록 apoptotic cell의 숫자는 다소 증가하는 양상이었다. 하지만 군락을 이루며 apoptosis가 일어나는 양상을 보인 부분은 없었으며 apoptosis가 보인 세포 역시 전부 간 내의 간세포나 내피세포는 아니었고 간내 침윤한 림프구 등도 상당히 존재하는 것으로 보였다. 재관류 후 6 시간이 지난 검체에서는 일부 apoptosis의 작은 군 락을 이루는 부분이 보였으나(Fig.5 C) 전체적으로 는 간헐적 apoptosis가 보이는 양상이었다. 전체적 으로 초기의 허혈-재관류 손상군에서는 24시간대만 큼 확연한 차이는 아니었어도 손상을 받지 않은 대 조군에 비해 더 많은 apoptosis를 발견할 수 있었 다. 3시간대의 군에서는 위의 특징에 반하는 점이 없었다.(자료 제시되지 않음).
고찰
본 실험의 결과에 의하면 허혈-재관류 손상 뒤에 오는 apoptosis는 손상 후 24시간이 지나면서 확연 해지는 양상을 보였다. 재관류 손상 후 몇 시간 내 에서도 apoptosis가 일부 관찰되고 시간의 경과에 따라 증가하는 양상을 보였지만 군락을 이루며 apoptosis가 일어나는 것은 24시간이 지난 경우에 만 관찰되었다.
세포의 손상 과정에는 세포괴사(necrosis)와 apoptosis가 있다. 간세포에서의 허혈-재관류 손상 에서 세포괴사는 주로 손상 초기 3시간 내에 가장 많이 일어나고5 apoptosis로 표현되는 세포손상은 재관류 손상이후 3시간이 지나면서 더 많이 발생하 는 것으로 알려져 있다.4,6,7하지만 심근세포 등을 이 용한 일부 실험에서는 세포괴사가 일어나기 전에 apoptosis가 먼저 일어난다는 보고8도 있기 때문에 이러한 차이가 장기별 차이인지 손상의 형태에 따 른 차이인지 좀더 연구해 보아야 할 것으로 생각된 다. 무엇이 먼저 일어났던 간에 두 손상이 일어나는 시간이 차이가 생기는 것으로 볼 때 세포 손상 과정 에서 괴사와 apoptosis의 발생기전은 다르며 이는
세포괴사는 세포손상과정이고 apoptosis는 조직 손 상 복구 과정에서 일어나는 체내 적응의 결과라고 생각된다.9 따라서 재관류 24시간 이후의 조직 표 본에서 보였던 apoptosis 주변의 세포손상은 섬유 화 등의 손상 복구 결과라 생각되며 간 재생으로 가 지 못하고 간 경화로 가는 병리학적 기전과 밀접한 관계가 있을 것으로 생각된다.
간에서 apoptosis는 간 경화로 가는 과정으로만 생각할 수는 없다. 간세포의 악성종양으로의 발전 을 막기 위한 주요한 생체 방어기전이 apoptosis 유 발로 알려져 있다.11∼13 간 세포암의 유발인자가 산 소 유리기이고 apoptosis의 유발은 산소유리기에 의한 세포 손상과 관계 있기 때문에1 여기서도 apoptosis는 산소 유리기에 대한 생체 보상 작용의 하나라는 것을 알 수 있다.13 섬유화는 손상에 대한 치유과정의 부작용으로 유발되는 것이 아닌가 생각 된다.
