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mice than wild type mice. However, there was no pathologic evidence of acute pancreatitis in Hsp70.1

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(1)

대한소화기학회지 2002;40:326-333

13)

접수: 2002년 7월 9일, 승인: 2002년 9월 6일

연락처: 김용태, 110-744, 서울특별시 종로구 연건동 28번지 서울대학교 의과대학 내과학교실

Tel: (02) 760-2944, Fax: (02) 762-9662 E-mail: yongtkim@plaza.snu.ac.kr

※ 본 연구는 서울대학교병원 연구비(04-2002-037)의 보조로 이루 어졌음.

※ 본 논문의 요지는 2001년 추계소화기학회의 구연 및 미국소화 기병학회에서 주관하는 2002년 Digestive Disease Week에서 포 스터로 발표되었음.

14)

Correspondence to: Yong-Tae Kim, M.D.

Department of Internal Medicine, Seoul National University Hospital 28 Yungon-dong, Jongno-gu, Seoul 110-744, Korea

Tel: +82-2-760-2944, Fax: +82-2-762-9662 E-mail: yongtkim@plaza.snu.ac.kr

열충격 단백 70.1 유전자 결핍 생쥐를 이용한 급성 췌장염 모형에서 열충격 단백 70의 역할 규명

서울대학교 의과대학 내과학교실 및 간연구소, 생화학교실 및 의학연구원 유전자이식연구소*

황진혁·김용태·윤용범·정지봉·배창준*·서정선*·김정룡

The Role of Heat Shock Protein 70 in the Pancreatic Trypsinogen Activation:

Studies in Hsp70.1 Knock-out Mice

Jin-Hyeok Hwang, M.D., Yong-Tae Kim, M.D., Yong Bum Yoon, M.D., Ji Bong Jeong, M.D., Chang Joon Bae, M.S.*, Jeong-Sun Seo, M.D.*, and Chung Yong Kim, M.D.

Departments of Internal Medicine and Biochemistry, Liver Research Institute, Ilchun Molecular Medicine Institute Medical Research Center*,

Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea

Background/Aims: Heat shock proteins (Hsps) are expressed in the cell as a response to the external stimulation such

as heat. There are some reports that the Hsp (i.e. Hsp70) is involved in pancreatitis. However, the role of Hsp70 in experimental pancreatitis is not clear yet. To elucidate the role of Hsp70 in experimental pancreatitis, we carried out animal studies using a knock-out model. Methods: We used FVB/NJ wild type mice and homozygous Hsp70.1 knock-out (Hsp70.1

-/-

) mice, in which Hsp70.3, another Hsp70 gene, was intact. They were divided into 4 groups each according to treatments (with or without hyperthermia and with or without cerulein). After the pancreas was homogenized, trypsin activities, protein expression levels, and protein kinase activities were measured. Results: Basal pancreatic trypsin activities were more elevated in Hsp70.1

-/-

mice than wild type mice. However, there was no pathologic evidence of acute pancreatitis in Hsp70.1

-/-

mice. When cerulein was administered, basally elevated trypsin activity did not increase further in Hsp70.1

-/-

mice, and the pancreas showed the same degree of pancreatitis as wild type mice. The expression level of Hsp70 is higher in wild type mice than in Hsp70.1

-/-

mice after either hyperthermia or cerulein stimulation. Hyperthermia prevented cerulein-induced trypsinogen activation in both groups. Phosphorylation of extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) increased by either heat or cerulein stimulation alone. However, heat pretreatment suppressed cerulein-induced ERK phosphorylation in both groups. Conclusions: Hsp70 suppresses spontaneous trypsinogen activation in mice. (Korean J Gastroenterol 2002;40:326-333)

Key Words: Cerulein; Acute pancreatitis; Heat-shock proteins 70; Mice, knockout; MAPK

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황진혁 외 6인. 급성 췌장염 모형에서 열충격 단백 70의 역할 규명

서 론

급성 췌장염은 상복부 동통과 혈청 내의 아밀라제나 리 파제 등 췌장효소의 상승을 동반하는 임상 증후군으로 췌 장의 염증과 다양한 정도의 원격 장기의 손상을 초래한다.

