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Neural Antigen Expressions in Cultured Human Umbilical Cord Blood Stem Cells in vitro

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시험관내 배양된 제대혈 모세포에서의 신경항원 발현

국군 서울 지구병원 신경외과1)

연세대학교 의과대학 뇌연구소,2) 임상병리학교실,3) 신경외과학교실4)

하 윤1)·윤도흠4)·연동수2)·김현옥3)·이진주2)·조용은4)·최중언4)

= Abstract =

Neural Antigen Expressions in Cultured Human Umbilical Cord Blood Stem Cells in vitro

Yoon Ha, M.D.,1) Do Heum Yoon, M.D.,4) Dong Su Yeon, M.D.,2) Hyun Ok Kim, M.D.,3) Jin Ju Lee, B.Sc.,2)

Yong Eun Cho, M.D.,4) Joong Uhn Choi, M.D.4) Department of Neurosurgery,1) Seoul District Hospital, Seoul, Korea Department of Institute of Brain Research,2) Clinical Pathology,3) Neurosurgery,4)

Yonsei University, College of Medicine, Seoul, Korea

bjectives:Cord blood stem cells have been widely used as donor cells for bone marrow transplantation recently.

These cells can give rise to a variety of hematopoietic lineages to repopulate the blood. Recent observations reveal that some bone marrow cells and bone marrow stromal cells(MSCs) can grow to become either neurons or glial cells. It is, however, unclear whether or not there exists stems cells which can differentiate into neurons in the blood during the early stages of postnatal life.

Methods:Human cord blood stem cells were prepared from human placenta after full term delivery. To induce neuronal differentiation of stem cells, β-mercaptoethanol was treated. To confirm the neuro-glial characteristics of differentiated stem cells, immunocytochemical stain for NeuN, neurofilament, glial fibrillary acidic protein(GFAP), microtubule associated protein2(MAP2) was performed. RT-PCR was performed for detecting nestin mRNA and MAP2 mRNA.

Results:We showed in this experiment that neuro-glial markers(NeuN, neurofilament, MAP2, GFAP) were expre- ssed and axon-like cytoplasmic processes are elaborated in the cultured human cord blood stem cells prepared from new born placenta after full term delivery. Nestin mRNA was also detected in fresh cord blood monocytes.

Conclusions:These results suggest that human cord blood derived stem cells may be potential sources of neurons in early postnatal life.

KEY WORDS:Neural stem cells・Cord blood stem cells・Neurofilament・MAP2・GFAP・Differentiation.

서 론

일반적으로 중추신경계의 손상은 비가역적인 것으로 손 상 후 재생은 매우 어려운 것으로 알려져 왔다. 적절한 세 포 또는 조직 이식으로 손상 받은 중추신경계에 대한 치료 가 시도되어왔다. 1970년대 이후 인간의 중추신경계에 자

기증식(self renewal)과 신경으로 분화(differentiation)하 는 신경모세포(Neural stem cells)의 존재가 규명된 이후 손상된 중추 신경 조직에 이들 신경모세포의 이식을 통한 치료 방법에 대한 많은 연구가 이루어져왔다17). 실험적으 로 신경모세포를 백서의 중추신경계에 이식했을 때 신경세 포(neuron) 및 교세포(glial cell)로 분화하는 것으로 증명 되었으며, 중추신경 손상부위에 이식시 신경학적 증상의 개

OOOO

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선을 확인할 수 있다3)16). 이러한 보고들이 신경모세포의 치 료적 이용가능성을 높여왔음에도 불구하고, 치료시 원하는 양만큼의 충분한 세포를 얻기가 어렵다는 점등으로 인해 보 편적으로 이용되지 못하고 있다. 현재 신경모세포 외에 다 양한 종류의 조직 및 세포들이 신경질환의 치료목적으로 연구되고있다. 현재까지 연구되고있는 중추신경으로 이식 이 가능한 조직 및 세포들로는 태아신경조직(fetal neural tissue), 배아모세포(embryonic stem cell), 말초신경세포, 슈반세포(Schwann cell), 성상세포(astrocyte)등이 있다10)15). 그러나, 이들 조직 및 세포들 역시 치료에 필요한 만큼의 충 분한 양을 얻기 어려우며 배아복제 등에 따른 윤리적, 종교 적 갈등을 해결해야하는 어려움이 있다.