허혈-재관류 손상에 의한 apoptosis의 유발은 간 조직 외에도 신경조직,14심근8등에서 발견되며 장기 이식 후에도 많이 관찰되어 간이나3 신장이식 후에 도 apoptosis가 관찰된다.7,15∼17
허혈-재관류 손상의 기전에 가장 중요한 역할을 하는 것은 산소 유리기이다.1,2,5 간에서 산소 유리기 를 내는 주요 세포로는 내피세포(endothelial cell)7,18Kupffer cell,19활성화된 간세포20등을 들 수 있고 이들 산소 유리기가 직접손상의 원인으로 세 포 괴사 등을 유도하는 것으로 알려지고 있다.21또 한 산소 유리기 등과 더불어 유리되는 각종 세포 손 상 매개체는 염증반응을 유도하여 면역반응 세포가 등장하게 하여 간세포의 apoptosis를 유발한다.11 간 손상에서의 주요 염증반응세포인 호중구(neu- trophil)와 유착물질(adhesion molecule)에 의해 매 개된 손상기전은 내피세포를 자극하여 세포 매개성 apoptosis가 일어나게 한다.2
apoptosis는 간이나 신장 등 각종 장기이식에서 만성 거부와 연관하여 밀접한 관련이 있다. 심장이 식 등에 있어서도 급성 거부반응과 apoptosis는 관 계가 없지만 만성 거부반응의 진행과 apoptosis는 밀접한 관계가 있다.22 그러므로 apoptosis는 만성 적 경과를 보이는 손상과정에서 발생하는 것이다.
간이식에서 만성 거부는 간 경화와 매우 유사한 양
상이고 신장에서도 섬유화가 만성 거부의 주요 특 성으로 알려지고 있기 때문에 apoptosis의 발현, 만 성 거부, 섬유화, 간 경화 등은 다 같은 맥락의 발생 기전을 갖고 있다고 볼 수 있다. 본 실험에서 24시 간이 지난 후에 집중적으로 apoptosis가 일어난 군 락은 이 부분이 만성적으로 진행하여 섬유화 등이 심화되고 궁극적으로 간 경화가 발생하는 시발점이 될 수 있지 않을 까 하는 가정은 이러한 소견을 바 탕으로 한다. 현미경 소견상 이들 부분은 apoptotic cell이 염색되는 것 외에도 세포질이 파괴되어 있는 듯한 양상을 보였다. 이를 확인하기 위해서는 차후 연구에서 섬유화와 관계 있는 TGF- 나 각종 세포외 기질 등의 염색이 필요할 것으로 생각된다. 여러 연 구에서 apoptosis가 활발히 일어난 조직 내에서 TGF- 의 증가가 보였다.23
허혈-재관류 손상 뒤에 apoptosis가 증가하는 것 은 여러 보고에서 이미 익히 알 수 있었지만 특정 지역에서 집단적으로 apoptosis가 오고 군락을 이 루는 양상으로 관찰된다는 보고는 없었는데 본 연 구에서와 같은 군락이 관찰되는 것은 상당히 흥미 있는 결과라 하겠다. 이는 만성적 손상에 의한 섬유 화와 간 경화의 진행이 어는 시점이나 지점에서 촉 발되고 주변으로 퍼져나가는 양상으로 진행될 수 있는 가능성을 암시한다고 생각된다. 허혈-재관류 후에 apoptosis가 오는 과정은 알코올 손상에 의한 간세포 손상의 기전과 매우 유사하다. 알코올에 의 한 손상도 만성적 손상이며 면역학적 손상기전과 밀접한 관계를 갖으며 apoptosis가 관찰되는 유사 점을 갖고 있다.9,16 만성 간염 이나 알코올 손상이 나 허혈-재관류 손상에서 apoptosis는 급성 손상보 다 만성적 섬유화 등에 관계 있다는 판단을 하게 한 다. 이는 두 가지 점에서 중요한데 첫째로 치명적이 지 않은 지속적 손상기전 모두가 apoptosis와 관계 있을 가능성이 있기 때문에 apoptosis를 방지하거 나 줄여줄 수 있다면 간 경화 등을 예방할 수 있지 않을까 하는 치료적 측면이고 둘째의 의미는 apop- tosis가 간 경화 등으로 가는 과정의 초기 반응이라 면 진단적인 가치가 있지 않겠느냐는 것이다. 간이 나 신장 이식에서의 초기 허혈-재관류 손상이 만성 거부를 유발하는데 중요한 역할을 할 가능성이 있 다면 초기 장기 부전이 오지 않기만 하면 손상의 유
무가 무시될 수 있다는 생각을 바꾸어야 할 것이다.
또한 허혈-재관류 손상에서 만성 거부사이의 기전 이 규명되면 만성 거부의 발생기전도 규명될 수 있 을 것이고 이에 의해 만성거부에 대한 치료방침을 결정하는데도 매우 유용할 것이다.