특히 중증의 급성 췌장염은 간부전, 위장관내 출혈, 성인형 호흡부전증후군 등의 다장기 부전을 동반하는 경우 사망률 이 약 30%에 이르나 그 치료는 아직도 대증적 치료를 벗어 나지 못하고 있다. 발병에 있어 가장 중요한 요소는 선방 세포 내에서 일어나는 trypsinogen의 활성화라고 알려져 있 다. 효과적인 치료법 개발을 위해서는 급성 췌장염의 발생 기전이 밝혀져야 하는데 이에 관여하는 인자들에 대해서는 밝혀진 바가 별로 없다.

열충격 단백(heat shock protein, Hsp)은 원핵 세포와 진 핵 세포 모두에 존재하며 매우 잘 보존된 구조로 이루어져 있어 세포의 성장이나 기능에 중요한 역할을 하리라 추측 된다.1 열충격 단백은 세포분열, 성장호르몬 등의 생리적 자극, 열충격, 방사선 등의 환경적 자극, 그리고 발열, 염증, 감염증, 허혈 등과 같은 병적 자극에 반응하여 발현이 증가 되는 일종의 스트레스 단백으로서 세포자멸사(apoptosis)의 억제에도 관여한다.2 열충격 단백은 대개 분자량에 따라 Hsp20, Hsp60, Hsp70, Hsp90 등으로 분류된다. 각종 단백 은 최종적인 각각의 모양을 형성하기 전에 불안정한 상태 로 펼쳐져 있는(unfolded) 단계를 거치게 되는데, Hsp70은 이러한 상태의 단백들을 안정화시킨다. 또한 단백질 전구 물질의 세포내 이동에도 관여하며 손상된 단백을 빨리 분 해하는 등의 ‘molecular chaperon’ 역할을 하며 유해 자극으 로부터 세포나 장기를 보호하는 역할을 수행한다. 생체외 연구에서 에탄올이나 NaCN 등의 자극에 의한 세포손상이 열에 의한 Hsp70의 과발현으로 억제됨이 밝혀졌으며 열 이 외의 다른 자극에 의한 Hsp70의 발현 증가에 의해서도 세 포에 대한 보호 효과가 있음이 알려졌다. 또한 transgenic mice를 이용한 생체내 실험에서도 Hsp70의 과발현이 허혈 이나 치명적인 열로부터 실험동물을 보호할 수 있음이 밝 혀졌다.3,4

최근 급성 췌장염의 동물실험 모델을 이용해서 열충격 단백이 급성 췌장염에서 어떤 역할을 하는지에 대한 많은 연구가 이루어졌다. 백서에 침수 스트레스(water immersion stress)를 가한 뒤 cerulein을 투여했을 때 Hsp60의 발현이 증가되고 급성 췌장염이 예방되어서 Hsp60이 급성 췌장염 을 억제할 수 있다고 하였다.5,6 Hsp60만이 아니라 Hsp70도 cerulein 유도 급성 췌장염을 억제한다고 알려졌으며,7-10는 Hsp70 유전자에 대한 antisense oligonucleotides (AS)를 이용한 연구에서도 밝혀졌다.11,12 그러나 AS를 이용한 연 구의 문제점으로는 AS가 비특이적으로 유전자와 결합할