1997년 골수모세포(bone marrow stem cell)가 신경 및 교세포로 분화하는 현상이 보고되면서8) 골수모세포를 중추 신경질환의 치료에 이용하고자하는 노력들이 계속되었다.

골수에서 추출한 세포들을 면역결핍백서(immunodeficient mice)에 주입후 뇌조직에서 성상세포로 분화되는 현상이 관 찰되었으며2), 자기복제 능력과 지방 및 골조직 등의 간엽조 직으로 분화하는 것으로 알려져 있는 골수 간질세포(bone marrow stromal cell)21)은 시험관내에서 신경세포로 분화 가 일어나고23), 백서 뇌조직에 주입시 골수간질세포의 성상 세포로의 분화를 관찰할 수 있었다11). 특히 골수 모세포를 중 뇌동맥 결찰한 백서의 뇌경색부위에 주입후 이들 골수 모세 포로부터 신경 및 성상세포로의 분화현상의 관찰뿐만 아니 라 신경학적 증상의 개선을 관찰할 수 있었다는 보고4) 골수 모세포의 치료적 이용가능성을 한층 증대시키고 있다.

이와는 반대의 실험으로 전신 방사선 조사로 골수를 완전 히 파괴시킨 실험쥐에 신경모세포를 이식하면, 이식된 신 경모세포가 조혈모세포로 분화하여 혈액세포를 만들어낸다 는 보고도 있었다7)18). 또한 조혈세포에 작용하는 각종 cy- tokine들이 신경세포의 분화에도 밀접한 관계를 가진다는 보고13)가 있었다.

이러한 보고들을 종합해 볼 때 혈구세포와 신경세포는 발 생 및 분화과정에 유사성을 확인할 수 있다.

제대혈액에는 다수의 모세포(stem cells)가 존재하는 것 으로 알려지고 있다. 제대혈액모세포는 성인의 골수 조혈모 세포에 비하여 분화가 덜된 원시적 세포로 혈액세포 및 혈 관 내피세포로 분화하는 것으로 알려져 왔다8). 아직까지 제 대혈액 모세포가 신경세포로 분화가 가능한지는 규명되지 않고 있다. 그러나, 신생아 혈액내의 neuron specific en- olase의 농도가 성인의 수배에 이르며1) 신생아의 뇌조직은 생후에도 계속 왕성한 성장을 하는 사실은 제대혈액내에 신 경모세포의 존재가능성을 배제하기는 어렵다.

본 연구자들은 제대혈액모세포를 시험관내 배양하여 신경 세포로 분화여부를 확인해 보고자 하였다. 이들 배양세포에 서 신경세포 및 성상세포의 표지자로 알려진 신경세사 단 백질(Neurofilament),nestin, microtubule associated pr- otein2(MAP2), NeuN(neuronal nuclear)및 GFAP의 발 현여부를 면역 형광 염색 및 RT-PCR법을 통해 확인해 보 았다.

대상 및 방법

1. 실험 재료

정상 질식 분만한 건강한 태반으로부터 소독된 주사기를 사용 100~150ml의 제대혈액을 채취하여 실험에 사용하 였다.

획득된 혈액은 Hank’s balanced salt solution(HBSS) 와 1:1로 혼합하여 Ficoll-Paque(Ficoll-Paque Plus;

1.077g/ml;Pharmacia)를 이용한 농도 구획법으로 단핵 구 층을 분리하였다.

분리된 단핵구 층은 두차례에 걸쳐 50ml의 HBSS용액 에 섞은 뒤 원심분리하여 세척한다. 세척된 단핵구는 배양 액에 1×106/ml의 농도로 부유 시킨다. 배양액의 조성은 다 음과 같다. Dublecco’s Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco), 20% fetal bovine serum(Sigma), 0.001M β- mercaptoethanol(Sigma), 100 units/ml penicillin, and 100ug/ml streptomycin.