세포에서 apoptosis는 세포 매개성 손상에 의하며 면역세포들인 호중구 등 림프구에 의해 정보가 전 달 된 다 . 가 장 유 력 시 되 는 정 보 전 달 과 정 은 Fas/FasL를 거치는 정보전달이라 주장되고 있고8,10 그들 주장에 의하면 산소 유리기에 의한 세포의 직 접 손상과 apoptosis는 관계가 없다는 것이다. 다만 앞에서 기술한 바와 같이 산소 유리기에서 유도되 기 시작한 염증과정은 면역 반응 과정의 유도와 함 께 apoptosis를 증가시키는데 중요한 역할을 할 것 으로 생각된다.1그런데 일부 연구에 의하면 Fas 표 면항원이 apoptosis가 일어나는 조직에서 증가하지 않는다는 보고23가 있고 apoptosis의 정보를 전달하 는 것은 TNF- 에 의한 경로라는 주장19이 있는 등 아 직까지 정확한 정보 전달 경로는 밝혀져 있지 않고 이 경로를 밝히는 것은 허혈-재관류 손상의 기전을 규명하는데 중요한 열쇠가 될 것으로 생각된다.
허혈-재관류 손상을 받은 모든 간세포가 apopto- sis로 가지는 않는다. 손상이 발생하였을 때 재생이 될 것인지 apoptosis로 갈 것인지 결정하는 것은 세 포내의 전달물질이다. Schlossberg등에 의하면6 이 에 관계가 깊은 물질은 c-fos 와 c-jun으로 이들 둘 이 모두 발현하면 재생이 되지만 c-jun만이 발현되 면 apoptosis가 된다고 주장하였다. c-fos와 c-jun 같은 초기 반응 유전자와 관계되어 흥미로운 것은 지방간에서 이들 유전자의 유도가 느려지고 따라서 복구에 참여할 후기 유전자의 발현이 늦어져 허혈- 재관류 손상에 대해 약해지고 apoptosis도 증가한 다는 연구 결과이다.24 결국 유전자 변화와 허혈-재 관류에 대한 손상 정도 그리고 apoptosis의 발현이 밀접한 관계를 갖는다는 것을 알 수 있다. 이외 apoptosis를 유발하는데 관계 있다고 알려진 bcl-2, myc등의 유전자도 관계가 있을 것으로 생각된다.11 현재 허혈-재관류 손상 뒤에 세포의 apoptosis를 유 발할 정보를 결정적으로 전달하는 물질이 무엇인지 확실하지 않았지만 이 물질의 규명 역시 허혈-재관 류 손상의 기전을 밝히는데 많은 도움이 될 것이다.
apoptosis를 감별하는 검사 법으로는 현재 가장 많 이 사용되는 것이 TUNEL 염색법이다.23,25 일부보고 에서 TUNEL염색법의 감별력에 대해 회의적이라는 연구결과가 있기는 하지만26 대부분의 연구에서 apoptosis를 감별하는데 편리하고 효과적인 방법으 로 TUNEL법을 들고 있고 본 연구에서도 TUNEL 염 색법에 의해 apoptosis를 관찰하였다. 다만 이 방법 은 apoptosis를 정량화 하는데는 다소 어려움이 있고 형태학적 최종 감별이 되지 않는다는 약점이 있기 때 문에 TUNEL 염색법과 더불어 전자 현미경 소견이나 flow cytometry등으로 보완을 하는 것이 더욱 정확 한 양상을 알 수 있게 하는 방법으로 생각된다.11
본 실험에서는 대조군을 허혈-재관류 손상을 받은 백서의 손상을 받지 않은 부분의 간 조직으로 하였 다. 이들 대조군에서는 apoptosis를 발견할 수 없었 다. 이는 직접적인 허혈-재관류 손상을 받은 간 외 에 폐 등에서 초기의 산소 유리기나 cytokine의 증 가나 세포괴사를 볼 수 있었다는 보고에 반하는 결 과이다.5 결국 이러한 차이는 세포괴사의 경우에는 전신적인 손상 진행을 보이는데 이는 cytokine이나 산소 유리기에 의한 전신 작용으로 생각되며, apoptosis를 유발하는 요인은 손상 받은 간 조직 내 에서 세포 매개성으로 일어나는 국소적 손상 진행 이기 때문이 아닌가 한다.