가능성이 있으며, 설치류에서 면역계를 자극할 수 있기 때문에 Hsp70에 대한 AS의 효과가 Hsp70의 특이적 억제 때문이라고 단정할 수는 없다는 문제점이 있다. 또한 열 전처치에 의해 Hsp70의 발현은 증가되지만 cerulein 유도 급성 췌장염의 억제 효과는 없었다는 보고13가 있어 아직 실험적 급성 췌장염에서 Hsp70의 보호 역할은 명확하지 않은 실정이다. 따라서 급성 췌장염에서 Hsp70의 역할을 알아보기 위한 가장 확실한 방법은 Hsp70 결핍 생쥐를 이 용한 췌장염 연구이다. 생쥐에는 두 가지의 이종 Hsp70 단백이 있는데 이는 각각 Hsp70.1과 Hsp70.3 유전자에서 생산된다. 본 연구에서는 Hsp70이 급성 췌장염에 미치는 영향을 알아보기 위하여 이 두 가지 유전자 중 Hsp70.1 이 결핍된 생쥐를 이용하여 cerulein 유도 췌장염에서 Hsp70의 역할에 대해 알아보고 췌장의 선포에 cerulein 투 여시 ERK pathway 등을 통해 trypsinogen이 활성화됨에 착안하여(저자 등의 미발표 연구 결과) Hsp70의 급성 췌 장염 보호 효과와 ERK의 관련성에 대해 알아보고자 하 였다.

대상 및 방법

1. 대상

체중 18-25 g의 수컷 FVB/NJ homozygous knock-out (Hsp70.1-/-) 생쥐와, FVB/NJ 야생형(Hsp70.1+/+) 생쥐를 서 울대학교 의학연구원 유전자이식연구소로부터 분양받아 실험에 사용하였다14. 이들 생쥐는 Hsp70의 또 하나의 유 도형태(inducible form) 유전자인 Hsp70.3을 야생형으로 가지고 있는 상태이다. Cerulein은 Sigma Chemical 사(St.

Louis, MO, U.S.A.)에서 구입했으며 Peptides International (Louisville, KY, U.S.A)에서 트립신의 기질로 사용할 Boc- Gln-Ala-Arg-MCA 폴리펩티드를 구입했다. Hsp70과 Hsc70 (heat shock cognate, constitutive form of Hsp70)에 대한 항 체는 각각 StressGen (Victoria, British Columbia, Canada) 과 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, U.S.A.) 에서 구입했으며 anti-phospho-ERK (extracellular signal- regulated kinase)는 New England Biolabs (Beverly, MA, U.S.A.)에서 구입했다. 이외에 모든 시약은 상업적으로 사용 가능한 최고 순도의 것으로 사용하였다.

2. 방법

1) 열전처치와 실험적 급성 췌장염 유발

Hsp70.1-/- 생쥐와 야생형 생쥐를 열전처치한 군과 열전처 치하지 않은 군으로 나누었으며, 열전처치한 군은 cerulein 으로 급성 췌장염을 유발하기 전날 수온이 42℃인 항온 327

(3)

The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 40, No. 5, 2002

수조에 약 20분간 두었고 탈수를 방지하기 위하여 수조에 두기 전 생리식염수 0.2 mL를 복강 내에 투여하였으며, 열전처치하지 않은 군은 실온의 항온 수조에 20분간 두었 다. 12시간 지난 후 두 군 모두 cerulein (50 µg/kg) 혹은 생 리식염수를 한 시간 간격으로 4회 복강 내로 투여하였고 투여 종료 한 시간 경과 후에 희생시켰다. 이후 즉시 췌장 을 적출하여 일부는 병리표본 제작에 이용하였고 일부는 lysis 완충액 (1% NP-40, 50 mM Tris (pH 8.0), 120 mM NaCl, 20 mM NaF, 2 mM Sodium orthovananate, 2 mM PMSF)에 넣어 homogenizer (Thomas scientific, U.S.A.

1,725 rpm)를 이용하여 췌장조직을 균질화한 뒤 Western blot 검사를 위하여 보관하였다. 나머지 췌장은 4℃ MOPS 완충액 (250 mmol/L sucrose, 5 mmol/L MOPS, 1 mmol/L MgSO4, pH 7.0)에 담근 후 균질화하였고, 균질액의 일부 는 DNA 정량을 위해 보관하였으며 나머지 균질액을 150 g 에서 10분간, 1,300 g에서 15분간, 12,000 g에서 13분간 원 심분리하여,15 마지막 상층액을 트립신 활성도 측정에 이 용하였다.

