Received on August 25, 2012. Revised on October 30, 2012. Accepted on October 31, 2012 Correspondence to: Duck Cho
Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School & Chonnam National University Hwasun Hospital, 160 Ilsimri, Hwasun-eup, Hwasun 519-809, Korea
Tel: 82-61-379-7951, Fax: 82-61-379-7984, E-mail: [email protected]
Original Article
PCRㆍ직접염기서열분석법에 의한 ABO 유전형검사 6년 경험
원은정ㆍ조 덕ㆍ허민석ㆍ박혜련ㆍ신명근ㆍ양동욱
전남대학교 의과대학 진단검사의학교실
Six Years’ Experience Performing ABO Genotyping by PCR-direct Sequencing
Eun Jeong Won, Duck Cho, Min Seok Heo, Hye Ryoen Park, Myung Geun Shin, Dong Wook Ryang
Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea
Background: ABO genotyping is essential for resolving ABO grouping discrepancy and for determinating ABO subgroups. Most clinical samples, including suspected inherited subgroups and acquired variant phenotypes, can be determined by PCR-sequencing of exons 6 and 7 in the ABO gene. Here, we describe our six years' experience performing ABO genotyping by PCR-direct sequencing.
Methods: We conducted a retrospective investigation of serological and genotypical data from 205 samples (158 patients and 47 of their family members) of patients who were referred to the Molecular Genetics Laboratory at Chonnam National University Hwasun Hospital for ABO genotyping between January 2007 and July 2012. ABO genotyping was performed on all samples with PCR-direct sequencing of exons 6 and 7 in the ABO gene; the standard serologic tests were also performed.
Results: The frequency of phenotypes consistent with their genotypes was 70.8% (112/158 cases) and the A2B3 phenotype with the cis-AB01 allele was the most common (31.0%, 49 cases) among them. The frequency of pheno- types inconsistent with their genotypes was 29.1% (46/158 cases) and the A1B3 phenotype was the most frequently recovered case (5.1%, 8 cases). Family study showed differential phenotype expression depending on the co-inherited ABO allele in five families with the B306, cis-AB01, Ael02, Aw14, or B305 allele and also showed a typical inheritance of a chimera with A102/B101/O04.
Conclusion: We propose that ABO genotyping using PCR-direct sequencing is useful for the resolution of ABO discrepancies and for the investigation of ABO subgroups based on six years' experience. In addition, family study for analysis of phenotypic patterns of ABO subgroups is also crucial to ABO genotyping. (Korean J Blood Transfus 2012;23:236-247)
Key words: ABO genotyping, PCR-direct sequencing, ABO discrepancies, ABO subgroups, Family study
서 론
ABO 혈액형은 수혈 시 가장 중요한 혈액형이 다.
1)안전한 수혈을 위해 정확한 ABO 혈액형 검 사가 필수적인데, 대부분 혈청학적 검사법을 이 용한다. 신생아와 같은 특별한 경우를 제외하면 혈구형 검사와 혈청형 검사를 함께 실시하여 두 가지 검사결과가 일치한 경우에 ABO 혈액형을 결정한다. 그런데, 간혹 혈구형과 혈청형 검사 결 과가 일치하지 않는 경우가 있다. 이를 ‘ABO 불 일치’라고 정의하는데, 다양한 원인에 의해 발생 할 수 있다. 기술적인 원인, 혈구측 원인 및 혈청 측 원인으로 분류할 수 있다.
1,2)만약, 이러한
‘ABO 불일치’ 사례가 발견되면 정확한 ABO 혈 액형을 결정하기 위해 임상정보 수집을 비롯하여 추가검사들을 실시한다. 그러한 검사들은 흡착 및 해리시험, 타액검사, A 또는 B 전이효소검사 (transferase test), 가계조사 등인데, 최근에는 분자 생물학적 기법의 개발로 간편하게 ABO 유전형 검사가 널리 사용되는 추세이다.
현재 국내ㆍ외 여러 기관에서 사용되고 있는 ABO 유전형 검사로는 대립유전자 특이중합효소 연쇄반응(AS-PCR), 중합효소연쇄반응-제한절편 길이 다형성(PCR-RFLP), pyrosequencing, real-time PCR 그리고 직접염기서열분석법 등이 있다.
3-9)전남대학교병원은 2001년에 내원한 cis-AB형 환 자와 그 가족 중 19 검체를 PCR-RFLP법으로, 2004년부터 2005년에는 ABO 불일치 46 검체를 AS-PCR법으로 ABO 유전형검사를 실시하였고, 일부는 직접염기서열분석을 실시하였다.
2,6)그런 데, AS-PCR법은 ABO 불일치의 해결에는 유용하 지만 새로운 ABO 아형의 규명에는 적합하지 않 았다. 따라서, 2007년 이후부터는 PCR-RFLP법이 나 AS-PCR법을 시행하지 않고, PCR-직접염기서 열분석법으로 ABO 유전형검사를 실시하였다.
저자들은 본 논문에서 전남대병원, 화순전남대병 원 및 여러 의료기관에서 의뢰한 검체로 6년간의 PCR-직접염기서열분석법으로 ABO 유전형 검사 를 시행한 경험들을 후향적으로 분석하여 보고하 는 바이다.