결론적으로 apoptosis가 허혈-재관류 손상을 받은 조직에서만 관찰되고 손상 받지 않은 조직에서는 관찰되지 않았다는 점에서 허혈-재관류 손상과 apoptosis는 밀접한 관계가 있다는 것을 알 수 있었 다. apoptosis가 손상 초기 보다 어느 정도 시간이 지난 후에 발생하는 것으로 볼 때 허혈-재관류 손상 과 apoptosis의 진행은 만성적 손상의 과정이 아닌 가 생각된다. 간의 허혈-재관류 손상의 결과로 일어 나는 세포괴사와 apoptosis는 서로 다른 발생기전 에 의한 것으로 사료되며 섬유화와 간 경화 등의 만 성적 손상과 apoptosis의 직접적인 관계를 밝혀내 려면 TGF- , 세포외 기질 등이 조사 등 보다 연구와 실험이 필요할 것이다.
요약 연
연구구배배경경 : 허혈-재관류 손상은 간 절제와 간이식 에서 수술 후 간 기능 부전의 주요 원인이다. 이 손
상을 유발하는 요소는 산소 유리기에 의한 세포 괴 사로 알려지고는 있으나 정확한 원인과 손상 기전은 밝혀지고 있지 않다. 최근에는 apoptosis의 유발과 허혈-재관류 손상의 연관에 대해 많이 연구되고 있 다. 세포괴사와 apoptosis는 세포 손상에 대한 세포 의 두 가지 반응으로 어느 쪽으로 세포 파괴가 진행 되느냐에 따라 신체 반응은 매우 다르게 나타난다.
apoptosis에 의한 세포 손상은 만성적 기능 부전과 밀접한 연관이 있을 것으로 생각되며 초기 손상이 만성화되는 기전으로 생각되고 있다. 본 연구에서는 허혈-재관류 손상을 입은 백서의 간에서 허혈-재관 류 손상과 apoptosis와의 관계를 밝히고자 하였다.
방
방법법 : 200 - 250g 사이의 Splague-Dawley 백서를 이용하여 간의 일부에 60분간의 허혈 기간 이후 허 혈 직후, 재관류 1시간, 3시간, 6시간, 24시간에 손 상을 입은 간엽과 손상을 입지 않은 간엽을 얻어서 이들 간 조직에서 apoptosis의 발현 양상을 관찰하 였다. 이들 5개의 군에 각각 4마리씩의 백서를 사용 하였다. apoptosis는 TUNEL assay로 조직을 염색 하고 H&E 염색법으로 대조 염색하여 광학 현미경 으로 관찰하였다.
결
결과과 : 재관류 손상을 입고 24시간이 지난 백서 군 에서 가장 확실한 apoptosis소견이 보였다. 이 시간 대에서는 apoptosis가 군락을 이루며 형성되었다.
나머지 시간대에서는 간헐적인 apoptosis 염색이 관찰되기는 하였지만 24시간 군과 같은 군락을 이 루는 것은 관찰되지 않았다. 허혈-재관류 손상을 받 지 않은 모든 군에서 apoptosis는 관찰되지 않았다.
결
결론론 : 허혈-재관류 손상과 apoptosis는 밀접한 관 계가 있으며 초기 손상보다는 시간이 지난 후의 손 상과 관계 있는 것으로 사료된다. 손상 부위가 군락 을 이루는 형태에서 볼 때 이 부분이 간에서 만성적 인 섬유화나 다른 손상의 원인이 될 수 있다고 보며 섬 유 화 를 유 도 하 는 TGF- 나 세 포 외 기 질 (Extracellular Matrix)등의 발현 양상 등의 연구가 필 요하며 장기적으로는 이러한 손상 부위가 어떻게 발 전하는지 관찰하는 것이 필요할 것으로 사료된다.
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