2) 트립신 활성도 측정

트립신 활성도는 Kawabata 등16이 고안한 방법에 따라 Boc-Gln-Ala-Arg-MCA를 트립신 기질로 사용하여 형광 계 측으로 측정하였다. 간략히 기술하면 50 µL의 검체를 완충 액 (50 mmol/L Tris [pH 8.0], 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L CaCl2, 0.1% bovine serum albumin)이 들어 있는 cuvette에 넣고 여기에 기질을 첨가해서 반응을 시켰다. 380 nm 파장 의 빛으로 여기(excitation)시킨 후 방출되는 440 nm 파장의 형광을 측정하였다. 각 검체의 트립신 활성도는 검체 내의 DNA 양으로 보정하였는데 Hoechst dye 33258 (Sigma Chemical Co.)과 송아지 흉선 DNA를 사용하여 DNA를 형 광적으로 정량화하였다.17

3) Hsp70, Hsc70, phospho-ERK 측정

적출된 췌장을 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척 하고 lysis 완충액 500 µL를 넣은 후 homogenizer를 이용해 서 조직을 균질화하였다. 균질액을 수 초간 15,800 g에서 원심분리 후 상층액을 다시 15,800 g에서 15분간 원심분리 하여 얻어진 상층액을 이용하여 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동(SDS-PAGE) 후 Western blot을 시행하 였다. SDS-PAGE 이전에 BCA protein assay kit (Pierce Chemical Company, Rockford, U.S.A.)를 이용하여 췌장 균 질액에서의 단백질을 정량하였다. 일차항체로는 polyclonal rabbit anti-Hsp70, polyclonal goat anti-Hsc70, polyclonal rabbit anti-phospho-ERK 등을 사용하였다.

4) 조직학적 검사

췌장 적출 후 10% 포르말린에 고정, 파라핀에 포매 후 hematoxylin-eosin 염색을 하여 부종, 염증세포의 침윤, 세 포의 공포화(vacuolization) 등을 광학현미경하에 관찰하 였다.

5) 통계 분석

각 군에서의 트립신 활성도에 대한 유의성은 Mann- Whitney U 검정을 이용하여 비교하였으며 p값이 0.05 미만 인 경우를 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

결 과

1. Hsp70 발현

아무런 자극이나 전처치를 하지 않은 Hsp70.1-/- 생쥐와 야생형 생쥐 모두에서 Hsp70 단백은 아주 낮은 정도로 발 현되었는데 그 정도는 Hsp70.1-/- 생쥐에서 더 낮게 발현되 었으며(Fig. 1) 이것은 남아있는 Hsp70.3 유전자에서 발현 된 것으로 여겨졌다. Cerulein을 투여했을 때에는 야생형 생쥐뿐만 아니라 Hsp70.1-/- 생쥐에서도 Hsp70의 발현이 증 가하였는데(Fig. 1), 증가된 정도는 Hsp70.1-/- 생쥐보다 야 생형 생쥐에서 훨씬 심하였다. 열전처치하였을 때에도 두 군 모두에서 Hsp70 단백의 발현이 증가하였지만 역시 그 정도도 야생형 생쥐에서 더욱 두드러졌다(Fig. 1). Hsc70 단 백의 발현 정도는 Hsp70.1 유전자 결핍 여부나 열전처치 혹은 cerulein 투여에 관계없이 모든 군에서 일정하였다 (Fig. 1).

Fig. 1. Expression level of pancreatic Hsp70 and Hsc70 in the Hsp70.1-/-mice and the wild type mice after heat-pretreatment and cerulein injection. Twelve hours after thermal stress (42℃ for 20 min), cerulein was injected and then the mice were sacrificed.

Pancreatic lysates (10 µg/lane) were loaded in each lane and were probed with anti-Hsp70 and anti-Hsc70.