재료 및 방법
1. 대상
본 연구는 2007년 1월부터 2012년 7월 사이에 화순전남대학교병원에 의뢰된 205 검체(환자 158 명, 가족 47명의 검체)의 ABO 유전자검사 결과를 후향적인 분석을 통하여 실시하였다. 가계도 조 사는 17명의 환자 가족들을 대상으로 시행하였으 며 혈청학적 검사 및 ABO 유전자 검사는 환자 검체와 동일하게 이루어졌다.
2. ABO 혈액형의 혈청학적 검사
ABO 혈액형의 혈청학적 검사는 표준 튜브법 으로 시행하였다.
10)혈구형 검사는 anti-A, anti-B (Bioscot, Livingston, UK), anti-AB, anti-H (Biotest, Dreieich, Germany), anti-Lection A1 (Medion Dia- gnostics AG, Dudingen, Switzerland)을 사용하였 다. 혈청형 검사는 자가제조한 혈구 혹은 상품화 A1 적혈구, B 적혈구(Daimed, Cressier sur Morat, Switzerland)를 사용하였다.
3. PCR-직접염기서열분석법에 의한 ABO 유전형 검사
ABO 유전자 검사는 Cho 등이 보고한 방법으로 엑손 6과 7의 직접염기서열분석에 의해 실시하였
다.
11,12)EDTA-CBC에서 DNA를 Wizard Genomic
DNA purification kit (Promega, Madison, USA)로
DNA를 추출하였다. PCR은 엑손 6과 7에 대한 시
Fig. 1. Schematic illustration describe ABO genotyping using PCR-direct sequencing of exon 6 and 7 in ABO gene.
발체인 ABOe6F와 ABOe7R 시발체 쌍으로 엑손 6, 인트론 6, 엑손 7을 모두 포함하는 2,080 bp의 증폭산물을 얻었다. PCR 산물은 Qiaquick gel ex- traction kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 설명서대로 정제하였다. 염기서열분석을 위한 시 발체인 ABOe6R, ABOe7F, ABOe7SF1 그리고 ABOe7SF2를 사용하였다(Fig. 1). 염기서열분석 과정은 형광 dNTP가 들어있는 Big dye Termina- tor cycle sequencing kit (Perkin Elmer/Applied Bio- systems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 설명 서대로 PCR 증폭한 후 ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Perkin Elmer/Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 염기서열을 자동분석하였다. ABO
혈액형의 유전형은 SEQUENCHER (Gene Codes Corp, Ann Arbor, MI, USA) software를 사용하여 표준 A101 allele와 비교 분석하여 판독하였다.
4. ABO 대립유전자의 분류 및 명칭
ABO 대립유전자의 종류와 명명은 혈액형 유
전자 돌연변이에 대한 web상의 자료인 blood
group antigen gene mutation database에서 인용했
다.
13)Aw, Bw의 w는 weak의 약자이고, O02var,
O04var, Bvar의 var는 variant의 약자로 이는 새로운 변이형이지만 blood group antigen gene muta-
tion database에 정식으로 아직 등록되지 않은 경
우를 표시한 것이다. AmfBmf, Bmf의 mf는 mixed
field agglutination의 약자이다.
결 과
Table 1에 의뢰된 검체의 표현형, 유전형, anti-A, anti-B, anti-A1, anti-AB, anti-H를 활용한 혈구형 그 리고 A cells, B cells을 활용한 혈청형을 정리하였 다. 표현형이 혈구형과 혈청형이 불일치한 경우는 혈구형을 기준으로 정리하였다. 이들 검체를 크게 2가지로 분류하였는데, ABO 유전형 분석을 통해 의뢰된 검체의 표현형을 설명할 수 있는 경우 ‘표 현형과 유전형이 일치한 경우’로 분류하였고, 설 명할 수 없는 경우를 ‘표현형과 유전형 불일치한 경우’로 분류하였다. 예로 B3 표현형을 갖지만 유 전형분석에서 B301이 아닌 B101을 갖는 경우이다.
1. 표현형과 유전형의 일치
ABO 유전형 검사가 의뢰된 총 158 검체 중 112건(70.8%)은 ‘표현형과 유전형이 일치한 경 우’로 분류하였다. 분류된 검체 중 A2B3형이 49 건(31.0%)으로 가장 높은 빈도를 보였는데, 이들 은 모두 cis-AB01과 각종 O 대립유전자 쌍의 유전 형을 보였다. 다음으로 A형(n=21), B형(n=14), AB 형(n=8), O형(n=6) 순서로 정상 표현형을 갖은 혈 액형의 빈도가 높았는데, 이들의 90.7% (49/54)는 표현형과 연관된 한국인에 흔한 대립유전자 쌍의 유전형이었다. 그런데, O 대립유전자는 O01, O02 이외에도 O02var, O04, O04var, O07 대립유전자 도 존재하였다.
그 외에 약해진 표현형을 보이는 A1B3가 4건 (2.5%), A2B가 3건(1.9%), AwB가 2건(1.3%), A1Bw, A1Bx, A1Bel, AintB3, AelB, Aw가 각각 1건씩 (0.6%)을 차지하였는데, 이들은 모두 ABO 아형 에 특이한 Ael02, B306, Bvar, Aw10 2건(1.3%),
Aw14 등을 동반하였고 표현형에 따른 유전형의 결과는 Table 1에 정리하였다(Table 1).