배양액을 배양용기에 담아 37℃, 95% air/5% CO2 배양 기속에서 배양한다. 대부분의 세포는 상기 배양조건으로 제거 되며, 분열하는 일부의 세포만 모아서 관찰한다. 6일째 배양액 을 poly-L-lysine(PLL, Mwt:70,000~150,000, Sigma) 으로 표면 처리한 chambered slide(Nunc)에 옮겨 담는다.

이들 단핵구는 37℃, 95% air/5% CO2 배양기에 넣어 배 양하여 부유된 세포가 slide에 부착 할 수 있게 한다. 부착 된 세포를 15일간 배양하며 배양액은 4~5일간격으로 교체 시킨다.

배양된 세포의 형태 및 상태는 위상차현미경(phase co- ntrast microscope, Olympus)를 통해 관찰하였다.

2. 면역염색

신경세포의 항원의 발현여부를 검사하기 위하여 NeuN, neurofilament, GFAP, MAP-2에 대한 면역 형광 염색을 시행하였다.

간접면역 형광 염색법으로 4℃에서 30분간 20mM pho- sphate buffered saline(pH 7.4, PBS)에 녺인 4% paraf-

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ormaldehyde(Sigma)로 세포를 고정한다. 역시 4℃에서 0.1% Trion x-100(Sigma)로 20분간 처리하여 세포막의 투과도를 증가시킨다. 37℃에서 30분간 10% fetal bovine

serum in 20mM PBS 차단용액(blocking solution)으로 처리하여 비특이적 항원 항체 결합을 차단 시킨다. 일차 항 체는 차단 용액에 희석하여 37℃에 한시간 반응시킨다.

사용한 일차항체로는 mouse anti neurofilament, mo- use anti NeuN, mouse anti GFAP, mouse anti MAP-2 (Table 1)를 이용하였다.

일차항체에 대한 이차항체로 florescein isothiocyanate (FITC)-conjugated goat anti mouse IgG(Boehringer Manheim, diluted in 1:500 in blocking solution)를 이 용하여 37℃, 30분간 반응시킨다. 20mM PBS로 씻어낸 뒤 형광형미경(Olympus)으로 관찰한다.

3. 세포수 계산

면역형광 염색한 슬라이드를 형광현미경하에 관찰하여

Table 1. Antigens expressed in cultured human umbilical cord blood stem cells were confirmed by Immunostaining

Antibodies Dilution Expression Neurofilament-

phosphorylated

(sternberger) 1:1000 +

GFAP

(sigma) 1:100 +

NeuN

(chemicon) 1:100 +

MAP2

(sigma) 1:500 +

Fig. 1. Phase contrast microscope imagings that demonstrate different characteristics in cultured human cord blood stem cells.

Cord blood monocytes isolated by density gradient methods. A:After 5 days in primary culture, most of the cells had died.

However, some round phase-contrast bright cells were found(white arrow). B:These cells began to proliferate and formed cell clusters(white arrow). Floating cell clusters were replated on poly-L-lysine coated slides and allowed to attach. C:Cells elabor- ating cytoplasmic processes(bipolar cells) were seen(white arrow). D:At least two types of cells were found on day 15. Round cells having a prominent nucleus and scanty cytoplasm without cytoplasmic processes were mainly located in the central portion of the colony(black arrow). In contrast, cells having a relatively small nucleus and cytoplasmic processes were mainly found in the peripheral portion of the colony(white arrow). E:After 20 days in primary culture, interconnected cytoplasmic processes among the neuron-like cells were found. F:Some of the neuron-like cells elaborated multiple processes.

A AA

A BBBB CC CC

DDD

D EEEE FFFF

(4)

세포수를 계산 하였다.

×200배율, 10 시야에서 전체 세포수를 측정한 뒤 형광 염색 양성 세포수를 측정하여 백분율로 양성 세포수를 표 시하였다.