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Hwang, et al. The Role of Hsp70 in the Pancreatic Trypsinogen Activation

2. 트립신 활성도

열전처치나 cerulein 투여를 하지 않은 야생형 생쥐에서 췌장균질액의 DNA당 트립신 활성도를 기준으로 하였을 때, 아무 처치하지 않은 Hsp70.1-/- 생쥐에서는 이미 트립신 활성도가 상승되어 있었다(p<0.05, Fig. 2). Cerulein을 투 여한 뒤에는 야생형 생쥐의 트립신 활성도는 cerulein을 투 여하지 않았을 때보다 약 2배 증가하였는데, Hsp70.1-/- 생 쥐에서는 cerulein 투여 후의 트립신 활성도는 cerulein을 투여하지 않았을 때의 그것과 비교했을 때 통계적으로 유 의한 차이는 없었다(p>0.05). 열전처치 후 cerulein을 투여 하였을 때 야생형 생쥐와 Hsp70.1-/- 생쥐에서 트립신 활성 도는 cerulein만 투여했을 때보다 모두 감소하여서 열전처 치는 cerulein에 의한 췌장의 트립신 활성도 증가를 두 군 모두에서 억제하였다(p<0.05). Hsp70.1-/-생쥐에서 cerulein 투여하기도 전에 이미 증가되어 있던 트립신 활성도는 열 처치 후 감소하였다(p<0.05, Fig. 2).

Fig. 2. Trypsin activities in the pancreas of the wild type and the Hsp70.1-/- mice in the presence or absence of heat-pretreatment and cerulein stimulation. Trypsin activities in pancreatic homogenizer were quantified as described in the text. Values are expressed as mean±SEM (standard error of mean) obtained from at least three separate experiments. The bars represent the relative values compared to the trypsin activity of the wild type mice without cerulein injections as control.

*p<0.05 as compared with wild type, **p<0.05 as compared with cerulein injections groups.

3. ERK의 활성도

Cerulein 투여는 ERK의 인산화 정도를 증가시켰고, 열 전처치만으로도 췌장에서 ERK의 인산화를 촉진하였다. 그 런데 cerulein 투여 전에 열전처치를 한 경우에는 역설적으 로 ERK의 인산화 정도가 현저히 억제되었다(Fig. 3).

Fig. 3. Effect of prior thermal stress and intraperitoneal cerulein injections on the activation of pancreatic ERK. Activations of pancreatic ERK were suppressed in both groups when cerulein was injected after heat-pretreatment.

4. 조직학적 소견

아무런 처치를 하지 않았을 때 야생형 생쥐뿐만 아니라 Hsp70.1-/-생쥐의 췌장은 모두 정상 소견을 보였다(Fig. 4A, D).

Cerulein 투여 후에는 야생형에서 세포의 공포화나 간질내 부종이 발생하였으며 염증세포의 침윤과 선방세포의 괴사 는 뚜렷하지 않았다(Fig. 4B, E). Cerulein 투여 후 Hsp70.1-/- 생쥐에서 세포의 공포화나 간질내 부종 정도는 cerulein 투 여한 야생형 생쥐와 비교하여 비슷한 정도로 발생하였다 (Fig. 4B, E). 열전처치를 한 생쥐는 cerulein을 투여하여도 야생형이나 Hsp70.1 결핍 생쥐 모두에서 급성 췌장염의 소 견이 발생하지 않았다(Fig. 4C, F).

고 찰

생쥐에는 Hsp70.1과 Hsp70.3, 두 종류의 70-kDa의 열충 격 단백이 있는데, 이들은 한 개의 아미노산 차이가 있으며 Western blot에서도 구별이 되지 않는다. 이들은 수정란이 착상하기 전에 일정한 정도로 발현되어 태아 발생에 중요 한 역할을 하는 것으로 알려져 있다18. 저자들은 이번 실험 에서 이 두 유전자 중 Hsp70.1 단백 유전자 결핍 생쥐를 이 용하여 cerulein 유도 급성 췌장염에서 Hsp70의 역할을 알 아보고자 하였다. 연구 결과 아무런 처치를 하지 않은 기저 상태에서도 Hsp70.1-/-생쥐 췌장 내에서 트립신 활성도는 야 생형 생쥐에 비해 약 2배 정도 상승되어 있었으며 그 상승 된 정도는 cerulein 투여시 상승되는 트립신 활성화 정도와 비슷하였다. Hsp70.1-/- 생쥐에서 상승된 기저 상태 트립신 활성도는 열전처치에 의해 거의 야생형 생쥐의 기저 상태 트립신 활성도 정도까지 감소했다. 이러한 현상은 Hsp70.1-/- 생쥐에서 기저 상태에서는 야생형에 비해 발현이 억제되어 있던 Hsp70도 열전처치 후에는 아직 온전히 남아 있는 HSP70.3 유전자에 의해 트립신 활성화를 억제할 정도로 충분히 발현이 증가되기 때문으로 여겨진다. 이러한 사 실은 Hsp70 단백이 아무런 자극이 없는 정상 췌장에서도 329