2. 표현형과 유전형의 불일치
표현형과 유전형이 일치하지 않은 경우는 158 건 중 46건(29.1%)이었다. 약해진 표현형 원인 규 명을 위해 ABO 유전형 검사가 의뢰되었지만 그 유전적 원인을 ABO 유전자 엑손 6과 7의 분석을 통해 밝힐 수 없었다. 표현형은 Aw (n=5), AwB (n=2), AintB (n=3), Aint (n=2)이었지만 A101 혹은
A102 대립유전자를 동반했으며, 표현형은 A1B3(n=8), B3 (n=6), Bw (n=5), A1Bw (n=1)를 보이면 서 B101 대립유전자를 동반하였다. 한편, 표현형 이 AwB (n=1)이면서 A 대립유전자는 발견되지 않는 B101/O01, 정상 A형(n=3)이지만 A102/B101,
cis-AB01/A102, 정상 B형(n=1)이지만 A102/B101,정상 O형(n=6)이지만 A102/B101, A102/O01, B305/
O01, Ael02/O01을 보인 경우가 있었다. 표현형이
AmfBmf (n=1)였으며 유전형이 A102/B101/O04, 표현형이 AmfB (n=1)였으며 유전형이 A102/B101/
O01, 표현형이 Bmf였으며 유전형이 B101/O01/O02
인 경우가 각각 1건씩 있었으며 이들은 키메라 (chimera)였다. 표현형과 유전형의 구체적인 결과 는 Table 1에 정리하였다.
3. 가계조사
가계조사는 17명 가족에 대해 실시되었는데,
이 중 대표적인 6가족의 가족관계, 표현형 그리
고 유전형 결과를 Table 2에 정리하였다. 가족 1
은 엑손 7의 547 G＞A를 보인 B306을 가진 가족
이었다. B306은 A102와 동반되면 B3 표현형을 나
타냈지만, O01과 동반되면 정상 B형을 보여 대립
유전자 경쟁현상(allelic competition)이 관찰되었
다. 가족 2는 cis-AB01을 가진 가족인데, O 대립유
전자와 동반시에는 A2B3형인데, A102와 동반시
에는 정상적인 A형을 보였다.
14)가족 3은 A101과
Tabl e 1. P henot ypi c and genot ypi c charact eri st ic s of pat ie nt s enrol le d in t hi s st udy P hen otype * (N o./%) Gen otype an ti -A anti-B anti-A1 an ti-A B anti-H A ce ll B cel l Ref ere nce Ph enot yp es consi st ent w ith t hei r gen ot ypes (112/ 70. 8% ) A 2B 3 (49 /3 1. 0% ) Ci s- AB 01 /O 01 ( 32/ 20. 4% ) 3 ∼ 4 ＋ ＋ /− ∼ 4 ＋ − 2 ∼ 4 ＋ ＋ /− ∼ 4 ＋ − ∼＋ /− − ∼ 3 ＋ In t hi s st ud y Ci s- AB 01 /O 02 ( 14 /8. 9% ) 4 ＋ 1 ∼ 3 ＋ − 3 ∼ 4 ＋ 1 ∼ 4 ＋ − ∼＋ /− − ∼ 3 ＋ In t hi s st ud y C is- A B 01 /O 02var (1/ 0. 6% ) 4 ＋ 3 ＋ − 4 ＋ − − 1 ＋ [1 4] Ci s- AB 01 /O 04 (1/ 0. 6% ) 4 ＋ 2 ＋ − 4 ＋ 4 ＋ − 1 ＋ In t hi s st ud y C is- A B 01 /O 04var (1/ 0. 6% ) 4 ＋ 2 ＋ − 4 ＋ 4 ＋ − ＋ /− In t hi s st ud y A (2 1/ 13 .3 %) A10 2/ O 01 (9 /5 .7 % ) 4 ＋ − 4 ＋ 4 ＋ − ∼ 2 ＋ − ∼＋ /− − ∼ 4 ＋ In t hi s st ud y A10 2/ O 02 (7 /4 .5 % ) 4 ＋ − 3 ∼ 4 ＋ 3 ∼ 4 ＋ − ∼ 1 ＋ − ＋ /− ∼ 4 ＋ In t hi s st ud y A 102/ A 102 ( 4/ 2. 5% ) 4 ＋ − 4 ＋ 4 ＋ − ∼＋ /− − − ∼ 3 ＋ In t hi s st ud y A10 2/ O 07 (1 /0 .6 % ) 4 ＋ − 4 ＋ 4 ＋ ＋ /− 1 ＋ 4 ＋ In t hi s st ud y B (1 4/ 8. 9% ) B10 1/ O 02 (5 /3 .2 % ) − 4 ＋ − 3 ∼ 4 ＋ − ∼ 2 ＋ − ∼ 4 ＋ − In t hi s st ud y B10 1/ O 01 (4 /2 .6 % ) − 4 ＋ − 4 ＋ ＋ /− ∼ 2 ＋ 2 ∼ 4 ＋ − In t hi s st ud y B 101/ B 101 ( 3/ 1. 9% ) − 4 ＋ − 4 ＋ − ∼ 1 ＋ 2 ∼ 4 ＋ − In t hi s st ud y B10 1/ O 04 (1 /0 .6 % ) − 4 ＋ − 4 ＋ 1 ＋ 3 ＋ − In t hi s st ud y B10 2/ O 02 (1 /0 .6 % ) − 4 ＋ − 4 ＋ − − − In t hi s st ud y A B ( 8/ 5. 1% ) A 102/ B 101 ( 8/ 5. 1% )