4. RT-PCR

TRIZOL-LS(Gibco)를 이용하여 세포를 완전히 분해하 여 RNA를 추출하였다. firststrand cDNA를 합성하기 위 하여 추출한 RNA에 random hexamers를 80C에 5분간 반응시켜 결합하게 하였다. Superscipt kit(Gibco)를 이용 하여 42℃-50분, 80℃-5분간 반응시켰다. Primers는 Map draw program으로 발표된 seqence data를 이용하여 디

자인 하였다. (1) nestin, Accession No. X65964, the up- stream (5) primer corresponds to position 1791-1810 (5-aggatgtggaggtagtgaga-3) and downstream (3) pri- mer is complementary to position 2040-2021(5-tgg- agatctcagtggctctt-3), 250-bp amplified product;(2) MAP2, Accession No. XM_002387, the upstream (5) primer corresponds to position 1401-1420(5-tcagag- gcaatgaccttacc-3) and downstream (3) primer is com- plementary to position 1720-1701(5-gtggtaggctcttg- gtcttt-3), 320-bp amplified product. cycling condition 은 94℃-30초;57℃-30초;72℃-30초로 총 40cycle 로 하였다. PCR products 는 ethidium bromide를 함유하

Fig. 2. Immunocytofluorescence staining of cultured human cord blood stem cells. Using fluorescent microscopy, staining with fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated goat anti mouse IgG showed those cells which were immunoreactive to NeuN(A), neurofilament(B-D), MAP2(E), and GFAP(F). At the 20th day of culture, NeuN(neuronal nuclei), neurofilament and MAP2 im- munoreacting cells were found. A:NeuN antibodies were stained strongly in the nucleus(white arrow). However, some of the cells were weakly stained in the cytoplasm(arrowhead). B:Some cells in the colony were strongly immunoreactive to neuro- filament. C-D:Neurofilament expression was found not only in cells elaborating cytoplasmic processes(arrow), but also in round cells without cytoplasmic processes(arrowhead). E:However, MAP2 is also neuron-specific and was predominantly, and pro- bably exclusively, found in cells elaborating cytoplasmic processes. F:GFAP is expressed especially on cells elaborating long cytoplasmic processes.

A AA

A BBBB EE EE

CCC

C DDDD FFFF

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는 1.2% agarose gel에 전기영동하여 자외선 파장하에 관 찰 및 촬영하였다. RNA와 cDNA의 질적평가를 위하여 β-actin(150bp)을 control로 사용하였다.

결 과

본 실험에서 사용된 배양액으로 혈구세포를 배양하면 약 5일째 대부분의 세포가 분해되어 제거되며 일부의 세포만 이 생존해서 분열하는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 세 포들은 위상차 현미경으로 관찰시 강한 contrast bright rim 을 가진 세포로 관찰된다(Fig. 1A). 이들 세포는 분열을 반 복하여 세포집락을 이루는데(Fig. 1B) 형태학적으로는 ne- urosphere와 유사한 모양을 보였다.

이들 세포를 poly-L-lysine으로 코팅한 chambered slide에 옮겨 slide표면에 부착시켜 분화를 유도하였다. 부 착된 세포들은 시간이 지나면서 세포집락 으로부터 떨어져 나와 이동하였다. 대다수의 세포는 비교적 큰 핵과 풍부한 세포질을 가지는 세포로 분화하며, 일부의 세포는 작은 핵 과 세포돌기를 분지하는 세포로 분화한다(Fig. 1C, D). 배 양후 20일째 관찰한 세포의 형태는 세포돌기들이 보다 뚜 렷해지며, 이들 세포돌기들이 서로 연접하여 그물을 형성 하는 모습을 보인다(Fig. 1E). 일부의 세포에서는 여러 개 의 세포돌기를 분지한다(Fig. 1F).

면역형광염색법으로 확인한 결과 전체 세포중 1.7%에서 NeuN항체에 양성(Fig. 2A), 1% 이내에서 neurofilament 에 양성(Fig. 2B)을 보이며, 0.5% 이내에서 MAP-2에 양 성(Fig. 2C)을 보였다. Neurofilament에 양성으로 염색되 는 세포의 70%이상은 세포돌기를 가지는 spindle cell의

형태이며 미성숙신경세포와 유사한 형태학적 소견을 보였 다(Fig. 2B). 나머지 30%의 세포들은 세포돌기를 가지지 않는 구형세포(round cell)로 특히 세포가 형성되는 집락 (colony)의 중심부위에서 대부분 관찰되었다(Fig. 2D).