(5)

대한소화기학회지: 제40권 제5호, 2002

trypsinogen 활성화를 계속 억제하는 기능을 하고 있다는 추측을 가능하게 하고 있다. 그런데 아무런 자극이 없는 Hsp70.1-/-생쥐에서 췌장내 트립신 활성도가 증가되어 있었

지만 조직검사 소견에서는 급성 췌장염 소견이 전혀 관찰 되지 않은 사실은 매우 흥미롭다. 이러한 현상이 발생하는 이유에 대해서는 아직 잘 알 수는 없고 추후 연구에서 밝혀 Fig. 4. Microscopic findings of the pancreas in wild type mice and Hsp70.1-/-mice after cerulein injections and heat-pretreatment.

(A) Pancreas of wild type mice without hyperthermia and cerulein injections. (B) Pancreas of wild type mice after cerulein injections.

(C) Pancreas of wild type mice after hyperthermia prior to cerulein injections. (D) Pancreas of Hsp70.1-/-mice without hyperthermia and cerulein injections. (E) Pancreas of Hsp70.1-/- mice after cerulein injections. (F) Pancreas of Hsp70.1-/- mice after hyperthermia prior to cerulein injections. After cerulein injections, pancreas of both wild type mice and Hsp70.1-/-mice groups show inflammatory cells (white arrow) and vacuolizations (black arrow) (B, E). These findings almost disappear by pretreatment of hyperthermia (C, F) (H&E stain, ×200).

330

(6)

황진혁 외 6인. 급성 췌장염 모형에서 열충격 단백 70의 역할 규명

져야 하겠지만, bombesin으로 췌장을 자극하였을 때에도 trypsinogen이 활성화되지만 급성 췌장염은 일으키지 않는 다는 현상19과 유사하다. 야생형에서는 아무런 자극이 없는 기저 상태에서 Hsp70은 trypsinogen의 활성화를 항상 억제 하고 있는 기능이 있는데, Hsp70 단백의 양이 반으로 감소 된 Hsp70.1-/- 생쥐에서는 췌장 내에서 trypsinogen이 trypsin 으로 계속 변화되고는 있지만 급성 췌장염으로는 이행시키 지 않는다고 해석할 수 있다. 그러나 Hsp70.1-/-생쥐에도 열 전처치를 하면 Hsp70.3 유전자에서 충분한 양의 Hsp70 단 백을 생산해내기 때문에 trypsinogen의 활성화가 억제된다 고 여겨진다. 아무런 자극이 없는 Hsp70.1-/- 생쥐에서 췌장 내 트립신 활성도가 증가되어 있었지만 급성 췌장염까지 일으키지 않는 이유가 trypsinogen이 활성화되는 속도나 양 에 관계되는 것인지 아니면 전혀 다른 기전의 차이에 의한 것인지는 본 연구 결과만 가지고는 알 수가 없다.