†3 ∼ 4 ＋ 4 ＋ 2 ∼ 4 ＋ 3 ∼ 4 ＋ − ∼ 1 ＋ − − In t hi s st ud y O (6 /3 .8 %) O0 1/ O0 2 (6 /3 .8 % ) − − − − 2 ∼ 4 ＋ ＋ /− ∼ 4 ＋ 1 ∼ 4 ＋ In t hi s st ud y A1 B3 ( 4/ 2. 5% ) A 102/ B 306 ( 2/ 1. 3% ) 4 ＋ ＋ /− ∼ 1 ＋ 3 ∼ 4 ＋ 4 ＋ − ∼＋ /− − − In t hi s st ud y A 101/ B 306 ( 1/ 0. 6% ) 4 ＋ 1 ＋ 4 ＋ 4 ＋ 2 ＋ − − In t hi s st ud y A10 2/ B va r (1 /0. 6% ) 4 ＋ ＋ /− mf ＋ /− 4 ＋ − − − In t hi s st ud y A2 B (3 /1 .9 %) C is- A B 01 /B 10 1 (2/ 1. 3% ) 4 ＋ 4 ＋ − 4 ＋ ＋ /− ∼ 1 ＋ − ∼＋ /− − ∼＋ /− mf In t hi s st ud y Ci s- AB 01 /O 02 (1/ 0. 6% ) 4 ＋ 3 ＋ − 4 ＋ 3 ＋ − ＋ /− In t hi s st ud y A w B ( 2/ 1. 3% ) Aw 10 /B 10 1 (2 /1 .3 % ) ＋ /− 4 ＋ − 3 ∼ 4 ＋ 1 ∼ 2 ＋ ＋ /− ∼ 3 ＋ − In t hi s st ud y A 1B w ( 1/ 0. 6% ) C is- A B 01 /A 10 2 (1/ 0. 6% ) 4 ＋ − 3 ＋ 4 ＋ ＋ /− − 1 ＋ In t hi s st ud y A 1B x or el ( 1/ 0. 6% ) C is- A B 01 /A 10 2 (1/ 0. 6% )
†4 ＋ − 4 ＋ 4 ＋ ＋ /− − − In t hi s st ud y A int B 3 (1 /0. 6% ) C is- A B 01 /A 10 2 (1/ 0. 6% ) 4 ＋ mf 1 ＋ 4 ＋ 2 ＋ − 1 ＋ In t hi s st ud y A el B ( 1/ 0. 6% ) Ae l0 2/ B1 01 (1/ 0. 6% ) − 4 ＋ − 4 ＋ − ＋ /− − [1 5] Aw (1 /0 .6 %) Aw 14 /O 01 (1 /0 .6 % ) 1 ＋ − − 1 ＋ 3 ∼ 4 ＋ 2 ＋ − [1 6]
Tabl e 1. P henot ypi c and genot ypi c charact eri st ic s of pat ie nt s enrol le d in thi s st udy (cont inued) P hen otype * (N o./%) Gen otype an ti -A anti-B anti-A1 an ti-A B anti-H A ce ll B cel l Ref ere nce P hen otype s in con siste nt with the ir g enotyp es (4 6/29.1%) A1 B3 ( 8/ 5. 1% ) A 102/ B 101 ( 7/ 4. 5% ) 4 ＋ ＋ /− ∼ 2 ＋ 4 ＋ 4 ＋ − ∼ 2 ＋ − − In t hi s st ud y A 101/ B 101 (1 /0 .6 % ) 4 ＋ ＋ /− 3 ＋ 4 ＋ 1 ＋ − − In t hi s st ud y B3 ( 6/ 3. 8% ) B10 1/ O 01 (3 /1 .9 % ) − 1 ∼ 3 ＋ − ∼ 2 ＋ − ∼ 4 ＋ 2 ∼ 4 ＋ 4 ＋ − In t hi s st ud y B10 1/ O 02 (3 /1 .9 % ) − 1 ∼ 2 ＋ − 1 ∼ 2 ＋ 3 ∼ 4 ＋ 4 ＋ − In t hi s st ud y O (6 /3 .8 %) A 102/ B 101 (1 /0 .6 % )
†− − − − 2 ∼ 3 ＋ − − In t hi s st ud y A10 2/ O 01 (1 /0 .6 % ) − − − − 3 ＋ − 1 ＋ w In t hi s st ud y B30 5/ O 01 (1 /0 .6 % ) − − − − -
§− − [1 8] Ae l0 2/ O 01 (3/ 1. 9% ) − − − − 2 ∼ 4 ＋ − ∼＋ /− 1 ∼ 4 ＋ In t hi s st ud y Aw (5 /3 .2 %) A10 2/ O 01 (4 /2 .6 % ) ＋ /− ∼ 2 ＋ − − ∼ 1 ＋ ＋ /− ∼ 2 ＋ − ∼ 3 ＋ − 4 ＋ In t hi s st ud y A10 2/ O 02 (1 /0 .6 % )
†2 ＋ mf − − 2 ＋ 1 ＋ − 4 ＋ In t hi s st ud y B w ( 5/ 3. 2% ) B10 1/ O 01 (2 /1 .3 % ) − ＋ /− ∼ 1 ＋ − ＋ /− ∼ 1 ＋ 3 ＋ 4 ＋ − In t hi s st ud y A 101/ B 101 (1 /0 .6 % )