MAP2에 양성인 세포는 대부분이 세포돌기를 가지는 세 포이며(Fig. 2C), GFAP에 양성인 세포는 비교적 긴 세포돌 기를 보였다(Fig. 2E).

RT-PCR(Fig. 3)로 확인한 결과 nestin mRNA는 배양 된 제대혈액 뿐만 아니라, 배양하기전의 신선제대 혈액 내에 서도 발현된다. 반면 MAP2는 배양된 혈액에서만 발현되어 신경으로 분화가 진행된 다음에 발현된 것으로 여겨진다.

고 찰

골수 모세포의 신경세포로의 분화 가능성이 제기된 이후 골수 모세포의 중추 신경계 질환의 치료목적으로의 이용에 대한 보고가 계속되고 있다. Mezey등17)은 골수에서 추출 한 세포들을 생쥐의 복강으로 주입 후 이들 세포가 뇌 조직 으로 이동하여 신경세포의 표지인자인 NeuN(neuronal nu- clear antigen)을 발현하는 것을 관찰하였고, Chen등4) 역시 골수세포를 중뇌동맥을 결찰하여 뇌경색을 만든 쥐의 경색부위에 BDNF(brain derived neurotrophic factor)와 함께 주입하여 이들 주입된 세포로부터 신경세포와 성상세 포의 표지인자가 발현되는 것을 관찰 할 수 있었고 아울러 신경학적 증상의 개선을 확인 할 수 있었다고 하였다. 또한 Li등12)은 뇌경색을 유발한 백서의 뇌조직에 사람의 골수세 포를 이식하여 이들 이식한 세포들 중 NeuN(1%), GFAP (5%)의 발현을 관찰하였다. Eglitis등9)도 골수세포를 mo- use의 뇌에 이식하였을 때 이들 이식세포로부터 소교세포 (microglia) 및 성상세포로 분화하는 양상을 보고하였다. 이 러한 보고는 비록 신경으로의 발현되는 세포수가 극히 일 부로 제한적임에도 불구하고 신경학적 증상을 개선시키는 등의 치료효과를 보이고 있어 많은 연구자들의 관심을 모 아왔다.

골수 모세포들 중에는 혈구세포의 생성을 담당하는 조혈 모세포 외에도 간엽조직을 생성하는 간질세포(marrow st- romal cell)가 존재하는 것으로 알려져 왔다. 최근의 연구 는 이들 간질세포들로부터 신경세포로의 분화를 증명하는 것에 많은 보고들이 집중되고 있다. 즉, 골수이식시 세포 분리법에 의해 조혈모세포가 분리되어 골수이식에 사용되 고 나머지 버려지는 세포들 중에 존재하는 이들 간질세포 를 연구하는 가운데 이들 세포들이 beta-mercaptoehanol 및 retinoic acid등으로 처리했을 때에 신경세포로 분화하

Fig. 3. Rt-PCR analyses of using nestin, and MAP2 primers. RNA was isolated from fresh adult blood, fresh cord blood, and cul- tured cord blood cells. β-actin serves as an internal control.

Fresh adult blood does not express any of the genes tested except β-actin. Nestin expression is seen in fresh cord blood and cultured cord blood at day 20. However, MAP2 is only seen in cultured cord blood at day 20. The data presented are representative of four independent experiments. MW STD, mo- lecular weight standard;FA, fresh adult blood;FC, fresh cord blood;CC, cultured cord blood.

FA FC CC FA FC CC FA FC CC

β-actin NESTIN MAP2

MW STD

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는 것이 시험관내에서 증명되어 최근의 연구는 골수 모세포 들 중 간질세포의 연구에 초점이 맞춰지고있는 실정이다23)24).