Hsp70.1-/- 생쥐와 야생형 생쥐 모두에서 cerulein 투여시 급성 췌장염 소견이 거의 비슷한 정도로 발생하였는데 이 는 Hsp70.1-/- 생쥐에서도 Hsp70.3 유전자에서 야생형에 비 하여 정도는 약하지만 cerulein에 의해 Hsp70 단백의 발현 이 증가되어서 이로 인해 Hsp70.1 유전자 결핍 효과가 봉 쇄되었기 때문으로 여겨진다. Cerulein으로 자극시 췌장에 서 Hsp70 단백이 증가하는 현상은 본 연구뿐만 아니라 다

른 연구12,20,21에서도 이미 알려져 있는데 이는 cerulein에 의

한 급성 췌장세포 손상을 억제하고자 하는 세포 자체의 방 어기전으로 해석된다. 그러나 cerulein으로 췌장을 자극하여 도 Hsp70의 발현이 증가하지 않았다는 연구 결과9,22도 있 어서 동물모델의 차이와 췌장염의 유발 방법의 차이에 의 해 상이한 결과가 초래되었을 가능성도 있다.

열전처치를 한 생쥐에서는 cerulein으로 췌장을 자극하더 라도 Hsp70.1-/- 생쥐와 야생형 모두에서 급성 췌장염이 발 생하지 않았는데 Hsp70.1-/- 생쥐에서도 췌장염이 억제된 이 유는 Fig. 1에서 나타나듯이 Hsp70.1-/- 생쥐에서도 열전처 치를 하면 아직 남아있는 Hsp70.3 유전자에서 췌장염을 억 제하기에 충분한 정도의 Hsp70 단백을 생산해내기 때문으 로 여겨진다.

췌장의 선포에 cerulein 투여시 ERK pathway 등을 통해 trypsinogen이 활성화됨에 착안하여 Hsp70과 ERK와의 관 계를 알아보았는데, 기존의 연구23,24에서와 같이 cerulein 자극시 췌장세포내 ERK의 활성도가 증가하였다. 그런데 cerulein 투여 후 증가되었던 ERK의 활성화는 열전처치에 의해 억제되었다. 이는 Metzler 등24이 최근 발표한 결과와 상반되는데, 이는 두 연구 간 실험 방법상의 차이 때문일 수도 있다. 생쥐의 경우 열전처치 후 Hsp70의 발현은 대개 수 시간부터 증가하여 12시간째 최고조이고 이후는 서서 히 감소하는 것으로 알려져 있어서 본 연구는 열전처치

후 12시간, 즉 발현이 최고조일 때 cerulein을 복강내로 투 여하였지만 Metzler 등은 열전처치 24시간 후에 cerulein을 백서의 혈관내로 주입한 뒤 측정하였다. 그런데 본 연구에 서 역설적으로 열전처치만을 한 생쥐에서는 췌장내 ERK의 활성화가 증가되어 있어서 cerulein 투여군에서 열전처치가 ERK의 발현을 억제하였던 것과 서로 양립되는 결과를 보 였다. HSP과 ERK 신호와의 상관관계에 대해서 몇몇 연구 결과가 보고되고 있는데, ERK는 뇌세포주에서 Hsp70의 발현의 상부에 관여하여 열충격 단백의 전사인자인 heat shock factor-1을 활성화시켜 Hsp70의 발현을 증가시킨다는 보고가 있는 반면,25 Hsp70의 아랫단계 신호 전달에 관여 하고 있다는 보고26도 있다. 즉 Hsp70과 ERK 신호는 세포 의 종류나 자극에 따라 서로 위 또는 아래에서 작용할 수 있음을 알 수 있다. 본 연구 결과 췌장의 선방세포에서는 Hsp70이 ERK를 통해 trypsinogen 활성화에 관여하고 있다 고 여겨진다. 그런데 cerulein 자극 여부에 따라 Hsp70의 ERK에 대한 영향이 정반대 방향, 즉 억제 혹은 촉진시키는 방향으로 나타나는 이유에 대해서는 향후 연구를 통해 더 밝혀야 할 과제이다.