†− 2 ＋ − − 1 ＋∼ 2 ＋ − − In t hi s st ud y B10 1/ O 01 (1 /0 .6 % ) − 2 ＋ − 3 ＋ 4 ＋ 4 ＋ − In t hi s st ud y B10 1/ O 02 (1 /0 .6 % ) − 3 ＋ − 3 ＋ 4 ＋ 3 ＋ − In t hi s st ud y A w B ( 3/ 1. 9% ) A 102/ B 101 (2 /1 .3 % ) 1 ∼ 2 ＋ mf 4 ＋ − 4 ＋ 1 ＋ mf − ∼ 1 ＋ − In t hi s st ud y B10 1/ O 01 (1 /0 .6 % )
‡＋ /− mf 4 ＋ ＋ /− mf 4 ＋ 2 ＋ − − [2 9] Ai nt B (3 /1 .9 %) A 102/ B 101 (3 /1 .9 % ) 3 ∼ 4 ＋ 4 ＋ 1 ∼ 2 ＋ 3 ∼ 4 ＋ − ∼ 3 ＋ − − In t hi s st ud y A int ( 2/ 1. 3% ) A10 2/ O 01 (2 /1 .3 % ) 3 ∼ 4 ＋ − ＋ /− 3 ∼ 4 ＋ − ∼ 2 ＋ − mf ∼ 4 ＋ In t hi s st ud y A (3 /1 .9 %) A 102/ B 101 (1 /0 .6 % ) 4 ＋ − 4 ＋ 4 ＋ − − − In t hi s st ud y C is- A B 01 /A 10 2 (2/ 1. 3% ) 4 ＋ − 4 ＋ 4 ＋ − − 2 ∼ 4 ＋ In t hi s st ud y B (1 /0 .6 % ) A 102/ B 101 (1 /0 .6 % ) − 4 ＋ − 4 ＋ 1 ＋ − − In t hi s st ud y A 1B w ( 1/ 0. 6% ) A 102/ B 101 (1 /0 .6 % ) 4 ＋ 2 ＋ mf 2 ∼ 3 ＋ 4 ＋ − − − In t hi s st ud y A m fB m f (1 /0. 6% ) A 10 2/B 10 1/O 04 (1/ 0. 6% )
‡4 ＋ mf 4 ＋ mf -
§-
§-
§− − [1 7] A m fB ( 1/ 0. 6% ) A 10 2/B 10 1/O 01 (1/ 0. 6% )
‡mf 4 ＋ -
§-
§-
§− − [1 7] Bm f (1 /0 .6 % ) B 10 1/O 01 /O 02 (1/ 0. 6% )
‡− 4 ＋ mf -
§-
§-
§-
§-
§[3 0] *Ph eno ty pes of p atients wer e de te rmine d ba se d on t he AB O ce ll typing .
†Patients wer e diagnosed w it h MDS or A cute L eukem ia.
‡Ch imera case.
§U nkn own du e to in su fficien t data.
Table 2.
Phenotypic and genotypic characteristics of six representative cases in family studyFamily Relationship Phenotype Genotype Reference
Case 01 Propositus A1B3
A102/B306
In this studyMother A1
A102/O01
Son 1 B
B306/O01
Son 2 B
B306/O01
Case 02 Propositus A2B3
Cis-AB01/O02var
[14]Daughter 1 A1
A102/O02var
Daughter 2 A1
Cis-AB01/A102
Daughter 3 A1
A102/O02var
Case 03 Propositus Ael
Ael02/O01
[15]Husband B
B101/O01
Sibling Ael
Ael02/O01
Son 1 Ael
Ael02/O01
Son 2 Ael
Ael02/O01
Son 2 AelB
Ael02/B101
Case 04 Propositus Aw
Aw14/O01
[16]Wife B
B101/O01
Daughter 1 Aw
Aw14/O01
Daughter 2 B
Aw14/B101
Case 05 Propositus AmfBmf
A102/B101/O04
[17]Mother O
O02/O04
Father AB
A102/B101
Case 06 Propositus* O
B305/O01
[18]Mother A1B3
A102/B305
Father O
O01/O02
Grandmother A
A102/O02
Aunt B3
B305/O02
*7-day-old neonate.
비교할 때 467C＞T, 646T＞A 그리고 681G＞A 변이를 보인 Ael02를 가지고 Ael의 표현형을 가 진 가족이었다.
15)가족 4는 699 C＞A를 보여
Aw14로 명명된 대립유전자를 동반한 가족이었다.Aw14가 O01과 동반시에는 Aw형이지만, B101과
동반시에는 A항원이 전혀 검출되지 않아 대립유 전자 경쟁현상을 보였다.