Kopen등11)은 간질세포를 신생 mouse(neonatal mouse) 의 대뇌에 주입했을 때 이들 세포가 성상세포로 분화하고 전 두엽에서부터 소뇌까지 이동하는 것을 관찰하였다. Chopp 6)은 간질세포를 척수손상쥐의 손상부위에 이식하였을 때 이들 세포로부터 신경세포로의 전환을 확인하였고 신경학 적 증상의 개선을 관찰하여 골수 간질세포의 치료적 이용 가능성에 대하여 제시하였다. Lu등14)은 간질세포를 외상성 뇌손상을 가한 백서의 꼬리정맥으로 주입하였을 때 이들 세포가 손상부위로 모여 신경세포로 재생되고 신경학적 증 상을 호전시킨다고 보고하였다. Chen등5)은 유사한 실험으 로 뇌졸중을 유발시킨 쥐의 꼬리정맥으로 간질세포를 주입 하여 이들 세포로부터 신경이 재생됨을 보고한 바 있다.

이와는 반대로 전신 방사선 조사로 골수를 완전히 파괴 시킨 실험쥐에 신경모세포를 정맥 주입시 이들 주입된 신 경모세포가 조혈모세포로 분화하여 혈액세포를 만들어낸다 는 보고는 모세포(stem cell)의 분화가 자기 고유조직으로 한정되지 않음을 보여주고 있다7). 본 연구에서도 제대혈액 내의 모세포를 시험관내에서 배양시키는 경우 일부의 세포 에서 신경으로의 분화가능성을 확인할 수 있었다. 이는 골 수 간질세포 뿐 만 아니라 제대혈액내의 모세포(stem cell) 로부터도 신경세포로 유도가 가능하다는 최초의 보고이다.

또한 골수모세포가 생후 왕성히 성장하는 중추신경계에 중 요한 역할을 할 것으로 판단되는 결과이기도 하다. 이는 골 수세포로부터 간세포(hepatocyte)로의 분화를 유도시킨 실험20)과 더불어 혈액내 모세포의 분화능력은 자기고유의 조직에 한정되지는 않는 것으로 사료된다.

본 실험에서는 nestin, neurofilament, GFAP 및 MAP- 222)와 같은 세포 구조단백질의 발현을 관찰할 수 있었다.

그러나 이들 구조단백질의 발현만으로는 복잡하고 다양한 기능을 가지고 있는 신경세포의 특징을 모두 대변 해줄 수 는 없다. 특히 Nestin의 경우 신경모세포의 비교적 특징적 인 표지자로 여겨져 왔으나 최근의 연구는 다른종류의 전 구세포(precursor cell)에서도 발현된다고 보고19)되고있으 므로, 신경세포의 표지자들이 발현된 세포들이 신경세포로 의 특징을 규명하기 위해서는 신경계 내에서 표현되는 것으 로 알려진 다양한 종류의 기능성 단백질 및 신경 전달물질 의 존재여부 규명이 필요할 것으로 사료된다. 아울러 신경 세포의 전기생리학적 특성이 이들 세포에서도 발현되는지 확인이 필요하다. 또한 1% 내외로 표현되는 이들 세포의 양을 늘리기 위한 적절한 배양조건을 찾아내는 노력이 요 구되며, 신경세포로 분화되는 모세포의 분획(subfraction)

을 확인하는 작업도 필요할 것으로 사료된다.

결 론

골수 모세포로부터 신경세포로의 분화 유도 및 신경모세 포로부터 혈구세포로의 분화가 가능하다. 이러한 보고에 기 초하여 본 연구자들은 제대혈모세포로부터 신경세포로의 시 험관내 분화를 유도하였다. 신경계 세포들의 표지자를 이 용하여 형광 면역염색 및 RT-PCR을 시행한 결과 신경 및 교세포 특이항원의 발현을 확인하였다. 제대혈모세포내에 신 경모세포의 존재가능성을 제시하는 결과로 향후 이들 세포 에대한 전기생리학적 특징 규명과 생체내 실험이 필요할것 으로 사료된다.

논문접수일:2001년 4월 27일

심사완료일:2001년 7월 2일

책임저자:하 윤

110-200 서울 종로구 소격동 165 국군 서울 지구병원 신경외과

전화:02) 397-3763, 전송:02) 397-3999 E-mail:ha_yoon@hotmail.com

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수치

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