본 논문은 cerulein 유도 급성 췌장염의 발병기전의 연구 에 Hsp70.1 유전자 결핍 생쥐를 이용한 첫 논문이다. 그런 데 Hsp70.1 유전자 결핍 생쥐에서도 온전히 남아 있는 Hsp70.3 유전자의 기능으로 말미암아 급성 췌장염에서 Hsp70 단백의 역할을 완전하게 밝히는 데는 한계가 있었 다. 하지만 아무런 자극을 주지 않았을 때에도 Hsp70.1-/-생 쥐에서 트립신 활성도가 증가되어 있었다는 사실은 Hsp70 이 정상 상태의 췌장에서도 trypsinogen 활성화를 계속 억 제하고 있다는 새로운 사실을 밝혀낼 수 있었다. 또한 cerulein에 의한 급성 췌장염에 대해서 Hsp70이 억제 효과 가 있다는 기존의 연구 결과를 본 연구를 통해서 다시 확인 할 수 있었다.

요 약

목적: 열 등의 자극에 의해 발현이 증가하는 열충격 단백은 여러 자극으로부터 세포나 장기를 보호하는 역할 을 한다. 열충격 단백의 일종인 Hsp70이 cerulein 유도 급 성 췌장염을 억제한다는 주장과 그렇지 않다는 주장이 있어서 아직 Hsp70의 역할에 대해서는 논란이 있는 실정 이다. 생쥐에는 Hsp70이 Hsp70.1과 Hsp70.3 두 유전자에 서 생산되는데 본 연구에서는 Hsp70.1 유전자 결핍 생쥐 (knock-out mice)를 이용하여 cerulein 유도 급성 췌장염에 서 Hsp70의 역할을 규명하고자 하였다. 대상 및 방법:

FVB/NJ homozygous knock-out (Hsp70.1-/-) 생쥐와 야생형 (Hsp70.1+/+) 생쥐를 이용하였다. 열전처치(42℃, 20분) 유무 331

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The Korean Journal of Gastroenterology: Vol. 40, No. 5, 2002

에 따라 각각을 다시 두 군으로 나누었으며 열전처치 12시 간 뒤에 cerulein을 복강 내에 주입하였다. 췌장을 적출하여 일부를 병리표본 제작에 이용하였으며 나머지를 균질화하 여 분석에 이용하였다. 결과: 열전처치나 cerulein 투여만으 로도 Hsp70.1-/- 생쥐와 야생형 생쥐 모두에서 각각 Hsp70 의 발현이 증가되었는데 그 증가 정도는 야생형 생쥐에서 더 심하였다. Cerulein을 투여하지 않은 경우, 야생형에서와 는 달리 Hsp70.1-/- 생쥐의 췌장 내에서 트립신 활성도가 이 미 증가되어 있었다. 그러나 Hsp70.1-/- 생쥐에서도 조직검 사상 급성 췌장염의 소견은 발생되지 않았다. Cerulein을 투여한 경우 야생형에서는 트립신 활성도가 증가하였고, 조직적으로도 췌장염 소견이 발생되었는데, Hsp70.1-/- 생 쥐에서는 조직 소견에서 급성 췌장염이 야생형과 비슷한 정도로 발생하였으나 트립신 활성도가 cerulein 자극 전에 비하여 더 증가하지는 않았다. 야생형 생쥐와 Hsp70.1-/- 생쥐 두 군 모두에서 열전처치에 의해 cerulein에 의한 trypsinogen 활성화가 완전히 억제되었으며, 급성 췌장염의 소견도 현저히 감소하였다. ERK의 활성화는 열전처치 혹 은 cerulein 투여시 야생형 생쥐와 Hsp70.1-/- 생쥐에서 증가 하였으나 열전처치를 하고 cerulein을 투여할 경우 두 군 모 두에서 오히려 활성도가 억제되었다. 결론: Hsp70은 생쥐 에서 자발적 trypsinogen 활성화와 cerulein에 의한 급성 췌 장염을 억제하는 기능이 있다.

색인단어: Cerulein, 급성 췌장염, 열충격 단백70, Knock-out, MAPK

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수치

Fig. 1. Expression level of pancreatic Hsp70 and Hsc70 in the Hsp70.1 -/- mice and the wild type mice after heat-pretreatment and cerulein injection
Fig. 3. Effect of prior thermal stress and intraperitoneal cerulein injections on the activation of pancreatic ERK

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