16)가족 5는 아버지는 AB형, 어머니는 O형이었지만, 발단자는 ABO 혈 구형 검사에서 anti-A에도 혼합시야반응(mixed
field agglutination, mf)을 보이고, anti-B에도 혼합
시야반응을 보인 AmfBmf 표현형의 혈액형이었
다. 그런데, ABO 유전자의 직접염기서열분석, 클
로닝을 통해 A102, B101, O04를 동시에 가지고 있
는 키메라(chimera)를 의심하였고, 가족의 short
tandem repeats (STR) 검사로 확인하였다.
17)마지
막으로 가족 6은 B101과 비교할 때 425 T＞C가
관찰된 B305를 동반한 가족이었다. 발단자의 어
머니와 이모는 동반되는 대립유전자에 상관없이
B
3표현형을 보였는데, 7일 된 신생아 발단자는 비록 B305를 갖고 있지만 B항원이 전혀 검출되 지 않아 O형으로 표현되었다.
18)고 찰
본 연구는 최근 6년간 화순전남대병원, 전남대 병원 그리고 타 기관들에서 ABO 유전형 검사를 위해 의뢰된 검체 들의 ABO 유전형 결과와 의뢰 당시의 혈청학적 검사결과를 후향적으로 분석한 것이다.
ABO 유전형 검사는 9번 염색체 9q34에 위치하 는 ABO 유전자를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 등 분자유전학적인 기법으로 분석하여 ABO 유전형을 결정하는 검사이다. 이 러한 검사는 1990년대 초에 Yamamoto 등에 의해 처음 ABO 유전자 구조가 규명된 이후 가능하게
되었다.
19,20)ABO 유전자는 7개의 엑손으로 구성
되어 있는데, 이 중 엑손 6 및 7이 전체 엑손 염기 의 77.5%를 차지하며, A 및 B형 당전이 효소의 발현에 91%를 담당한다고 보고되었다.
10,16)따라 서, 직접염기서열분석법을 이용한 ABO 유전형 검사는 대부분 엑손 6과 7의 염기서열을 분석한 것이며, 본 연구팀도 이러한 방법을 사용하였다.
다만, 엑손 6과 7이 모두 포함되게 2,080 bp를 한 번에 증폭하고, 분석용 시발체는 4개를 사용하여 비용을 최소화하려고 하였다.
PCR-직접염기서열분석법으로 얻은 ABO 유전 자의 염기서열은 멘델의 유전법칙에 의해서 부모 에게서 각각 하나씩 받은 2개의 대립유전자 염기 서열이 중첩되어 있는 것이다. A101/B101 유전형 의 예를 들면, A101 대립유전자를 기준으로 비교 해 보면 B101 대립유전자는 7개의 염기(297, 526, 657, 703, 796, 803 및 930번)가 다르다. 따라서, 직접염기서열분석에서 7곳은 두 가지 염기서열
이 공존(heterozygote peak)하고, 나머지 부위는 한 가지 염기서열(homozygote peak)만 관찰이 된다.
정확한 ABO 유전형을 결정하기 위해서는 각각 의 대립유전자를 따로 분리 후 염기서열분석을 다시 해야 한다. 하지만, 대부분의 기관에서 ABO 유전형의 결정은 기존에 알려진 염기서열 정보를 근거로 확률적으로 유전형을 결정한다. 본 연구 팀도 이러한 방법으로 ABO 유전형을 결정했지 만, 기존에 보고되지 않은 새로운 염기서열이 발 견될 경우는 클로닝 후 각각의 대립유전자를 선 별 후 재 분석을 하거나 대립유전자 특이 염기서 열분석법(allele specific sequencing)으로 분석하였 다.
11,21)수술 전 검사로 ABO 혈액형 검사가 의뢰된 61 세 여자환자는 혈청학적으로 cis-AB형이 의심되 어 확진을 위해 ABO 유전형검사 결과 엑손 7의 703 G＞A만을 제외하고는 cis-AB01/O02와 일치한 소견을 보였다. 703번 염기가 B 대립유전자에 특 이한 염기서열이기 때문에 처음에는 새로운 cis-
AB01var로 의심하였다. 그러나, 클로닝법으로 환자의 대립유전자 분리 후 직접염기서열 분석을 시 행하였더니 흥미롭게도 703 G＞A의 변이가 cis-
AB01에서 기원한 것이 아니라 O02에서 기원한 것임을 확인할 수 있었다.
14)이러한 경험은 새로운 대립유전자가 발견될 경우 확률에 의존하지 않고 반드시 두 개의 대립유전자를 분리하여 분석해야 함의 중요성을 다시 한 번 확인하게 하였다.
ABO 유전형은 HLA 등과 동일하게 기존에 보
고된 유전자염기서열 데이터를 활용하여 결정하
므로 여러 인종의 정상 ABO 형과 각종 ABO 아
형의 분석된 유전정보를 잘 활용하는 것이 중요
하다. 이러한 정보는 미국 국립생물공학정보센터
(NCBI)의 Blood Group Antigen Gene Mutation
Database에 체계적으로 정리되어 주기적으로 갱
신되고 있다. 이곳에는 한국인에서 처음 발견된
혈액형들도 등록되어 있다.
13)각 나라와 인종 간에 ABO 혈액형의 대립유전 자 분포가 매우 다름에 주의해야 한다.
22)예를 들 면, 백인 A형의 가장 흔한 대립유전자가 A101이 지만, 한국인은 A102가 가장 흔한 대립유전자이
다.
8,13)또한 cis-AB 대립유전자는 서구인에서는
거의 존재하지 않지만 한국인에서는 상대적으로 흔하며, ABO 불일치의 가장 흔한 원인으로 보고 되었다.
23)본 연구에서도 의뢰된 검체 중 36.1%
(57/158)가 cis-AB01 대립유전자를 동반하였다. 따 라서, 그간 국내에 사용되어 온 ABO 유전형 검사 는 한국인의 ABO 유전형 분포의 특징을 고려하 여 개발되었다.
3,6)표현형의 분자유전학적 원인을 밝힐 수 있었 던 경우, A2B3 표현형을 갖는 경우가 49예(31.0%) 로 가장 많았는데 이들은 모두 cis-AB 대립유전자 와 O 대립유전자 쌍이었으며, cis-AB 대립유전자 를 하나라도 포함하는 경우는 57예(36.1%)로 가 장 많았다. 2006년도에 Cho 등에 의해 ABO 불일 치가 의심되는 46 검체를 대상으로 ABO 유전형 검사를 시행하고 분석한 바 역시, 적혈구측 원인 에 의해 ABO 불일치를 나타낸 경우 cis-AB 형이 가장 흔했다.
2)기존 한국인과 일본인에서 보고된 바와 같이 본 연구에서 밝혀진 cis-AB 형은 모두
cis-AB01 대립유전자이었다. cis-AB01 대립유전자는 본 연구에서와 마찬가지로 기본적으로 A2B3을 발현하는데, 동반되는 유전자에 따라 그 표현형 이 달라지는 특성을 보인다. cis-AB/O는 A2B3형,
cis-AB/A는 A1B3, cis-AB/B는 A2B형으로 보이는것이 보통인데, Cho 등에 의해 밝혀진 바에 의하 면 cis-AB/B를 제외하고 cis-AB/O는 A2B3형, A2B 형, A1B3형 및 AelB형으로, cis-AB/A는 A1B3, A1Bx or el, AintB3, 일부에서는 전형적인 A1을 보인 다.
24)전체 중 29.1% 정도는 약해진 표현형을 보이지
만 정상 ABO 대립유전자 쌍을 가진 것으로 밝혀 져 엑손 6, 7만의 분석으로는 약해진 ABO 표현형 의 분자유전학적 원인을 알 수 없었다. 엑손 6과 7의 분석만으로 원인을 규명하지 못한 경우 추가 로 전체 다른 엑손 및 인트론 분석을 통해 원인을 규명할 수 있다. Bahram 등은 AwB 표현형을 보 이는 환자에서 전체 엑손 및 인트론 분석을 시행 하여 약해진 A대립유전자의 분자유전학적 원인 이 엑손 6과 7은 A2과 엑손 1-5은 O1v 대립유전 자와 같은 hybrid 형태에 있음을 밝힌 바 있다.
25)Seltsam 역시 Aweak를 보인 한 가계의 ABO 유전 자 분석에서 엑손 6과 7뿐 아니라 다른 모든 염기 서열이 A101과 동일하였지만, 엑손 1의 starting codon의 변이(ATG＞ACG)를 발견하고, ABO 유 전자의 발현검사로 이를 증명하였다.
26)하지만 전체 엑손 및 인트론 분석을 시행하더라도 약해 진 ABO 표현형의 원인을 밝히지 못하는 경우도 있었다. Lee 등은 B3형 헌혈자의 12 검체를 대상 으로 7개의 엑손과 주변부 20 bp 이상의 인트론 을 분석하였으나 B3 표현형을 설명할 수 있는 새 로운 대립유전자를 발견할 수 없었다.
27)본 연구 팀 역시 엑손 6과 7 분석에서 원인을 찾을 수 없 었던 각각 B3 표현형을 가진 4예, A1B3 표현형을 갖는 2예, Ax 표현형을 갖는 1예에 대해 전체 엑 손 및 인트론 분석을 시행하였으나 그 역시 그 원 인을 밝힐 수 없었다.
28)이러한 경우에는 enhancer 활성도의 차이, promoter 부위의 변이나 메틸화 등에 있어서 다각적인 원인 분석을 시행해 볼 수 있겠다.
가계조사를 시행한 17명 가족 중 대표적인 6
가족의 가족관계, 표현형 그리고 유전형 결과를
통해 대립유전자 표현 양상의 차이를 발견할 수
있다. B306, Aw14의 가계조사에서 대립유전자 경
쟁현상이 관찰되었는데 이는 A와 B 당전이효소
가 공통의 작용부위에 대해 서로 상호 경쟁적인
관계에 있기 때문에 발생한다.
11,16)이는 ABO 아 형 대립유전자가 O 대립유전자와 동반되는 경우 에는 경쟁이 없기 때문에 마치 정상 ABO 대립유 전자처럼 강한 표현형을 보이지만, A 또는 B 대 립유전자와 동반되는 경우에는 각 전이효소의 경 쟁으로 불완전한 표현형을 보이는 것으로 설명한 다. 가족 3은 Ael의 표현형을 갖는 Ael02 가족이 었는데 일반 혈청학적인 검사를 통해서는 O 대 립유전자와 같았고, 흡착 및 해리시험을 통해서 만 항원의 존재를 확인할 수 있었다. Ael02 대립 유전자는 B101과 동반시에는 Ael형, O01과 동반 시에는 O형으로 다르게 표현되는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 A 유전자와 B 유전자 의 상호작용(A and B gene interaction) 중의 하나 인 해당 대립유전자가 A 혹은 B 대립유전자와 동 반될 경우 오히려 항원이 강해지는 대립유전자 강화(allelic enhancement)로 설명할 수 있다.
15)이 처럼 ABO 아형들은 동반되는 대립유전자에 따 라 그 표현형이 다양할 수 있고 그 분자유전학적 기전 또한 다양함을 알 수 있다. 따라서 동반되는 대립유전자에 따른 다양한 예를 분석할 수 있는 가계조사는 ABO 유전형 검사에 있어서 매우 중 요하다. 가족 5는 아버지는 AB형, 어머니는 O형 이었지만, 발단자는 AmfBmf 표현형의 혈액형이 었다. 혼합시야반응은 ABO 아형에서 주로 나타 날 수 있지만 드물게 키메라가 그 원인일 수 있어 의심하였다. 그런데, 흥미롭게도 AS-PCR에 의해
B/O유전형으로 ABO유전형과 표현형의 불일치가 관찰되었다. 이러한 원인을 규명하기 위해 발 단자의 검체로 클로닝과 직접염기서열분석을 실 시하여 A102, B101, O04를 동시에 가지고 있는 키 메라임을 의심하였고, 이를 가족들의 short tan- dem repeats (STR) 검사로 확인하였다.
17)드물지 만 키메라가 ABO 불일치의 원인이 될 수 있음을 경험하였다. 본 연구에서 분석한 6년 간 의뢰된
205개의 검체는 ABO 불일치의 해결을 위해 단일 기관에 의뢰된 검체를 대상으로 한 것이므로 ABO 아형이나 키메라 등의 빈도에 대한 역학조 사 자료로는 이용할 수 없다고 사료된다. 하지만, 키메라의 경우는 본 연구팀이 연구 기간 동안 4 증례를 경험한 것을 근거로 하면 ABO 불일치의 원인 중 예상 보다 많은 예들이 존재할 것으로 추 정된다.
17,29,30)저자들은 PCR-직접염기서열분석법으로 ABO 유전형 검사를 시행한 6년 간의 경험을 통해 ABO 불일치의 해결이나 ABO 아형의 감별에 있어서 PCR-직접염기서열분석법이 유용함을 밝히는 바 이다. 또한 동반되는 대립유전자에 따른 다양한 ABO 아형의 표현 양상을 분석할 수 있는 가계조 사가 ABO 유전형 검사에 있어서 매우 중요할 것 이다.
요 약
배경: ABO 유전형 검사는 ABO 불일치의 해결 및 ABO 아형의 결정에 있어서 매우 중요하다. 대 부분 ABO 아형 및 변이 표현형을 보이는 임상 검체에서 그 원인은 ABO 유전자의 엑손 6과 7의 PCR증폭 및 직접염기서열분석을 통해 결정될 수 있다. 본 저자들은 PCR증폭 및 직접염기서열분 석을 통한 ABO 유전형 검사를 시행한 6년 간의 경험을 소개하고자 한다.
방법: 본 연구는 2007년 1월부터 2012년 7월 사 이에 화순전남대학교병원에 의뢰된 205 검체(환 자 158명, 가족 47명의 검체)의 ABO 유전자검사 결과를 후향적인 분석을 통하여 실시하였다. ABO 유전형 검사는 ABO 유전자의 엑손 6과 7에 대한 PCR 증폭 후 직접염기서열분석을 통해 실시하였 다. 표준혈청학적 검사 또한 시행되었다.
결과: ABO 유전형 검사가 의뢰된 총 158 검체
중 112건(70.8%)은 ‘표현형과 유전형이 일치한 경 우’였으며, cis-AB01 대립유전자를 동반하는 A2B3 형이 49건(31.0%)으로 가장 흔했다. 표현형과 유전 형이 일치하지 않은 경우는 158건 중 46건(29.1%) 이었으며, 그들 중에서는 A1B3형이 8건(5.1%)으 로 가장 높은 빈도를 보였다. B306, cis-AB01,
Ael02, Aw14 그리고 B305 대립유전자를 가진 5발단자의 가계조사에서 동반되는 ABO 대립유전 자에 따라 가족들이 다른 표현형을 보임을 보여 주었고, A102/B101/O04를 갖는 키메라는 전형적 인 키메라 유전양상을 보여주었다.
결론: 저자들은 ABO 유전형 검사를 시행한 6 년 간의 경험을 통해 ABO 불일치의 해결과 ABO 아형의 감별에 있어서 PCR-직접염기서열분석법 이 유용함을 밝히는 바이다. 또한 다양한 ABO 아 형의 표현 양상을 분석할 수 있는 가계조사가 함 께 이뤄져야 할 것이다.
감사의 글
본 연구에 도움을 주신 전남대병원 혈액은행, 화순전남대병원 혈액은행 그리고 분자유전학 검 사실의 여러 선생님께 감사드립니다. 또한 흥미 로운 검체들을 의뢰해주신 전국의 여러 의료기관 선생님들께도 감사드립니다.
참고문헌
